Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về nhân giống in vitro 1. Khái quát nuôi cấy mô tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tạo nguồn vật liệu khởi đầu sạch bệnh để tiến hành nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng vô trùng. Nhân giống vô tính hay còn gọi là nhân giống in vitro tiến hành cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực như: tạo phôi vô tính, nhân giống vô tính in vitro và bảo quản nguồn gen in vitro nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh,. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra khái niệm tính toàn năng của tế bào là cơ sở lý luận cho phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông là người đầu tiên đưa ra khái niệm mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Trong khi đó theo quan điểm cho sinh học hiện đại, khái niệm tính toàn năng của mỗi tế bào riêng rẽ sẽ phân hóa, và mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết.
Gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh (Nguyễn Quang Thạch, 2009). Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Khái niệm sự phân hoá là sự chuyển hóa của tế bào dạng phôi sang tế bào chuyên hóa để đảm bảo chức năng sinh hóa và sinh lý khác nhau. Khái niệm sự phản phân hóa là sự chuyển hóa từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. h 4 Các quá trình này chịu ảnh hưởng và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, môi trường.
Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật Các điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: - Điều kiện vô trùng: Nuôi cấy in vitro cần phải đảm bảo điều kiện vô trùng cả mẫu nuôi cấy lẫn môi trường và thao tác. Điều kiện vô trùng sẽ giảm thiểu tình trạng nhiễm khuẩn của mẫu nuôi cấy. Các phương pháp vô trùng thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất hoá học để loại bỏ nấm và vi khuẩn, hoặc sử dụng tia UV. - Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH + Ánh sáng: Sự phát triển và sinh trưởng của các mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng và chi phối của nhiều yếu tố của ánh sáng như chất lượng ánh sáng, thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng.
Trong đó thời gian chiếu sáng tác động mạnh đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Nhìn chung các loài cây có thời gian chiếu sáng thích hợp dao động từ 12-18 giờ/ngày. + Nhiệt độ: Trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá diễn ra ở trong cây. Tuỳ thuộc vào xuất xứ, nguồn gốc của mẫu nuôi cấy mà có thể điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp với sự phát triển của cây.
Nhiều loài cây có ngưỡng nhiệt độ thích hợp là 25±2ºC (Hoàng Thị Sản, 2009). + pH: pH của môi trường là một yếu tố quan trọng duy trì quá trình diễn ra trao đổi chất trong tế bào. Đa số môi trường nuôi cấy có độ pH năm ở khoảng 5,5-6. Nếu thấp hơn ảnh hưởng đến chuyển trạng thái gel của agar, lớn hơn sẽ làm agar bị cứng (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2009).
Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần môi trường trong quá trình nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển, sinh trưởng của tế bào và mô thực vật. Tùy thuộc vào loài, loại tế bào hay bộ phân nuôi cấy sẽ có h 5 môi trường nuôi cấy khác nhau. Tuy nhiên, các loại môi trường vẫn gồm những thành phần chủ yếu sau: khoáng vi lượng, đa lượng, đường, các vitamin, các chất điều hòa sinh trường, kích thích sinh trưởng,… Ngoài ra có thể bổ sung thêm một số loại khác như EDTA, nước dừa, dịch chiết nấm men, than hoạt tính,… + Nước: Nước chiếm 95% thành phần môi trường dinh dưỡng cho cây, do đó cần phải chú ý đến thành phần này. Không được sử dụng nước máy, nước mưa, hay nước giếng trong nuôi cấy mô tế bào thực do có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn.
Chỉ nên sử dụng nước khử ion trong nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 2009). + Dinh dưỡng vô cơ: Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật đòi hỏi nhu cầu về nguyên tố khoáng, cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây. + Đường: Một thành phần quan trọng cho môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật là đường. Trong đó loại đường được sử dụng chú yếu là đường saccharose ở nồng độ 1-5%.
Đường saccharose được tổng hợp và vận chuyển tự nhiên trong cây tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các mô nuôi cấy. Ngoài ra cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật, nhưng chủ yếu vẫn là đường saccharose. Loại và tuổi mẫu cấy sẽ ảnh hưởng đến nồng độ đường sử dụng (Nguyễn Quang Thạch, 2009). + Vitamin: Vitamin xúc tác cho các quá trình biến dưỡng của thực vật, thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu nuôi cấy.
Các vitamin thường được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô là: nicotinic acid, Thiamin (vitamin B1), myo-inositol và pyridoxine (vitamin B6). + Agar: Agar là một loại polysacharit của tảo. Nồng độ của agar phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy và độ tinh khiết của hóa chất, thông thường h 6 trung bình từ 6-12 g/l. Ở 80ºC agar ở trạng thái sol còn ở 40ºC thì agar ở trạng thái gel (Nguyễn Quang Thạch, 2009).
+ Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon): Chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) là thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy và trong quá trình phát sinh hình thái thực vật trong nuôi cấy in vitro. Chất ĐHST phụ thuộc vào hoạt tính, nguồn gốc của mô nuôi cấy, nồng độ chất ĐHST sử dụng, … (Trịnh Đình Đạt, 2009). Chất ĐHST được chia thành 2 nhóm là chất kích thích sinh trưởng (KTST) và nhóm ức chế sinh trưởng (ƯCST). Hai nhóm này có tác dụng sinh lý trái ngược nhau.
Nhóm KTST gồm gibberellin, cytokinin và auxin. Nhóm ƯCST như các chất diệt cỏ, etilen, ABA, các chất ức chế tổng hợp như retardant, các hợp chất phenol,… Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể bổ sung thêm các dung dịch hữu cơ khác như: chuối, nước ép khoai tây, dịch chiết nấm men, cazein thuỷ phân, than hoạt tính, nước dừa, … nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 2009). + Than hoạt tính: Than hoạt tính có tác dụng khử độc, hấp thụ các chất màu và các hợp chất phenol, kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ, là chất chống oxy hóa tốt… 1. Các giai đoạn của nhân giống vô tính Theo Trịnh Đình Đạt (2009), trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn như sau: Giai đoạn chuẩn bị: Giai đoạn này tạo ra nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy.
Có thể vô trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: H2O2, KMnO4, CaOCl2, HgCl2, NaOCl, … h 7 Các mẫu ban đầu được lấy từ môi trường bên ngoài tự nhiên phải đảm bảo tỷ lệ sống cao, tỷ lệ nhiễm thấp, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh. Để đảm bảo kết quả của giai đoạn này cần đảm bảo cách lấy mẫu, nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý mẫu. Thường lựa chọn vật liệu ban đầu là các đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoặc đoạn thân mang chồi,… Kết quả nghiên cứu của Sharma (2005) khi khử trùng bề mặt thân rễ cây Địa liền và cây Ngải máu bằng cồn 70%, sau đó sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để tiêu diệt vi khuẩn và nấm bám trên mẫu. Tương tự cũng sử dụng kết hợp giữa Cồn và HgCl2 đối với cây Sâm Ngọc Linh, tác giả Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2011) đã thu được tỷ lệ mẫu sạch cao.
Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy: Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro, mục đích tái sinh có định hướng cho sự phát triển của mô nuôi cấy. Yêu cầu giai đoạn này cần đảm bảo tỉ lệ sống cao, tỉ lệ nhiễm thấp mô tồn tại sinh trưởng tốt. Giai đoạn chịu tác động của các chất ĐHST, nồng độ (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. Nayak và cộng sự (2011) đã nghiên cứu nồng độ BA từ 1-3 mg/l đến khả năng bật chồi của cây Riềng thì cho thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt nhất.
Behera và cộng sự (2010) sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng. Mặt khác, phải quan tâm tới tuổi của mẫu đem nuôi cấy, thường sử dụng các mô non chưa phân hóa, có khả năng tái sinh sẽ cao hơn so với những mô đã chuyển hóa. Giai đoạn nhân nhanh chồi: Giai đoạn nhân nhanh chồi kích thích phát sinh hình thái mô nuôi cấy và tăng sinh về số lượng thông qua việc tạo chồi bất định, hoạt hóa chồi nách và tạo phôi vô tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất.
Do đó giai đoạn này góp phần quan trọng vào quá trình nuôi cấy mô h 8 tế bào thực vật. Để tăng hệ số nhân nhanh có thể bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy chất ĐHST như auxin, cytokinin,… hoặc nước dừa, dịch chiết nấm men, … Ngoài ra còn kết hợp thêm các điều kiện về nhiệt độ (25-27ºC), độ ẩm (60-80%), cường độ ánh sáng (2000-4000 lux). Mỗi loại mẫu nuôi cấy có thể kích thích nhân nhanh bằng việc kích thích phát triển chồi nách, kích thích sự hình thành cụm chồi, kích thích tạo cây từ phôi vô tính. Ví dụ như kết quả nghiên cứu nhân nhanh đối với cây Giảo cổ lam, Jala và cộng sự năm 2012 cho kết quả khi kết hợp BA 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy.
Như vậy nồng độ và loại chất ĐHST có ảnh hưởng tốc độ và chất lượng nhân nhanh của mẫu nuôi cấy.