Phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp l axit lactic định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao

Nghiên cứu phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp axit lactic nhằm tạo ra nhựa sinh học chất lượng cao, bền vững và thân thiện với môi trường.

• Tác giả: Nguyễn Thị Trang
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thanh Hảo
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân Lập Và Sàng Lọc Nấm Sinh Tổng Hợp L-Axit Lactic Để Tạo Nhựa Sinh Học Chất Lượng Cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về Axit lactic
• 2.1.1. Giới thiệu Axit lactic
• 2.1.2. Công thức cấu tạo Axit lactic
• 2.1.3. Tính chất Axit lactic
• 2.1.4. Ứng dụng và vai trò của axit lactic
• 2.2. Tổng quan về L- axit lactic
• 2.2.1. Khái niệm L- axit lactic
• 2.2.2. Tính chất L- axit lactic
• 2.2.3. Tổng hợp L- axit lactic từ vi sinh vật
• 2.2.4. Ứng dụng của L- axit lactic (LA)
• 2.3. Tổng quan về nấm mốc sinh L- axit lactic
• 2.3.1. Nấm Rhizopus oryzae
• 2.3.2. Vai trò và ứng dụng nấm mốc
• 2.4. Nhựa phân hủy sinh học polylactic acid (PLA)
• 2.5. Tình hình nghiên cứu nấm mốc sinh tổng hợp L- axit lactic trong và ngoài nước
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng nghiên cứu
• 3.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 3.5. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Thu thập mẫu nấm mốc từ các loại hoa
• 3.6.2. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh axit lactic
• 3.6.3. Xác định khả năng sinh axit lactic của các chủng nấm đã chọn
• 3.6.4. Lên men sinh axit lactic từ chủng nấm đã chọn
• 3.6.5. Xác định hàm lượng axit lactic bằng phương pháp đo quang phổ
• 3.6.6. Xác định các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của chủng nấm đã chọn
• 3.6.7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra
• 3.6.8. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra
• 3.6.9. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thu thập mẫu nấm mốc xung quanh Gia Lâm- Hà nội
• 4.2. Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng có khả năng sinh L- Axit lactic
• 4.3. Kết quả phân lập nấm mốc từ mẫu hoa quả
• 4.4. Kết quả tuyển chọn chủng nấm sinh L- Axit lactic
• 4.5. Kết quả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của 7 chủng nấm mốc đã chọn
• 4.5.1. Đặc điểm hình thái chủng TL
• 4.5.2. Đặc điểm hình thái chủng CR
• 4.5.3. Đặc điểm hình thái chủng HĐB
• 4.5.4. Đặc điểm hình thái chủng HĐB1
• 4.5.5. Đặc điểm hình thái chủng SS1
• 4.5.6. Đặc điểm hình thái chủng SS2
• 4.5.7. Đặc điểm hình thái chủng SS3
• 4.6. Khả năng sinh axit lactic của 7 chủng nấm mốc đã tuyển chọn
• 4.7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra
• 4.8. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra
• 4.9. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng L- axit lactic sinh ra
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nấm Sinh Tổng Hợp L Axit Lactic Giới Thiệu

Axit lactic (2-hydroxypropionic, CH3CHOHCOOH) là một axit hữu cơ quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như chất bảo quản, chất oxy hóa và hương liệu. Nghiên cứu về axit lactic ngày càng phổ biến do khả năng tạo ra axit polylactic (PLA), một nguyên liệu tiềm năng cho polyme phân hủy sinh học, góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. Axit lactic được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và hóa chất. Việc sản xuất axit lactic đang thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà nghiên cứu. Một trong những ứng dụng mới nổi của axit lactic là sử dụng nó để sản xuất polyme polylactate có thể phân hủy sinh học, cung cấp một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường cho nhựa phân hủy sinh học có nguồn gốc từ nguyên liệu hóa dầu. Với sự phát triển và thương mại hóa các chất ngoại sinh này, việc sử dụng axit lactic đã tăng lên đáng kể để trở thành trọng điểm hàng đầu của ngành công nghiệp quốc gia (Anh, 2018).

1.1. Công Thức Cấu Tạo và Tính Chất Của Axit Lactic

Axit lactic, còn gọi là axit cacboxylic 1-hydroxyethanol hoặc axit 2-hydroxypropanoic, có công thức phân tử C3H6O3 và công thức chung CH3-CHOH-COOH. Cấu trúc phân tử chứa cacbon bất đối xứng, tạo ra hai đồng phân quang học: D-axit lactic và L-axit lactic. Hai đồng phân này có tính chất hóa lý tương tự nhưng khác nhau về khả năng quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, dẫn đến tính chất sinh học khác biệt. Axit lactic là chất lỏng không màu hoặc vàng nhạt, không mùi (ở 15°C và 1 atm). Do tính hút ẩm cao, nó thường được sử dụng dưới dạng dung dịch đậm đặc tới 90% trọng lượng, hầu như không mùi và chứa một lượng đáng kể axit lactoyllactic và các đồng phân axit lactic khác.

1.2. Ứng Dụng Quan Trọng Của Axit Lactic Trong Công Nghiệp

Axit lactic có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong ngành mỹ phẩm, nó được sử dụng như một thành phần tự nhiên với các đặc tính kháng khuẩn, làm sáng và chăm sóc da, chủ yếu là chất dưỡng ẩm và điều chỉnh độ pH. Trong ngành thực phẩm, axit lactic và lactate được sử dụng rộng rãi như chất axit hóa và chất bảo quản. Một ứng dụng đang phát triển nhanh chóng là sử dụng axit lactic làm monome để sản xuất axit polylactic (PLA), một loại nhựa hàng hóa có thể phân hủy sinh học. PLA có nhiều ứng dụng, bao gồm quần áo bảo hộ, bao bì thực phẩm, chất phủ, túi đựng rác và thùng chứa cứng.

II. Thách Thức Từ Rác Thải Nhựa Giải Pháp Nhựa Sinh Học

Hiện nay, lượng rác thải nhựa đang gia tăng ở mức báo động trên toàn thế giới, bao gồm cả Việt Nam. Rác thải nhựa dùng một lần chưa qua xử lý gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống, sức khỏe con người và các loài sinh vật. Tính chất khó phân hủy của rác thải nhựa là một vấn đề nghiêm trọng, vì chúng tồn tại lâu dài trong môi trường đất, gây xói mòn và ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng và vật nuôi. Do đó, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu thân thiện với môi trường và các sản phẩm tự phân hủy đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu bởi các nhà nghiên cứu. L-axit lactic (LA) là một nguyên liệu thô quan trọng để sản xuất các polyme có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học, chẳng hạn như axit poly-lactic.

2.1. L Axit Lactic LA Nguyên Liệu Tạo Nhựa PLA Tiềm Năng

L-axit lactic (LA) là một axit hữu cơ phổ biến được sử dụng rộng rãi trong các ngành liên quan đến thực phẩm và có tiềm năng sản xuất các polyme polylactate có thể phân hủy sinh học. LA được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic và nấm. Loài nấm Rhizopus tạo ra LA dưới dạng đồng phân duy nhất của axit lactic và đã được công nhận là loài duy nhất có khả năng tạo ra đồng phân LA (Wu & cs.). Hiện nay, LA được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu như dầu mỏ, khí tự nhiên, than đá nhưng các nguồn nguyên liệu này đang dần cạn kiệt. Việc khai thác quá mức các nguồn khoáng sản thiên nhiên ảnh hưởng đến nguồn tài nguyên, dẫn đến các vấn đề ô nhiễm gây hại cho sức khỏe con người và các quần thể sinh vật trên cạn và dưới nước.

2.2. Nấm Mốc Sinh L Axit Lactic Giải Pháp Sản Xuất Bền Vững

Việc tìm ra nguồn nguyên liệu sản xuất LA thân thiện với môi trường từ vi sinh vật là điều cần thiết. Do đó, nghiên cứu về phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp L-axit lactic định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao là vô cùng quan trọng. Mục tiêu chính là phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic hiệu quả. Các nội dung nghiên cứu bao gồm phân lập và tuyển chọn nấm từ các nguồn khác nhau, sàng lọc nấm có khả năng sinh lactic cao, khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitrogen và pH đến khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic của các chủng nấm được tuyển chọn.

III. Phương Pháp Phân Lập Nấm L Axit Lactic Quy Trình Chi Tiết

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic (LA) từ các mẫu thu thập được từ hoa quả hỏng. Quá trình bao gồm thu thập mẫu nấm mốc, phân lập và tuyển chọn các chủng có khả năng sinh axit lactic, xác định khả năng sinh axit lactic của các chủng đã chọn, lên men sinh axit lactic từ chủng nấm đã chọn, xác định hàm lượng axit lactic bằng phương pháp đo quang phổ và xác định các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của chủng nấm đã chọn. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp LA như nguồn cacbon, nguồn nitrogen và pH cũng được nghiên cứu.

3.1. Thu Thập và Phân Lập Nấm Mốc Từ Mẫu Hoa Quả Tự Nhiên

Quá trình bắt đầu bằng việc thu thập mẫu nấm mốc từ các loại hoa quả hỏng. Sau đó, các mẫu được phân lập và tuyển chọn để tìm ra các chủng nấm có khả năng sinh axit lactic. Việc phân lập được thực hiện bằng các kỹ thuật vi sinh vật học tiêu chuẩn, đảm bảo thu được các chủng nấm thuần khiết. Các chủng nấm này sau đó được đánh giá khả năng sinh axit lactic thông qua các thí nghiệm sàng lọc.

3.2. Xác Định Đặc Điểm Hình Thái và Sinh Học Của Chủng Nấm

Sau khi tuyển chọn được các chủng nấm có khả năng sinh axit lactic, các đặc điểm hình thái và sinh học của chúng được xác định. Điều này bao gồm quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm dưới kính hiển vi và các đặc tính sinh lý khác. Việc xác định này giúp phân loại và so sánh các chủng nấm khác nhau, từ đó chọn ra các chủng có tiềm năng sinh tổng hợp LA cao nhất.

3.3. Lên Men và Đo Hàm Lượng Axit Lactic Bằng Phương Pháp Đo Quang

Các chủng nấm đã chọn được sử dụng để lên men sinh axit lactic. Quá trình lên men được thực hiện trong điều kiện kiểm soát để tối ưu hóa sự sinh trưởng của nấm và sản xuất LA. Hàm lượng axit lactic sinh ra được xác định bằng phương pháp đo quang phổ, một kỹ thuật chính xác và hiệu quả để định lượng các chất hóa học trong dung dịch. Kết quả đo quang phổ được sử dụng để đánh giá khả năng sinh LA của các chủng nấm khác nhau.

IV. Ảnh Hưởng Của Yếu Tố Môi Trường Đến Sinh Tổng Hợp LA

Nghiên cứu này cũng tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như nguồn cacbon, nguồn nitrogen và pH đến khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic của các chủng nấm đã chọn. Các thí nghiệm được thiết kế để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp LA, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất nhựa sinh học.

4.1. Tối Ưu Hóa Nguồn Cacbon Cho Quá Trình Sinh Tổng Hợp LA

Nguồn cacbon là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp LA. Các thí nghiệm được thực hiện với các nguồn cacbon khác nhau để xác định nguồn nào là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nấm và sản xuất LA. Kết quả cho thấy saccharose là nguồn cacbon thích hợp nhất để 2 chủng SS2 và SS3 sinh tổng hợp LA.

4.2. Ảnh Hưởng Của Nguồn Nitrogen Đến Hàm Lượng L Axit Lactic

Nguồn nitrogen cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp LA. Các thí nghiệm được thực hiện với các nguồn nitrogen khác nhau để xác định nguồn nào mang lại hiệu quả cao nhất. Trong môi trường nuôi cấy chứa yeast extract, lượng LA sinh ra là cao nhất với nồng độ là 26,59 mg/l và 14,05 mg/l tương ứng với 2 chủng SS2 và SS3.

4.3. Điều Chỉnh pH Để Tối Đa Hóa Sản Lượng L Axit Lactic

pH của môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp LA. Các thí nghiệm được thực hiện ở các giá trị pH khác nhau để xác định điều kiện tối ưu. Vào ngày nuôi cấy thứ 5, ở giá trị pH=3, chủng SS2 có khả năng sinh tổng hợp LA cao nhất, tuy nhiên đối với chủng SS3, pH=5 là điều kiện thích hợp nhất để lượng LA sinh ra đạt cực đại.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Chủng Nấm Tiềm Năng và Điều Kiện Tối Ưu

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập và tuyển chọn được 7 chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp LA, bao gồm SS1, SS2, SS3, TL, CR, HĐB và HĐB1. Trong đó, chủng SS2 và SS3 có khả năng sinh tổng hợp LA cao nhất. Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon, nguồn nitrogen và pH đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp LA của hai chủng này.

5.1. Chủng Nấm SS2 và SS3 Ứng Viên Sáng Giá Cho Sản Xuất PLA

Chủng SS2 và SS3 được xác định là hai chủng nấm có tiềm năng lớn trong sản xuất L-axit lactic, một nguyên liệu quan trọng để sản xuất nhựa PLA. Với khả năng sinh tổng hợp LA cao và điều kiện nuôi cấy tối ưu đã được xác định, hai chủng này có thể được sử dụng để phát triển quy trình sản xuất PLA hiệu quả và bền vững.

5.2. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Vào Sản Xuất Nhựa Sinh Học

Kết quả nghiên cứu này có thể được ứng dụng vào sản xuất nhựa sinh học từ L-axit lactic. Việc sử dụng các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp LA cao và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp giảm chi phí sản xuất và tăng tính cạnh tranh của nhựa sinh học so với nhựa truyền thống. Điều này góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và thúc đẩy phát triển bền vững.

VI. Kết Luận và Kiến Nghị Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Tiếp Theo

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic, đồng thời xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này. Kết quả này mở ra triển vọng ứng dụng trong sản xuất nhựa sinh học. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu quả sản xuất.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Lên Men và Chiết Xuất L Axit Lactic

Để nâng cao hiệu quả sản xuất L-axit lactic, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình lên men và chiết xuất LA. Điều này bao gồm việc điều chỉnh các thông số như nhiệt độ, thời gian lên men, nồng độ chất dinh dưỡng và phương pháp chiết xuất LA. Việc tối ưu hóa quy trình sẽ giúp tăng sản lượng LA và giảm chi phí sản xuất.

6.2. Nghiên Cứu Ứng Dụng Nhựa Sinh Học Trong Các Lĩnh Vực Khác Nhau

Cần có thêm các nghiên cứu về ứng dụng của nhựa sinh học trong các lĩnh vực khác nhau, như bao bì thực phẩm, y tế và nông nghiệp. Việc mở rộng ứng dụng sẽ giúp tăng nhu cầu sử dụng nhựa sinh học và thúc đẩy phát triển ngành công nghiệp này. Đồng thời, cần có các chính sách hỗ trợ và khuyến khích sử dụng nhựa sinh học để giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng nhanh chóng của lượng rác thải nhựa tổng hợp có nguồn gốc hóa dầu đang tạo ra những tác động tiêu cực đến môi trường đất, nước và sức khỏe sinh vật do đặc tính khó phân hủy sinh học tự nhiên. Trong bối cảnh các nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn kiệt và gây ô nhiễm, việc phát triển các dòng vật liệu xanh có khả năng tự phân hủy như axit polylactic (PLA) trở thành hướng đi tất yếu. L-axit lactic (LA, axit (S)-2-hydroxypropanoic) là khối cấu trúc monome quan trọng để tổng hợp nên polyme sinh học PLA có trọng lượng phân tử cao và đặc tính cơ lý phù hợp cho ứng dụng bao bì, y tế và tiêu dùng.

Mặc dù vi khuẩn lactic (LAB) có khả năng sinh tổng hợp axit lactic cao, quy trình thu hồi và tinh sạch dịch lên men vi khuẩn thường phức tạp, tốn kém chi phí ly tâm hoặc vi lọc. Ngược lại, nấm sợi (đặc biệt là các đại diện thuộc chi Rhizopus) sở hữu ưu thế vượt trội nhờ khả năng chỉ sinh tổng hợp duy nhất đồng phân quang học L-axit lactic, sinh khối dạng sợi dễ dàng tách khỏi dịch cấy bằng phương pháp lọc thô thông thường, đồng thời có thể sử dụng các nguồn cacbon và muối amoniac vô cơ rẻ tiền. Nhằm khai thác nguồn vi sinh vật bản địa phục vụ sản xuất nguyên liệu nhựa sinh học, đề tài "Phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp L- axit lactic định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao" đã được thực hiện.

Mục tiêu chung của nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn được các chủng nấm mốc từ nguồn tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic hiệu quả. Để đạt được mục tiêu này, 5 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định bao gồm:

1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc thu thập từ các mẫu hoa quả hư hỏng (thanh long, cà rốt, su su, hoa đậu biếc, bí ngô, quả bơ).
2. Sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh axit lactic cao trong môi trường lên men tăng sinh khối lỏng.
3. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic của các chủng nấm đã tuyển chọn.
4. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau đến khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic của các chủng nấm đã tuyển chọn.
5. Khảo sát ảnh hưởng của các giá trị pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic của các chủng nấm đã tuyển chọn.

Đối tượng nghiên cứu là các chủng nấm mốc phân lập từ các mẫu hoa quả bị thối hỏng tự nhiên thu thập xung quanh khu vực huyện Gia Lâm, Hà Nội. Địa điểm thực hiện các nội dung thực nghiệm tại Phòng Công nghệ sinh học Tái tạo Môi trường – Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thời gian triển khai nghiên cứu kéo dài từ tháng 08/2022 đến tháng 02/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Axit lactic ($C_3H_6O_3$, khối lượng phân tử 98,08 g/mol) có nguyên tử cacbon bất đối xứng, tồn tại dưới hai dạng đồng phân quang học là D-axit lactic và L-axit lactic. Để sản xuất polyme sinh học poly-L-lactide (PLLA) có độ bền nhiệt và tính chất cơ lý cao, monome L-axit lactic cần đạt độ tinh khiết quang học cao ($\ge 95,5%$ w/w). Axit polylactic (PLA, $(C_3H_4O_2)_n$) là một polyester béo mạch thẳng có khả năng phân hủy sinh học dưới tác động của vi sinh vật môi trường thành $CO_2$, nước và mùn hữu cơ.

Chỉ tiêu nhiệt động học	Dạng D-axit lactic	Dạng L-axit lactic	Hỗn hợp raxemic (DL)
Mật độ ở $20^\circ\text{C}$ (g/l)	1,249	1,249	1,249
Điểm nóng chảy ($^\circ\text{C}$)	52,8	53,0	16,8
Điểm sôi ($^\circ\text{C}$)	103 (ở 15 mmHg)	204,2 (tính toán)	82,0 (ở 0,5 mmHg); 122,0 (ở 15 mmHg)
Hằng số phân ly $pK_a$ ($25^\circ\text{C}$)	3,83	3,79	-
Nhiệt dung ($20^\circ\text{C}$, $\text{J/mol}\cdot^\circ\text{C}$)	3,83	3,79	-
Nhiệt dung dịch ($25^\circ\text{C}$, $\text{kJ/mol}$)	-	7,79	-
Nhiệt phản ứng tổng hợp ($\text{kJ/mol}$)	-	16,86	11,33

Về mặt vi sinh vật học, nấm mốc thuộc chi Rhizopus (họ Mucoraceae, bộ Mucorales, ngành Zygomycota), điển hình là loài Rhizopus oryzae, có hệ enzym chuyển hóa đường thành L-axit lactic trong điều kiện lên men hiếu khí/bán hiếu khí.

Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp thu mẫu và phân lập: Các mẫu hoa quả mốc tự nhiên được thu thập trong túi kín vô trùng. Mẫu được cấy chấm điểm trực tiếp trên môi trường thạch PDA (Potato Dextrose Agar) bổ sung $1%$ kháng sinh, $0,3%\text{ CaCO}_3$ và dịch chiết hoa đậu biếc đóng vai trò chất chỉ thị pH tự nhiên. Quá trình ủ diễn ra ở $30^\circ\text{C}$ trong 3–4 ngày.
• Phương pháp sàng lọc định tính: Đánh giá hoạt tính sinh axit dựa trên hai chỉ tiêu: khả năng tạo vòng phân giải làm tan hạt $CaCO_3$ không tan và khả năng làm chuyển màu chỉ thị dịch chiết hoa đậu biếc sang màu hồng (chỉ thị môi trường axit).
• Phương pháp giữ giống: Thực hiện theo quy trình của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2007) trên ống thạch nghiêng PDA bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ và bảo quản sâu trong dung dịch glycerol $30%$ ở nhiệt độ $-80^\circ\text{C}$.
• Phương pháp lên men chìm: Nuôi cấy nấm trong bình tam giác 250 ml chứa 50–100 ml môi trường dịch thể ở $30^\circ\text{C}$, lắc 130 vòng/phút trong 3–5 ngày. Thành phần môi trường cơ bản (g/l): Saccharose (60), $(NH_4)_2SO_4$ (1,35), $MgSO_4\cdot 7H_2O$ (0,04), $KH_2PO_4$ (0,3), pH ban đầu 6,5.
• Phương pháp định lượng axit lactic: Sử dụng phương pháp đo quang phổ tạo phức màu với thuốc thử $FeCl_3\cdot 6H_2O\ 0,2%$ ở bước sóng 390 nm (theo Borshchevskaya & cs.). Phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính xác định trong khoảng $0 - 6,25\text{ g/l}$ là: $$Y = 0,0825x - 0,0015 \quad (R^2 = 0,9996)$$
• Phương pháp quan sát hình thái học: Ghi nhận màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, đường kính tản nấm trên đĩa PDA và quan sát cấu trúc vi học (sợi nấm, cuống sinh bào tử, túi bào tử, bào tử đính/bào tử bọc) dưới kính hiển vi quang học.
• Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy:
  • Khảo sát nguồn cacbon (nồng độ 60 g/l): Saccharose (đối chứng), Glucose, D-Maltose, D-Xylose, Lactose, Tinh bột tan.
  • Khảo sát nguồn nitrogen (nồng độ 1,35 g/l): $(NH_4)_2SO_4$ (đối chứng), $NH_4NO_3$, $NH_4Cl$, Yeast extract (cao nấm men).
  • Khảo sát dải pH ban đầu: 4, 5, 6, 7, 8, 9.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu sinh học thay thế nhựa hóa dầu khó phân hủy. Khái quát vai trò của L-axit lactic và tiềm năng của nấm mốc trong việc sản xuất đồng phân này. Từ đó, xác định rõ mục đích nghiên cứu, đối tượng và 5 nội dung thực nghiệm cụ thể.

Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

• Trình bày công thức phân tử ($C_3H_6O_3$), công thức cấu tạo, tính chất nhiệt động học của hai dạng đồng phân quang học axit lactic và vai trò của chúng trong ngành thực phẩm, mỹ phẩm, y tế.
• Khái quát cấu trúc, tính chất của polyme sinh học PLA ($(C_3H_4O_2)_n$) và quá trình phân hủy sinh học tạo $CO_2$, $H_2O$ và sinh khối.
• Phân tích đặc điểm sinh học, phân loại học của nấm sợi Rhizopus oryzae, ưu thế sinh tổng hợp monome L-axit lactic đồng nhất so với vi khuẩn lên men lactic.
• Điểm qua tình hình nghiên cứu: công trình của Domínguez & Vázquez (1999), Kurniawati & cs. (2014) và nghiên cứu của Nguyễn Quốc Việt & cs. (2015) tại Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam sử dụng gen Lactate Dehydrogenase (LDH) sàng lọc chủng R. oryzae VLSH-LA01 đạt trên 62 g/l axit lactic.

Vật liệu và phương pháp

Trình bày chi tiết địa điểm nghiên cứu (Viện Công nghệ sinh học), đối tượng thu mẫu tại Gia Lâm, danh mục hóa chất, thiết bị và công thức các môi trường dinh dưỡng (PDA, môi trường lên men tăng sinh). Mô tả tường tận các bước thao tác: thu mẫu hoa quả, phân lập thuần khiết, thử nghiệm định tính với CaCO3 và chỉ thị hoa đậu biếc, giữ giống vi sinh, quy trình lên men lắc, phương pháp dựng đường chuẩn đo quang với FeCl3 ở bước sóng 390 nm và các bố trí thí nghiệm đơn yếu tố (nguồn C, nguồn N, pH).

Kết quả và thảo luận

Chương thực nghiệm trình bày toàn bộ số liệu thu được qua các giai đoạn nghiên cứu:

1. Kết quả phân lập và tuyển chọn sơ bộ

Từ 6 loại mẫu quả hư hỏng thu thập được tại Gia Lâm, tác giả đã phân lập được 20 chủng nấm mốc thuần khiết:

STT	Loại mẫu quả	Số chủng phân lập	Ký hiệu chủng
1	Hoa đậu biếc	5	HĐB, HĐB1, HĐB2, HĐB3, HĐB4
2	Thanh long	2	TL, TL1
3	Su su	5	SS1, SS2, SS3, SS4, SS5
4	Cà rốt	3	CR, CR1, CR2
5	Bí ngô	4	BNG1, BNG2, BNG3, BNG4
6	Quả bơ	1	MB

Khi cấy trên môi trường PDA có $0,3%\text{ CaCO}_3$ và dịch chiết hoa đậu biếc, 7 chủng thể hiện khả năng tạo axit (hòa tan $CaCO_3$ và chuyển màu môi trường sang hồng/đỏ):

Chủng	Khả năng hòa tan $\text{CaCO}_3$	Mức độ đổi màu chỉ thị hoa đậu biếc
CR	Kém (hầu như không hòa tan)	Đổi màu rõ rệt sang hồng
TL	Tốt	Đổi màu nhẹ (gần như không đổi)
HĐB1	Trung bình	Đổi màu sang hồng nhạt hơn CR
HĐB	Tốt	Đổi màu sang hồng nhạt
SS1	Tốt	Đổi màu sang hồng nhạt
SS2	Tốt	Đổi màu sang hồng đậm hơn SS1 và HĐB
SS3	Tốt	Đổi màu sang hồng rõ rệt

2. Đặc điểm hình thái học của 7 chủng nấm tuyển chọn

• Chủng TL: Khuẩn ty khí sinh chuyển từ trắng sang nâu đen; sợi nấm dạng ống rỗng (sau 12 giờ); cuống sinh bào tử hình thành sau 20 giờ; túi bào tử mang chùm bào tử đính; bào tử nhỏ hình tròn.
• Chủng CR: Khuẩn ty mặt trên chuyển dần sang nâu, mặt sau trắng bông, tản nấm chia thùy; cuống sinh bào tử hình trụ tròn đầu hình thành sau 24 giờ; túi bào tử hình cầu gai bao quanh cuống.
• Chủng HĐB: Khuẩn ty mọc vòng tròn đồng tâm, chuyển màu nâu đen; cuống sinh bào tử xuất hiện sau 24 giờ; túi bào tử đính kết chuỗi hình ngôi sao đặc trưng; bào tử tròn nhỏ.
• Chủng HĐB1: Khuẩn ty dày màu nâu đậm; cuống bào tử đầu tròn hình thành sau 24 giờ; túi bào tử tròn bao bọc cuống; bào tử hình tròn hoặc elip không vách ngăn.
• Chủng SS1: Khuẩn ty mọc kín đĩa sau 5–6 ngày, chuyển sang màu nâu đen; sợi nấm không phân nhánh; túi bào tử dạng bào tử bọc; bào tử nhỏ hình tròn hoặc elip.
• Chủng SS2: Khuẩn ty ban đầu màu vàng nhạt, sau chuyển đen, mặt sau vàng nhạt; cuống sinh bào tử hình thành sau 24 giờ; túi bào tử đính kết thành chùm dạng bông; bào tử hình tròn/elip.
• Chủng SS3: Khuẩn ty bông dày chuyển sang nâu sẫm/nâu đen; sợi nấm không phân nhánh; túi bào tử bọc hình tròn quanh cuống; bào tử hình bầu dục hoặc elip.

Quan sát hình thái cho thấy các chủng TL, CR, SS2 mang đặc điểm tương tự chi Aspergillus; các chủng HĐB1, SS1, SS3 mang đặc điểm bào tử bọc tương tự chi Rhizopus; chủng HĐB có cấu trúc túi bào tử chùm hình ngôi sao đặc biệt.

3. Khả năng sinh tổng hợp L-axit lactic của 7 chủng trong 3 ngày lên men

Kết quả định lượng quang phổ cho thấy:

• Chủng SS3 có sản lượng LA cao nhất và tăng dần liên tục qua 3 ngày nuôi cấy: ngày 1 đạt 14 mg/l, ngày 2 đạt 25 mg/l và ngày 3 đạt 42 mg/l.
• Chủng SS2 đạt sản lượng cao ở những ngày đầu: ngày 1 đạt 15 mg/l, ngày 2 đạt 13 mg/l, sau đó giảm dần.
• Các chủng còn lại: SS1, CR, HĐB1 đạt đỉnh ở ngày thứ 2 rồi giảm mạnh ở ngày thứ 3; HĐB duy trì nồng độ ổn định nhưng thấp; TL giảm dần từ 12 mg/l xuống 7 mg/l ở ngày thứ 3.
• Hai chủng SS2 và SS3 được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm khảo sát yếu tố môi trường tiếp theo.

4. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường đến chủng SS2 và SS3

Yếu tố khảo sát	Biến số	Đáp ứng của chủng SS2	Đáp ứng của chủng SS3
Nguồn Cacbon (60 g/l)	Saccharose, Glucose, D-Maltose, D-Xylose, Lactose, Tinh bột	Saccharose cho nồng độ LA cao nhất (18,42 mg/l ở ngày 1), giảm dần và ổn định ở ngày 4–5. Với D-Xylose, LA đạt đỉnh ngày 2 và biến mất ở ngày 5.	Saccharose cho nồng độ LA cao nhất (14,16 mg/l ở ngày 3). Với D-Maltose, nồng độ LA tăng dần đạt đỉnh ở ngày 5 (13,13 mg/l).
Nguồn Nitrogen (1,35 g/l)	$(NH_4)_2SO_4$, $NH_4NO_3$, $NH_4Cl$, Yeast extract	Yeast extract cho năng suất cao nhất, nồng độ tăng liên tục và đạt cực đại vào ngày thứ 5 (26,59 mg/l). Các muối amoni vô cơ cho sản lượng thấp (với $NH_4Cl$ ngày 5 chỉ đạt 1,39 mg/l).	Yeast extract cho nồng độ LA cao nhất vào ngày thứ nhất (14,05 mg/l), sau đó giảm dần. Các nguồn $(NH_4)_2SO_4$, $NH_4NO_3$ cho nồng độ thấp hơn.
Giá trị pH ban đầu	4, 5, 6, 7, 8, 9	pH = 8 là tối ưu nhất; nồng độ LA tăng vọt từ ngày 2 và đạt cực đại vào ngày thứ 5 (29,54 mg/l). pH = 9 ức chế mạnh sinh tổng hợp (ngày 5 chỉ đạt 0,76 mg/l).	pH = 5 là tối ưu nhất; nồng độ LA tăng đều và đạt cực đại vào ngày thứ 5 (22,00 mg/l). Khoảng pH từ 5 đến 7 đều cho khả năng sinh tổng hợp tốt ở ngày 5.

Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các thành tựu đạt được trong việc phân lập, sàng lọc, phân tích hình thái và xác định các thông số môi trường thích hợp cho hai chủng nấm mốc SS2 và SS3; đồng thời đề xuất các hướng nghiên cứu mở rộng tiếp theo.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Phân lập thành công 20 chủng nấm mốc từ 6 loại hoa quả hư hỏng thu thập tại Gia Lâm, Hà Nội.
• Tuyển chọn được 7 chủng nấm có hoạt tính sinh axit lactic rõ rệt qua thử nghiệm hòa tan $CaCO_3$ và chuyển màu dịch chiết hoa đậu biếc (SS1, SS2, SS3, TL, CR, HĐB, HĐB1).
• Xác định 2 chủng triển vọng nhất là SS2 và SS3:
  • Chủng SS2 đạt hàm lượng L-axit lactic cực đại là 29,54 mg/l khi nuôi cấy ở điều kiện pH = 8 tại ngày thứ 5, và đạt 26,59 mg/l khi sử dụng nguồn nitrogen là cao nấm men (Yeast extract). Nguồn cacbon tối ưu là Saccharose (đạt 18,42 mg/l).
  • Chủng SS3 đạt hàm lượng L-axit lactic 42,00 mg/l ở ngày thứ 3 trong môi trường sàng lọc ban đầu; trong các thí nghiệm đơn yếu tố, chủng đạt cực đại 22,00 mg/l ở pH = 5 vào ngày thứ 5, 14,16 mg/l với nguồn cacbon Saccharose và 14,05 mg/l với nguồn nitrogen Yeast extract.

Giải pháp và kiến nghị môi trường nuôi cấy

Từ các kết quả thực nghiệm đơn yếu tố, tác giả đề xuất công thức môi trường thích hợp để sinh tổng hợp L-axit lactic từ hai chủng nấm tuyển chọn gồm:

• Saccharose: 60 g/l
• Yeast extract: 1,35 g/l
• $KH_2PO_4$: 0,30 g/l
• $MgSO_4\cdot 7H_2O$: 0,04 g/l
• Điều chỉnh pH ban đầu: pH = 8 đối với chủng SS2 và pH = 5 đối với chủng SS3.

Đóng góp khoa học tự nêu

• Bổ sung dữ liệu về nguồn vi nấm bản địa tại Việt Nam có tiềm năng sinh tổng hợp L-axit lactic từ nguồn cơ chất phế phụ phẩm hoa quả.
• Áp dụng thành công phương pháp sử dụng dịch chiết hoa đậu biếc làm chất chỉ thị màu tự nhiên kết hợp với thạch canxi cacbonat, tạo giải pháp sàng lọc nhanh định tính vi sinh vật sinh axit hữu cơ có chi phí thấp và an toàn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Khóa luận mới dừng lại ở việc định danh sơ bộ 7 chủng nấm dựa trên đặc điểm hình thái tản nấm và cấu trúc cơ quan sinh sản vi học, chưa tiến hành phân tích trình tự phân tử (như giải trình tự vùng gen rDNA ITS) để xác định chính xác tên loài khoa học của chủng SS2 và SS3.
• Chưa thực hiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có gắn cột chiral để kiểm chứng tuyệt đối tỷ lệ đồng phân L-axit lactic so với D-axit lactic trong dịch lên men.
• Thời gian khảo sát động thái lên men tối ưu chỉ giới hạn trong chu kỳ 5 ngày.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Mở rộng thời gian khảo sát quá trình lên men sinh tổng hợp L-axit lactic dài ngày hơn để xác định chính xác thời điểm tích lũy nồng độ sản phẩm cực đại và chu kỳ thoái hóa của nấm.
2. Ứng dụng phương pháp phân tích HPLC để kiểm tra độ tinh khiết quang học của sản phẩm dịch lên men, chứng minh khả năng chỉ tạo duy nhất đồng phân L-axit lactic của chủng nấm.
3. Thực hiện giải trình tự gen sinh học phân tử để định danh chính xác loài cho 2 chủng nấm tiềm năng SS2 và SS3.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng, Kỹ thuật Lên men và Công nghệ Môi trường.

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng trực tiếp bao gồm:

• Quy trình sàng lọc định tính vi sinh vật sinh axit hữu cơ sử dụng chỉ thị tự nhiên dịch chiết hoa đậu biếc và $CaCO_3$.
• Phương pháp xây dựng đường chuẩn và định lượng axit lactic bằng kỹ thuật đo quang phổ tạo phức sắt(III) clorua ($FeCl_3\ 0,2%$) ở bước sóng 390 nm không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
• Dữ liệu đối chiếu về ảnh hưởng của các nguồn cacbon (mono-, di-, polysacarit), nguồn nitrogen vô cơ/hữu cơ và dải pH lên khả năng sinh tổng hợp axit của các chủng nấm sợi.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao tác giả sử dụng dịch chiết hoa đậu biếc thay cho các chất chỉ thị pH hóa học thông thường khi tuyển chọn nấm?

Dịch chiết hoa đậu biếc chứa sắc tố tự nhiên có dải chuyển màu nhạy theo pH môi trường (chuyển sang màu hồng/đỏ khi môi trường chuyển sang tính axit). Phương pháp này dễ chuẩn bị, thân thiện với môi trường, cho độ chính xác cao và tiết kiệm đáng kể chi phí so với các chất chỉ thị hóa học tổng hợp như Phenolphthalein hay Sulphonphthalein.

2. Phương pháp định lượng axit lactic trong nghiên cứu được tiến hành theo nguyên lý nào và có khoảng tuyến tính ra sao?

Nghiên cứu sử dụng phương pháp đo quang phổ dựa trên phản ứng tạo phức màu giữa axit lactic và dung dịch $FeCl_3\cdot 6H_2O\ 0,2%$, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng $\lambda = 390\text{ nm}$. Khoảng tuyến tính của phương pháp được xác lập từ 0 đến $6,25\text{ g/l}$ với phương trình hồi quy $Y = 0,0825x - 0,0015$ và hệ số tương quan $R^2 = 0,9996$.

3. Hai chủng nấm mốc có hoạt tính sinh axit lactic cao nhất được phân lập từ nguồn mẫu nào và có đặc điểm hình thái ra sao?

Hai chủng đạt hiệu suất cao nhất là SS2 và SS3, đều được phân lập từ mẫu quả su su hư hỏng tại Gia Lâm, Hà Nội. Về mặt hình thái vi học, chủng SS2 có khuẩn ty chuyển từ vàng nhạt sang đen, túi bào tử đính kết chùm dạng bông giống chi Aspergillus; trong khi chủng SS3 có khuẩn ty màu nâu đen, cuống sinh bào tử mang túi bào tử bọc hình tròn giống đặc điểm chi Rhizopus.

4. Điều kiện môi trường dinh dưỡng và pH tối ưu cho hai chủng SS2 và SS3 có điểm gì khác nhau?

Cả hai chủng đều sinh tổng hợp L-axit lactic tốt nhất với nguồn cacbon là Saccharose ($60\text{ g/l}$) và nguồn nitrogen là Yeast extract ($1,35\text{ g/l}$). Tuy nhiên, về điều kiện pH nuôi cấy: chủng SS2 thích hợp với môi trường kiềm nhẹ (pH = 8) cho nồng độ cực đại $29,54\text{ mg/l}$ ở ngày thứ 5; trong khi chủng SS3 lại sinh tổng hợp tối ưu ở môi trường axit nhẹ (pH = 5) cho nồng độ cực đại $22,00\text{ mg/l}$ ở ngày thứ 5.

5. Tại sao nấm mốc chi Rhizopus được xem là đối tượng triển vọng hơn vi khuẩn lactic trong sản xuất nhựa PLA?

Nấm Rhizopus có khả năng chuyển hóa đường thành duy nhất một đồng phân quang học là L-axit lactic (thay vì tạo hỗn hợp raxemic D/L), sinh khối dạng sợi nấm kích thước lớn giúp tách lọc thô đơn giản khỏi dịch lên men, và có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ rẻ tiền, từ đó giúp giảm chi phí sản xuất và tinh sạch monome cho quá trình trùng hợp nhựa PLA.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Trang đã phân lập thành công 20 chủng nấm mốc từ hoa quả hư hỏng và sàng lọc được 7 chủng có khả năng sinh tổng hợp axit lactic bằng phương pháp chỉ thị tự nhiên. Trong đó, hai chủng SS2 và SS3 phân lập từ quả su su thể hiện hoạt tính sinh tổng hợp L-axit lactic vượt trội. Nghiên cứu đã xác lập được các điều kiện nuôi cấy tối ưu đơn yếu tố về nguồn cacbon (saccharose), nguồn nitrogen (cao nấm men) và pH môi trường (pH 8 cho SS2, pH 5 cho SS3), làm tiền đề thực nghiệm cho các nghiên cứu định danh phân tử và tối ưu hóa công nghệ lên men tạo monome sản xuất nhựa sinh học PLA.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, lượng rác thải nhựa đang dần gia tăng ở mức báo động. Lượng rác thải nhựa dùng một lần chưa qua xử lý, chuyển hóa có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống, sức khỏe con người và các loài sinh vật khác. Điều nguy hiểm nhất của rác thải nhựa là tính chất khó phân hủy, tồn tại lâu dài trong môi trường đất. Ngay cả khi bị chôn vùi trong bùn, đất chúng vẫn tồn tại hàng trăm nghìn năm, làm thay đổi tính chất vật lý của đất, gây xói mòn đất, làm cho đất không giữ được nước và chất dinh dưỡng, ngăn cản oxy đi qua đất, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng, cản trở sự sinh trưởng và phát triển của vật nuôi và cây trồng,.

Các sản phẩm từ nhựa khó biến mất hoàn toàn trong đời sống bởi những tác dụng tiện lợi của chúng nên việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu thân thiện với môi trường, các sản phẩm tự phân hủy đang là vấn đề được quan tâm nhiều bởi các nhà nghiên cứu hàng đầu hiện nay. L- axit lactic (LA) là một nguyên liệu thô quan trọng để sản xuất các polyme có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học, chẳng hạn như axit poly-lactic. LA là một axit hữu cơ phổ biến được sử dụng rộng rãi trong các ngành liên quan đến thực phẩm và có tiềm năng sản xuất các polyme polylactate có thể phân hủy sinh học. LA được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic và nấm.

Loài nấm Rhizopus tạo ra LA dưới dạng đồng phân duy nhất của axit lactic và đã được công nhận là loài duy nhất có khả năng tạo ra đồng phân LA (Wu & cs. Hiện nay, LA được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu như dầu mỏ, khí tự nhiên, than đá nhưng các nguồn nguyên liệu này đang dần cạn kiệt. Việc khai thác quá mức các nguồn khoáng sản thiên nhiên ảnh hưởng đến nguồn tài nguyên, dẫn đến các vấn đề ô nhiễm gây hại cho sức khỏe con người và các quần thể sinh vật trên cạn và dưới nước. Vì vậy, việc tìm ra nguồn nguyên liệu sản xuất LA thân thiện với môi trường từ vi sinh vật là điều cần thiết.

Do đó, tôi đã tiến hành nghiên 1 cứu đề tài “ Phân lập và sàng lọc nấm sinh tổng hợp L- axit lactic định hướng tạo nhựa sinh học chất lượng cao.”  Mục đích nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp L- axit lactic.  Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn nấm thu thập từ thanh long, cà rốt, su su,. - Sàng lọc nấm có khả năng sinh lactic cao trong môi trường lên men tăng sinh khối của các chủng nấm đã tuyển chọn. - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp L- axit lactic của các chủng nấm được tuyển chọn.

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp L- axit lactic của các chủng nấm được tuyển chọn. - Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp L- axit lactic của các chủng nấm được tuyển chọn. 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan về Axit lactic Giới thiệu Axit lactic Axit lactic (2-hydroxypropionic, CH3CHOHCOOH) là một axit hữu cơ có giá trị vì nó được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và các sản phẩm liên quan đến thực phẩm, được sử dụng như chất bảo quản, chất oxy hóa và hương liệu. Các nghiên cứu về axit lactic ngày nay trở nên phổ biến với chiến dịch xanh, khả năng tạo ra axit polylactic (PLA) có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất polyme phân hủy sinh học, bao gồm nhựa phân hủy sinh học để giải quyết một trong những nguyên nhân nóng lên toàn cầu (Wu & cs.

Axit hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và hóa chất. Việc sản xuất axit lactic hiện đang thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hiện nay. Một nghiên cứu được thành lập vào năm 1995 cho biết 85% axit lactic được sản xuất tại Hoa Kỳ được sử dụng trong thực phẩm và các ứng dụng liên quan đến thực phẩm. Một trong những ứng dụng mới nổi nhất của axit lactic ngày nay là sử dụng nó để sản xuất polyme polylactate có thể phân hủy sinh học, cung cấp một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường cho nhựa phân hủy sinh học có nguồn gốc từ nguyên liệu hóa dầu.

Với sự phát triển và thương mại hóa các chất ngoại sinh này, việc sử dụng axit lactic đã tăng lên đáng kể để trở thành trọng điểm hàng đầu của ngành công nghiệp quốc gia (Anh, 2018). Công thức cấu tạo Axit lactic Axit lactic còn được gọi là axit cacboxylic 1- hydroxyethanol hoặc axit 2- hydroxypropanoic. Với công thức phân tử C3H6O3, công thức chung là CH3- CHOH-COOH. Cấu tạo phân tử của các axit lactic có cacbon bất đối xứng nên chúng có 2 đồng phân quang học là D - axit lactic và L - axit lactic.

Hai đồng phân quang học này có các tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau về khả năng quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó, hai đồng phân quang học này có tính chất sinh học khác nhau hoàn toàn (Anh, 2018). Cấu trúc không gian 2 dạng đồng phân axit lactic (Anh, 2018) Tính chất Axit lactic Axit lactic là chất lỏng màu vàng đến không màu (ở 15°C và 1 atm) và không mùi. Do đặc tính hút ẩm cao của axit lactic, nó thường được sử dụng dưới dạng dung dịch đậm đặc tới 90% trọng lượng, hầu như không mùi và chứa một lượng đáng kể axit lactoyllactic và các đồng phân axit lactic khác.

Axit lactic hòa tan hoàn toàn trong nước, ethanol, dietyl ete và các dung môi hữu cơ khác. Nó gần như không hòa tan trong benzen và chloroform. Các tính chất nhiệt động của axit lactic được trình bày cụ thể trong bảng 1. D- axit lactic và L- axit lactic là chất lỏng có nhiệt độ nóng chảy 16,8oC, độ sôi 122oC, là chất kết tinh có thể hòa tan hòa tan hoàn toàn trong H2O, rượu, tuy nhiên không tan trong CHCl3.

Axit lactic có khối lượng phân tử 98,08 và là một chất hữu cơ không màu, có mùi nhẹ, một chất lỏng nhớt, hút ẩm cao, có sẵn trên thị trường với các chất lượng khác nhau và tùy theo độ tinh khiết mà có các chỉ tiêu khác nhau: axit lactic kỹ thuật, axit lactic thực phẩm, dược phẩm và nhựa. Ở dạng đồng phân axit D- axit lactic hoặc L- axit lactic có nhiệt độ nóng chảy tương ứng là 28oC và 103oC. Một tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: không màu tạo thành khi làm nóng dung dịch 80% acid lactic đến 180 oC. Tính chất nhiệt động học của axit lactic Tính chất Giá trị Mật độ ở 20o C (g/l) 1.249 Điểm nóng chảy oC 52,8 (Đ); 53,0 (L); 16,8 (DL) Điểm sôi (° C) 82,0 (ĐL) a 0,5 mmHg; 122,0 (DL) ở 15 mmHg; 103 (D) ở 15 mmHg Hằng số phân ly (pKa) ở 25 ° C 3,83 (Đ); 3,79 (L) Nhiệt dung (J / mol ∙ ° C) ở 20 ° C 3,83 (Đ); 3,79 (L) Nhiệt dung dịch (kJ / mol) ở 25 ° C 7,79 (L) Nhiệt của phản ứng tổng hợp (kJ/mol) 16,86 (L); 11,33 (ĐL) (Andrea Komesu & cs., 2017) Tùy thuộc vào bản chất của vi sinh vật mà các đồng phân được tạo ra là khác nhau.

Nhờ quá trình lên men cùng với hoạt động của vi sinh vật đã tạo ra axit lactic. Tỷ trọng, độ nhớt, chiết suất và độ dẫn điện của dung dịch axit lactic trong nước ở các nồng độ khác nhau (Chahal & Starr, 2000). Ứng dụng và vai trò của axit lactic Axit lactic cung cấp các thành phần tự nhiên cho các ứng dụng mỹ phẩm. Chúng có nhiều đặc tính khác nhau như hoạt động kháng khuẩn, làm sáng và chăm sóc da, nhưng chủ yếu được sử dụng làm chất dưỡng ẩm và điều chỉnh độ pH.

Tác dụng dưỡng ẩm liên quan trực tiếp đến khả năng giữ nước của lactate và tác dụng làm sáng da của axit lactic được tạo ra bằng cách ức chế sự hình thành tyrosinase. Vì chúng là một thành phần tự nhiên của cơ thể con người, axit lactic hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện đại hướng tới các công thức tự nhiên và an toàn hơn, đồng thời chúng tạo ra các tác dụng như làm sáng và trẻ hóa da. Đó là thành phần hoạt chất rất hữu ích trong mỹ phẩm (Wee & cs. Việc sử dụng axit lactic đang phát triển nhanh nhất là việc sử dụng nó làm monomer để sản xuất axit polylactic hoặc polylactide (PLA).

Nature Works LLC sản xuất PLA thông qua quá trình trùng hợp lactide mở vòng (Henton & cs. 5 Lactide được tạo ra bằng cách ngưng tụ hai thực thể axit lactic. Axit lactic gần đây đã nhận được rất nhiều sự chú ý như một monome nguyên liệu để sản xuất PLA, được sử dụng làm nhựa hàng hóa có thể phân hủy sinh học. Axit lactic tinh khiết về mặt quang học có thể được polyme hóa thành PLA có trọng lượng phân tử cao thông qua các phản ứng nối tiếp polycondensation, depolyme hóa và trùng hợp mở vòng.

Polyme thu được có nhiều công dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau, chẳng hạn như quần áo bảo hộ, bao bì thực phẩm, chất phủ, túi đựng rác, thùng chứa cứng, màng co và khay có thời hạn sử dụng ngắn. Với sự tăng trưởng mạnh mẽ của thị trường PLA sẽ kích thích đáng kể nhu cầu sử dụng axit lactic trong tương lai sắp tới (Wee & cs. a) Trong thực phẩm Ngành công nghiệp thực phẩm ăn được là ngành tiêu thụ lớn axit lactic và lactate. Nó chủ yếu được sử dụng như một chất axit hóa và chất bảo quản.

Axit lactic có vị chua nhẹ và không lấn át mùi thơm yếu hơn, nó xuất hiện tự nhiên nên nó không đưa các nguyên tố lạ vào thực phẩm và muối của nó rất dễ hòa tan, do đó có thể thay thế một phần axit trong hệ thống đệm. Axit lactic và muối của nó được sử dụng trong nhiều loại đồ uống, bánh kẹo, thịt và nước sốt. Canxi lactate có thể được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm để tạo ra sản phẩm tăng cường canxi. Steroyl lactate và muối natri và canxi của nó được sử dụng trong bánh mì.

b) Trong công nghiệp Có nhiều ứng dụng công nghiệp cho axit lactic và các dẫn xuất của nó, được sử dụng trong các ngành công nghiệp mạ kim loại, mỹ phẩm, dệt may và da. Este lactate được sử dụng trong sản xuất sơn và mực in, đồ điện tử và làm sạch kim loại.