Nghiên cứu về nấm Curvularia lunata và tác động của nó đến bệnh đốm lá trên cây chuối

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Isolation identification and study of biological characteristics of the pathogenic fungi curvularia, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Ngo Phuong Hien
• Người hướng dẫn: Ph. Ngo Thu Huong
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Microbiology
• Đề tài: Isolation, Identification And Study Of Biological Characteristics Of The Pathogenic Fungi Curvularia Lunata Causing Leaf Spot To Bananas
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENTS
• 1. CONTENTS
• 1.1. COMMITMENT
• 1.2. LIST OF TABLES
• 1.3. LIST OF FIGURES
• 1.4. LIST OF ABBREVIATIONS
• 2. OVERVIEW OF BANANAS
• 2.1. Bananas in food demanding
• 2.2. Bananas as economic importance
• 2.3. Diseases causing the banana production loss
• 2.3.1. Diseases from bacteria
• 2.3.2. Diseases from virus
• 2.3.3. Diseases from fungi
• 3. MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and location for the research
• 3.2. Samples collection method
• 3.3. Isolating and subculturing method
• 3.4. Studying on some biological characteristics of the selected fungi strain
• 3.5. Studying on the morphological characteristics of conidia, mycelium and conidiophore of the selected fungi strain
• 3.6. Studying on the culturing features of the pathogenic fungi in different medium
• 3.7. Screening the ability to produce extracellular enzyme cellulase of the selected fungi strain
• 3.8. Indentification of the selected fungi strain
• 3.9. DNA extraction method
• 3.10. Amplification, sequencing and analyzing ITS gene sequence of isolated fungi strain method
• 3.11. Screening, detecting toxic genes of fungal strains
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Results of samples collection, isolation and subculturing the pathogenic pathogenic fungi strain
• 4.2. Classification of pathogenic fungi strain HN 5
• 4.3. Amplification, sequencing and analyzing ITS gene sequence of fungi strain HN 5
• 4.4. Clg2P gene amplification
• 4.5. Screening the development of HN 5.2 strain in different medium
• 4.6. Testing the ability to extract cellulase of HN 5
• 4.7. Screening for the genes encoding virulence factors biosynthesis in pathogenic HN 5
• 5. CONCLUSION AND PROPOSAL
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• ABSTRACT
• INTRODUCTION

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Curvularia lunata và bệnh đốm lá chuối

Curvularia lunata là một loại nấm gây bệnh phổ biến trên nhiều loại cây trồng, bao gồm chuối. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của loại nấm này, đặc biệt là khả năng gây bệnh đốm lá chuối. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lượng quả, gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp. Việc xác định và hiểu rõ cơ chế gây bệnh của Curvularia lunata sẽ giúp phát triển các biện pháp bảo vệ thực vật hiệu quả.

1.1. Curvularia lunata và vai trò trong bệnh đốm lá chuối

Curvularia lunata là một loại nấm mốc thuộc chi Curvularia, được biết đến với khả năng gây bệnh trên nhiều loại cây trồng, bao gồm chuối. Bệnh đốm lá chuối do Curvularia lunata gây ra thường xuất hiện dưới dạng các đốm nâu hoặc đen trên lá, dẫn đến giảm khả năng quang hợp và năng suất cây trồng. Nghiên cứu này nhằm phân lập và xác định các đặc điểm sinh học của loại nấm này, từ đó tìm hiểu cơ chế gây bệnh và đề xuất các biện pháp kiểm soát hiệu quả.

1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu nấm gây bệnh trên chuối

Chuối là một trong những cây trồng quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò lớn trong an ninh lương thực và kinh tế. Tuy nhiên, các bệnh do nấm gây hại như Curvularia lunata đang đe dọa nghiêm trọng đến sản xuất. Việc nghiên cứu và hiểu rõ các đặc điểm sinh học của nấm bệnh này sẽ giúp phát triển các biện pháp bảo vệ thực vật hiệu quả, đảm bảo năng suất và chất lượng chuối.

II. Phương pháp nghiên cứu và phân lập nấm

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2022 đến tháng 2/2023 tại Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Nông nghiệp Việt Nam. Các mẫu lá chuối bị bệnh đốm lá được thu thập từ tỉnh Hưng Yên. Quy trình phân lập nấm bao gồm việc nuôi cấy trên các môi trường khác nhau như PDA và MEA. Các đặc điểm sinh học như hình thái khuẩn lạc, bào tử và sợi nấm được quan sát và ghi nhận. Ngoài ra, các phương pháp phân tử như PCR và giải trình tự ITS cũng được sử dụng để xác định loài nấm.

2.1. Quy trình phân lập nấm và nuôi cấy

Các mẫu lá chuối bị bệnh được thu thập và xử lý để phân lập nấm. Quy trình nuôi cấy được thực hiện trên các môi trường PDA và MEA. Các đặc điểm hình thái như khuẩn lạc, bào tử và sợi nấm được quan sát dưới kính hiển vi. Kết quả cho thấy chủng nấm HN 5.2 có các đặc điểm tương đồng với Curvularia lunata, được xác định thông qua phân tích hình thái và phân tử.

2.2. Phương pháp phân tử trong xác định loài nấm

Phương pháp PCR và giải trình tự ITS được sử dụng để xác định loài nấm. Kết quả giải trình tự ITS cho thấy chủng HN 5.2 có sự tương đồng cao với Curvularia lunata. Ngoài ra, các gen liên quan đến độc lực của nấm cũng được phát hiện, cung cấp cơ sở cho việc nghiên cứu cơ chế gây bệnh của loại nấm này trên chuối.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng nấm HN 5.2 được phân lập từ lá chuối bị bệnh có các đặc điểm sinh học tương đồng với Curvularia lunata. Chủng này có khả năng sản xuất enzyme cellulase và phát triển tốt trên môi trường Richard agar. Các gen độc lực như HNR-F/HNR-R và Clk1_F/Clk1_R cũng được phát hiện, cho thấy tiềm năng gây bệnh cao của chủng nấm này. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở quan trọng cho việc phát triển các biện pháp kiểm soát bệnh đốm lá chuối trong tương lai.

3.1. Đặc điểm sinh học của chủng HN 5.2

Chủng nấm HN 5.2 được phân lập từ lá chuối bị bệnh có các đặc điểm hình thái và sinh học tương đồng với Curvularia lunata. Chủng này có khả năng sản xuất enzyme cellulase, một yếu tố quan trọng trong quá trình gây bệnh. Ngoài ra, chủng nấm này phát triển tốt trên môi trường Richard agar, cho thấy khả năng thích nghi cao với các điều kiện môi trường khác nhau.

3.2. Phát hiện các gen độc lực của Curvularia lunata

Các gen độc lực như HNR-F/HNR-R và Clk1_F/Clk1_R được phát hiện trong chủng HN 5.2, cho thấy tiềm năng gây bệnh cao của loại nấm này. Việc phát hiện các gen này cung cấp cơ sở quan trọng cho việc nghiên cứu cơ chế gây bệnh của Curvularia lunata trên chuối, từ đó phát triển các biện pháp kiểm soát bệnh hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Chuối là một trong những cây trồng lương thực quan trọng thứ tư trên thế giới, chỉ sau lúa, ngô và lúa mì, với sản lượng toàn cầu khoảng 7 triệu tấn và giá trị thương mại lên đến 18 tỷ USD. Tại Việt Nam, diện tích trồng chuối đạt khoảng 150.000 ha, sản lượng hàng năm khoảng 1,4 triệu tấn, chiếm hơn 19% diện tích cây ăn quả cả nước. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng chuối đang bị đe dọa nghiêm trọng bởi nhiều loại bệnh do vi khuẩn, virus và nấm gây ra, trong đó bệnh đốm lá do nấm là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại năng suất từ 11% đến 80%.

Mục tiêu nghiên cứu là phân lập, nhận diện và khảo sát đặc điểm sinh học của chủng nấm gây bệnh đốm lá trên chuối tại tỉnh Hưng Yên, Việt Nam, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc kiểm soát bệnh hiệu quả. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 9/2022 đến tháng 2/2023, tập trung vào việc thu thập mẫu lá chuối bị bệnh, phân lập chủng nấm gây bệnh, xác định bằng phương pháp hình thái và sinh học phân tử, đồng thời khảo sát các đặc điểm sinh học và gen độc lực của chủng nấm. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các biện pháp phòng trừ bệnh đốm lá chuối, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chuối tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh học phân tử và sinh học nấm bệnh thực vật, tập trung vào:

• Lý thuyết phân loại và nhận diện nấm bệnh: Sử dụng đặc điểm hình thái học của bào tử, sợi nấm, và conidiophore kết hợp với kỹ thuật giải trình tự gen ITS (Internal Transcribed Spacer) để xác định chủng nấm.
• Mô hình cơ chế gây bệnh của nấm Curvularia lunata: Nghiên cứu các yếu tố độc lực như gen tổng hợp melanin, gen điều hòa sự phát triển và hình thành cấu trúc gây bệnh (appressorium), cũng như khả năng sản xuất enzyme cellulase để xâm nhập mô thực vật.
• Khái niệm chính: Curvularia lunata, bệnh đốm lá chuối, gen độc lực (Clg2p, 3HNR, Clk1, Clh1, ClPKS18, Sod), enzyme cellulase, phương pháp PCR và giải trình tự gen ITS.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu lá chuối bị bệnh được thu thập tại vườn chuối ở xã Yên Lịch, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. Mẫu lá khỏe mạnh dùng cho thử nghiệm gây bệnh được lấy từ vườn chuối sạch bệnh tại quận Gia Lâm, Hà Nội.
• Phương pháp phân tích:
  • Phân lập và nuôi cấy chủng nấm trên môi trường PDA, CZA, Richard agar, MEA và WA.
  • Quan sát đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi.
  • Thử nghiệm gây bệnh trên lá chuối khỏe mạnh để xác định tính gây bệnh.
  • Chiết xuất DNA, khuếch đại gen ITS bằng PCR, giải trình tự và phân tích sinh học phân tử để xác định chủng nấm.
  • Khuếch đại các gen độc lực bằng PCR với 6 cặp mồi đặc hiệu.
  • Đánh giá khả năng sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp tạo vòng trong môi trường chứa carboxymethyl cellulose.
• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 8/2022 đến tháng 2/2023, gồm các bước thu thập mẫu, phân lập, nuôi cấy, thử nghiệm gây bệnh, phân tích gen và khảo sát đặc điểm sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và nhận diện chủng nấm gây bệnh: Từ 12 mẫu lá chuối bị bệnh, chủng nấm HN 5.2 được phân lập với đặc điểm hình thái phù hợp với Curvularia lunata, bao gồm bào tử cong, có 3 vách ngăn, sợi nấm màu xám đen, thuộc nhóm Pleosporaceae. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS cho sản phẩm khoảng 500-600 bp, tương đồng với các nghiên cứu trước. Phân tích cây phát sinh loài cho thấy chủng HN 5.2 có độ tương đồng 100% với Curvularia lunata isolate CHRYSC1.

2. Thử nghiệm gây bệnh: Chủng HN 5.2 gây ra các vết đốm tròn, có vòng vàng bao quanh trên lá chuối khỏe mạnh sau 4 ngày, tiến triển thành vết hoại tử màu nâu đậm sau 10 ngày, tương tự các triệu chứng bệnh đốm lá do C. lunata trên các cây trồng khác.

3. Khả năng phát triển trên môi trường nuôi cấy: Chủng nấm phát triển nhanh nhất trên môi trường Richard agar với đường kính khuẩn lạc đạt 89 mm sau 7 ngày, tiếp theo là PDA (85 mm), trong khi WA là môi trường phát triển chậm nhất (64 mm). Màu sắc và cấu trúc khuẩn lạc thay đổi theo môi trường, từ trắng sữa đến đen tuyền.

4. Khả năng sản xuất enzyme cellulase: Chủng HN 5.2 tạo vòng thủy phân rõ rệt trên môi trường chứa carboxymethyl cellulose, chứng tỏ khả năng sản xuất enzyme cellulase, một yếu tố quan trọng trong quá trình xâm nhập và phá hủy thành tế bào thực vật.

5. Phát hiện gen độc lực: 4 trong 6 gen độc lực được khảo sát (HNR, Clk1, Clh1, Clg2p) được khuếch đại thành công, cho thấy chủng nấm có tiềm năng sinh tổng hợp melanin và các yếu tố độc lực khác liên quan đến khả năng gây bệnh.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định Curvularia lunata là tác nhân gây bệnh đốm lá trên chuối tại Việt Nam, lần đầu tiên được xác nhận bằng phương pháp sinh học phân tử và hình thái học. Sự phát triển nhanh trên môi trường Richard agar cho thấy môi trường giàu dinh dưỡng hỗ trợ tối ưu cho sinh trưởng của chủng nấm này, phù hợp với điều kiện tự nhiên tại vùng nghiên cứu. Khả năng sản xuất cellulase và sự hiện diện của các gen độc lực tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về C. lunata trên các cây trồng khác, cho thấy cơ chế gây bệnh của chủng nấm này có tính đặc hiệu và hiệu quả cao trong việc xâm nhập mô lá chuối. Các biểu đồ so sánh tốc độ phát triển trên các môi trường và hình ảnh vòng thủy phân cellulase có thể minh họa rõ nét cho các phát hiện này. Kết quả cũng mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử và phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM): Kết hợp sử dụng thuốc trừ nấm chuyên biệt với các biện pháp sinh học và canh tác hợp lý nhằm giảm thiểu sự phát triển của Curvularia lunata, mục tiêu giảm tỷ lệ nhiễm bệnh dưới 10% trong vòng 2 năm, do các cơ quan quản lý nông nghiệp và người trồng chuối thực hiện.

2. Phát triển và ứng dụng chế phẩm sinh học: Khuyến khích nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đối kháng như Trichoderma harzianum hoặc Bacillus sp. có khả năng ức chế Curvularia lunata, nhằm giảm thiểu sử dụng hóa chất, nâng cao hiệu quả kiểm soát bệnh trong 3 năm tới.

3. Tăng cường giám sát và phát hiện sớm bệnh: Xây dựng hệ thống giám sát dịch bệnh tại các vùng trồng chuối trọng điểm, sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện sớm chủng nấm gây bệnh, giúp can thiệp kịp thời, giảm thiểu thiệt hại năng suất.

4. Đào tạo và nâng cao nhận thức cho nông dân: Tổ chức các khóa tập huấn về nhận biết triệu chứng bệnh, kỹ thuật phòng trừ và quản lý dịch hại bền vững, nhằm nâng cao năng lực ứng phó của người trồng chuối trong vòng 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành vi sinh vật học, nông học: Nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học, cơ chế gây bệnh của nấm Curvularia lunata, làm cơ sở cho các đề tài tiếp theo về bệnh học thực vật và vi sinh vật.

2. Cơ quan quản lý nông nghiệp và dịch bệnh cây trồng: Sử dụng kết quả để xây dựng chính sách, hướng dẫn kỹ thuật phòng trừ bệnh đốm lá chuối hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

3. Doanh nghiệp sản xuất thuốc bảo vệ thực vật và chế phẩm sinh học: Tham khảo đặc điểm sinh học và gen độc lực của nấm để phát triển sản phẩm trừ nấm chuyên biệt, an toàn và hiệu quả.

4. Nông dân và hợp tác xã trồng chuối: Nắm bắt kiến thức về bệnh đốm lá, phương pháp nhận diện và phòng trừ, từ đó áp dụng vào thực tiễn canh tác nhằm nâng cao năng suất và chất lượng chuối.

Câu hỏi thường gặp

1. Curvularia lunata là gì và tại sao nó gây hại cho chuối?
   Curvularia lunata là một loại nấm gây bệnh thực vật, có khả năng gây bệnh đốm lá trên chuối bằng cách xâm nhập và phá hủy mô lá thông qua các enzyme như cellulase và các yếu tố độc lực khác, làm giảm khả năng quang hợp và năng suất cây trồng.

2. Làm thế nào để phân lập và nhận diện chính xác chủng nấm gây bệnh?
   Phân lập chủng nấm từ mẫu lá bệnh trên môi trường PDA, quan sát đặc điểm hình thái dưới kính hiển vi, kết hợp với kỹ thuật PCR khuếch đại vùng gen ITS và giải trình tự để so sánh với dữ liệu gen chuẩn trên GenBank giúp nhận diện chính xác.

3. Các yếu tố độc lực của Curvularia lunata gồm những gì?
   Các yếu tố độc lực bao gồm gen tổng hợp melanin (3HNR, ClPKS18), gen điều hòa phát triển và hình thành cấu trúc gây bệnh (Clg2p, Clk1, Clh1), và khả năng sản xuất enzyme cellulase giúp nấm xâm nhập và gây tổn thương mô thực vật.

4. Phương pháp phòng trừ bệnh đốm lá do Curvularia lunata hiệu quả là gì?
   Kết hợp sử dụng thuốc trừ nấm chuyên biệt, chế phẩm sinh học đối kháng, quản lý canh tác hợp lý và giám sát dịch bệnh thường xuyên giúp kiểm soát hiệu quả bệnh, giảm thiểu thiệt hại năng suất.

5. Nghiên cứu này có ý nghĩa gì đối với ngành nông nghiệp Việt Nam?
   Nghiên cứu lần đầu tiên xác nhận Curvularia lunata là tác nhân gây bệnh đốm lá chuối tại Việt Nam, cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả, góp phần bảo vệ và nâng cao giá trị kinh tế của cây chuối.

Kết luận

• Xác định thành công chủng nấm Curvularia lunata HN 5.2 là tác nhân gây bệnh đốm lá trên chuối tại Hưng Yên, Việt Nam.
• Chủng nấm có đặc điểm hình thái và gen ITS tương đồng 100% với các chủng C. lunata trên thế giới.
• Chủng nấm phát triển tốt nhất trên môi trường Richard agar và có khả năng sản xuất enzyme cellulase, hỗ trợ quá trình xâm nhập mô thực vật.
• Phát hiện 4 gen độc lực quan trọng liên quan đến cơ chế gây bệnh của nấm, mở ra hướng nghiên cứu sâu về sinh học phân tử.
• Đề xuất các biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp, phát triển chế phẩm sinh học và nâng cao nhận thức người trồng nhằm kiểm soát hiệu quả bệnh đốm lá chuối.

Tiếp theo, cần triển khai nghiên cứu ứng dụng các biện pháp phòng trừ dựa trên kết quả sinh học phân tử và khảo nghiệm thực địa để đánh giá hiệu quả lâu dài. Mời các nhà nghiên cứu, quản lý và người trồng chuối cùng hợp tác phát triển giải pháp bền vững cho ngành chuối Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ----------  ---------- GRADUATION THESIS TITLE: ISOLATION, IDENTIFICATION AND STUDY OF BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE PATHOGENIC FUNGI CURVULARIA LUNATA CAUSING LEAF SPOT TO BANANAS Hanoi - 2023 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ----------  ---------- GRADUATION THESIS TITLE: ISOLATION, IDENTIFICATION AND STUDY OF BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE PATHOGENIC FUNGI CURVULARIA LUNATA CAUSING LEAF SPOT TO BANANAS STUDENT : NGO PHUONG HIEN STUDENT CODE : 637411 CLASS : K63-CNSHE FACULTY : BIOTECHNOLOGY MAJOR : MICROBIOLOGY INSTRUCTOR : Ph. NGO THU HUONG Assoc Prof. NGUYEN XUAN CANH Hanoi - 2023 COMMITMENT The research was conducted from 9/2022 to 2/2023 under the supervision of Ph. Ngo Thu Huong, Assoc Prof.

Nguyen Xuan Canh at Department of Microbiotechnology – Faculty of Biotechnology – Vietnam National University of Agriculture. I hereby declare that the data and results of this study are honest and have not been published in any scientific research at home or abroad. References have been clearly cited. Any help during the implementation of this thesis has been appreciated.

i i ACKNOWLEDGEMENTS Firstly, I want to express my sincere gratitude to all of the Executive Board, teachers, and lecturers of the Faculty of Biotechnology, Vietnam National University of Agriculture for helping, encouraging and providing the best working environment for me to complete the thesis. Secondly, I would like to express my most sincere thank to Ph. Ngo Thu Huong, Assoc. Nguyen Xuan Canh for guiding and giving valuable advice during my research so that I could complete my thesis successfully.

Thirdly, I would like to express my deep gratitude to the lecturers of the Department of Microbiotechnology, Assoc. Nguyen Van Giang, Msc. Tran Thi Hong Hanh, Msc. Nguyen Thanh Huyen, Msc.

Tran Thi Dao, Ph. student Nguyen Thi Thu and researcher Duong Van Hoan, Ta Ha Trang for getting me through the difficulties during my final thesis course. My completion of this project could not have been accomplished without their devotion. Last but not least, I crave for expressing my appreciation to my beloved family members, my friends, and colleagues for their encouragement, motivation so that I could complete my graduation thesis.

Sincerely, Hanoi, February 3rd, 2023 Sincerely Ngo Phuong Hien ii CONTENTS COMMITMENT. iii LIST OF TABLES. vi LIST OF FIGURES. vii LIST OF ABBREVIATIONS.

Overview of Bananas. Bananas in food demanding. Bananas as economic importance. Diseases causing the banana production loss.

Diseases from bacteria. Diseases from virus. Diseases from fungi. Overview of Curvularia lunata.

Overview of Curvularia species. Overview of Curvularia lunata. Morphology of Curvularia lunata. Various hosts of Curvularia lunata.

Infection mechanism of Curvularia lunata. MATERIALS AND METHODS. Time and location for the research. Samples collection method.

Isolating and subculturing method. Studying on some biological characteristics of the selected fungi strain. Studying on the morphological characteristics of conidia, mycelium and conidiophore of the selected fungi strain. Studying on the culturing features of the pathogenic fungi in different medium.

Screening the ability to produce extracellular enzyme cellulase of the selected fungi strain. Indentification of the selected fungi strain. DNA extraction method. Amplification, sequencing and analyzing ITS gene sequence of isolated fungi strain method.

Screening, detecting toxic genes of fungal strains. RESULTS AND DISCUSSION. Results of samples collection, isolation and subculturing the pathogenic pathogenic fungi strain. Classification of pathogenic fungi strain HN 5.

Amplification, sequencing and analyzing ITS gene sequence of fungi strain HN 5. Clg2P gene amplification. Screening the development of HN 5.2 strain in different medium. Testing the ability to extract cellulase of HN 5.

Screening for the genes encoding virulence factors biosynthesis in pathogenic HN 5. CONCLUSION AND PROPOSAL. 45 v LIST OF TABLES Table 3. Virulence factors primer pair sequences.

Features enumeration and growth comparison of different C.31 vi LIST OF FIGURES Figure 2. Symptoms of crown rot in banana fruits. Eumusa leaf spot in Southeast Asia. Morphology of Curvularia canadensis with the scale bars = 10μm and 5μm respectively.

Characteristics of Curvularia leaf spot symptoms on a corn leaf. Leaf spot caused by Curvularia lunata in Aloe vera. Samples of banana leaves with typical disease symptoms. The morphology of HN 5.2 fungi strain in PDA medium (with A: Infected leaves isolation; B and C: Colony morphology of HN 5.2 after being cultured for 5 days and 8 days respectively; D: HN 5.2 strain mycelium; E: HN 5.2 strain condiophore; F: HN 5.

All of the figures were observed under the magnification of 40X). Pathogenicity test of HN 5.2 fungi strain in banana leaves. Electrophoresis result of ITS gene region PCR product from HN 5. Phylogenetic tree based on ITS1/ITS4 sequences of HN 5.

Electrophoresis result for the PCR product of HN 5.2 fungi strain using P1-F/P2-R primer pair. The growth and development of C. Extracellular cellulase activity of C. Detecting pathogenic genes in C.

35 vii LIST OF ABBREVIATIONS Abbriviaions Full word C. lunata Curvularia lunata MEA Malt Extract Agar PDA Potato Detrose Agar WA Water agar Xcm Xanthomonas campestris pv. musacearum viii ABSTRACT This study was conducted with the aim to isolate and identify new pathogenic agent causing leaf spot on banana. By carrying out experiments designed and performed under in vitro conditions such as isolating and subculturing, HN 5.2 strain was successfully isolated from infected banana leaf samples in Hung Yen province having typical leaf spot disease.

Experiments including observing the morphological features of conidia, mycelium, conidiophore; doing PCR reaction by using specific fungi primer; ITS sequencing and making use of bioinformatics tools were taken to identify HN 5. The results stated that HN 5.2 strain is closely related to Curvularia lunata strain and it was named as Curvularia lunata HN 5.2 biological characteristics such as the cellulase production ability and culturing conditions were also tested. Among the medium system, Richard agar medium is the fastest developmental media. Outstandingly, four out of six virulence factors primers include HNR-F/HNR-R, Clk1_F/Clk1_R, Clh1_u_F Clh1_u_R and P1-F/P2-R have been amplified successfully in HN 5.2 strain sequence, providing the fundamental knowledge for sorting out the pathogenic mechanism of Curvularia lunata HN 5.

INTRODUCTION Banana has been one of the most important staple crops in the world. It not only plays integral role in demanding food for human beings but also acts as inevitable economical growth factor in many countries. Bananas are placed the fourth most important food crop after rice, wheat, and maize by the Food and Agriculture Organization of the United Nations (Dhankher & Foyer, 2018) and contribute 15% in the total of 18 billion USD global trade value. In Vietnam, approximately 1.4 million tons of bananas are planted and produced yearly per 100,000 hectares making up more than 19% of the entire area of fruit crops.

are proven to be a threat in terms of decreasing fruit yeild and quality Despite being the important fruit crop, bananas have been become potential targets for numerous of diseases causing by bacteria, viruses and fungi for a long time (Dhankher & Foyer, 2018) (Siddiq and Muhammad 2020). Among those, banana leaf diseases such as popular Sigatoka banana leaf spot generated by fungal complex Mycosphaerella spp is proven to be a threat in terms of decreasing fruit yeild and quality seriously (Churchill, 2011). Nonetheless, new fungi species have been reported to be the factors causing leaf spot disease recently. Curvularia lunata is a notable fungi species, having ability to cause leaf spot to various of plants such as aloe vera (Avasthi et al., 2015); maize (Jimenez Madrid et al., 2022); rice (Kusai et al.

However, the published scientific reports indicating the infection of C. lunata in banana plants, especially leaves have been limited. In the world, restricted countries such as India witnessed and did research on the cases of C. lunata infection in banana leaves in the recent years (Chowhan & Chakraborty, 2022).

In Vietnam, there have only been published papers about rice plants suffered from black kernel disease caused by C. lunata (Thủy, 2011) With the efforts of scientists and the great progress of biotechnology; leaf spot disease in general can be prevented by physical, chemical and 1 biological methods. The identification of specific pathogenic fungi on bananas especially leaf spot, which is a fast-spreading disease, will plays important role in controlling disease. Therefore, the isolation and study of biological characteristics of the pathogenic C.

lunata on bananas has huge impact on managing banana diseases. In particular, the screening and identification of the virulent genes of the pathogenic fungal strain is the initial fundament in studying the pathogenic mechanism of this fungal strain on the novel host at the molecular level. As a result, I have carried out the topic: " Isolation, identification and study of biological characteristics of the pathogenic fungi Curvularia lunata causing leaf spot to bananas” Research purpose and content ➢ Research purpose Determining the causative agent of banana leaf spot disease in a banana farm in Hung Yen Province based on morphological characteristics and molecular biological method. ➢ Research content • Collecting banana leaf samples having typical leaf spot disease • Isolating and subculturing of fungi strain causing banana leaf spot at Department of Microbiology, Faculty of Biotechnology, Vietnam National University of Agriculture.

• Pathogenicity testing on the isolated fungi strain. • Studying on some biological characteristics of the isolated fungi strain. • Indentifying the fungi strain using molecular method. • Screening and detecting virulence genes of the pathogenic fungi strain.

➢ The novelty This is the first study to confirm Curvularia lunata causing banana leaf spot disease in Vietnam. 2 ➢ The scientific significance The results of the study are a reference for further studies on the Curvularia lunata causing leaf spot disease on bananas in Vietnam. These results could be taken as fundamental information for developing disease control measurements. Overview of Bananas 2.

Bananas in food demanding Following wheat, maize, and rice, banana is the world's fourth most significant food crop (including plantains). Its importance is noticed not just in global food demand but also in the global economy growth. Bananas are widely consumed domestically in many countries, particularly in producing countries, where they contribute to a significant source of nutrition and food security for more than 400 million people, according to the Global Market Report in May 2020. There are countless benefits stemming from bananas, demanding essential nutrients for human beings to survive.

A medium banana consists of 422 milligrams of potassium, which is 9% of what humans require on a daily basis. This mineral has heart-health benefits. Potassium-rich meals help regulate blood pressure, relax blood vessel walls, reduce the risk of stroke, and avoid kidney stones in humans. Bananas are also a good source of fiber, particularly soluble fibers, which help to keep cholesterol levels and blood pressure levels stable.

Regardless, green bananas appear to be an excellent source of vitamins (C, B6, provitamin A), minerals (magnesium, zinc), bioactive substances such as phenolic compounds, and resistant starch, which may be found in both the pulp and peel (Powthong et al. Banana is a possible carbohydrate source for food consumption, and its starches have strong resistance to heat and amylase attack, low swelling qualities, and low retrogradation, making them useful in the food business as a gelling agent, thickening agent, and stabilizer. Because they are odorless and soluble, these properties are very significant to the dairy sector. Bananas as economic importance According to statistics, bananas are one of the most traded fruits in the world.7 million tonnes of bananas accounted for almost 20% of world output.

The value of importing and exporting different strains of bananas reached approximately 11 billion USD, which is more than the export value of 4 any fruit. Among the nations known for their banana consumption, Asia is the greatest banana-producing geographical region, while Latin America and the Caribbean are the main exporting areas, accounting for about 80% of worldwide exports.