Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ nông nghiệp "Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ngọc Lan, chuyên ngành Di truyền và chọn giống cây trồng (mã số 9620111), dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy và PGS. TS. Lã Tuấn Nghĩa tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (năm 2020).

Về tính cấp thiết, các tỉnh miền Bắc Việt Nam sở hữu điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa cùng sự phân hóa địa hình, hình thành nhiều tiểu vùng sinh thái thích hợp cho phát triển cây ăn quả nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới. Đến nay, nhiều vùng sản xuất hàng hóa quy mô lớn đã được thiết lập như vải thiều tại Bắc Giang, Hải Dương; nhãn lồng tại Hưng Yên, Sơn La; bưởi tại Hà Nội, Phú Thọ, Bắc Giang; chuối tại Hưng Yên, Phú Thọ. Theo thống kê của Cục Trồng trọt - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn được nêu trong luận án, bốn loại cây ăn quả có diện tích và sản lượng lớn nhất gồm chuối (63.870 ha), vải (58.876 ha), nhãn (39.500 ha) và bưởi (34.286 ha).

Khoảng trống nghiên cứu xuất phát từ thực trạng phân loại thực vật truyền thống chủ yếu dựa trên các chỉ tiêu hình thái hoặc đặc tính sinh lý, sinh hóa. Phương pháp này bộc lộ nhiều hạn chế khi mẫu vật chưa phát triển đầy đủ giai đoạn sinh trưởng, bị biến dạng hoặc hư hỏng. Đánh giá hình thái đòi hỏi nhiều thời gian, dễ chịu tác động từ điều kiện ngoại cảnh nên nguy cơ sai số cao. Trong khi đó, việc nhận dạng các giống đặc sản nhằm phục vụ công tác bảo tồn, lưu giữ và bảo hộ thương hiệu đòi hỏi công cụ phân loại ở mức độ phân tử có độ tin cậy và tính ổn định cao. Mã vạch ADN chuẩn trên lục lạp đối với thực vật đôi khi không đủ mức độ sai khác để phân biệt các giống trong cùng một loài, đặt ra yêu cầu phải kết hợp giữa mã vạch chuẩn và mã vạch ADN mở rộng dựa trên đa hình đơn nucleotit (SNP).

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm 3 mục tiêu cụ thể được đánh số theo văn bản:

  1. Lựa chọn được mẫu đại diện nguồn gen bưởi, chuối, nhãn và vải bằng chỉ thị phân tử EST-SSR/SCoT để tiến hành xây dựng mã vạch ADN;
  2. Khuếch đại và giải trình tự được vùng gen lục lạp rbcL, matK để đánh giá đa dạng di truyền, từ đó xây dựng mã vạch ADN cho nguồn gen bưởi, chuối, nhãn và vải;
  3. Thiết lập được dữ liệu SNP bằng công nghệ GBS để xây dựng mã vạch ADN mở rộng các nguồn gen nghiên cứu.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Các giống/nguồn gen bưởi (Citrus maxima), chuối (Musa spp.), nhãn (Dimocarpus longan), và vải (Litchi chinensis) có giá trị kinh tế cao, phần lớn là giống đặc sản địa phương được thu thập, lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia thuộc Trung tâm Tài nguyên thực vật.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại các phòng thí nghiệm của Trung tâm Tài nguyên thực vật (An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội).
  • Phạm vi nội dung: Tập trung vào đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử, giải trình tự đoạn gen lục lạp chuẩn (rbcL, matK) và giải trình tự hệ gen thế hệ mới GBS để khai thác dữ liệu SNP phục vụ nhận diện giống.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bốn đối tượng cây ăn quả, kỹ thuật chỉ thị phân tử và hệ thống mã vạch ADN:

Đối với phân loại và nguồn gen cây trồng:

  • Cây bưởi (Citrus maxima): Tác giả trích dẫn hệ thống phân loại của Swingle (1948) chia chi Citrus thành bưởi Citrus grandis L. Osbeck và bưởi chùm Citrus paradisi Macf.; Phạm Hoàng Hộ (2000) ghi nhận 23 chi và 105 loài thuộc họ Cam Rutaceae tại Việt Nam; Lương Thị Kim Oanh (2011) phân tích tình hình sản xuất; Lê Tiến Hùng (2016) khảo sát các giống bưởi đặc sản bản địa (Phúc Trạch, Đoan Hùng, Diễn, Thanh Trà, Năm Roi, Da Xanh, Luận Văn).
  • Cây chuối (Musa spp.): Luận án điểm lại phân loại của Cheesman (1947), Argent và cộng sự (1976), Hakkinen (2013); hệ thống phân loại bộ nhiễm sắc thể của Simmonds và cộng sự (1955), Nayar (2010); phân nhóm giống chuối miền Bắc của Trần Thế Tục (1998); dữ liệu phân loại theo bộ gen của Valmayor và cộng sự (2002) trên cơ sở dữ liệu ProMusa.
  • Cây nhãn (Dimocarpus longan): Khảo cứu phân loại của Suranant và Raphael (2005) về các phân loài và dạng hoang dại; phân loại hình thái quả của Ngô Thế Dân (2011) và Nguyễn Văn Nghiêm (2011) chia thành nhóm nhãn cùi (nhãn lồng, đường phèn, Hương Chi) và nhóm nhãn nước (nhãn nước, nhãn thóc, tiêu da bò, xuồng cơm vàng).
  • Cây vải (Litchi chinensis): Trích dẫn phân loại hình thái của Leenhouts (1978), Suranant và cộng sự (2005) về 3 phân loài chính (chinensis, philippinensis, javensis); phân loại thời vụ của Trần Thế Tục (1998), Phạm Văn Duệ (2005), Đào Quang Nghị (2012), Vũ Thị Thanh Thủy (2010); các báo cáo quốc tế của Chen và cộng sự (2000), Karin và cộng sự (2020).

Đối với chỉ thị phân tử và mã vạch ADN:

  • Chỉ thị phân tử: Đánh giá vai trò của SSR, EST-SSR (Rudd, 2003; Ozgenturk và cs, 2010) và SCoT (Collard và cs, 2009; Chen và cs, 2010; Shangguo và cs, 2018).
  • Mã vạch ADN chuẩn: Khởi nguồn từ công trình của Paul Hebert và cộng sự (2003) đề xuất đoạn 648 bp gen CO1 trên ti thể động vật; khuyến nghị của CBOL Plant Working Group (2009) về việc sử dụng kết hợp rbcL và matK cho thực vật; nghiên cứu của nhóm tác giả China Plant BOL (2011) trên 1.757 loài; nghiên cứu trên cây có múi của Tshering và cộng sự (2010, 2013); nghiên cứu trên chuối của Lallawmawama (2012), Saifuldeen và cộng sự (2018); nghiên cứu trên nhãn của Suparat và cộng sự (2017).
  • Mã vạch ADN mở rộng và công nghệ NGS: Eric Coissac và cộng sự (2016) đề xuất khái niệm mã vạch mở rộng; Robert Elshire và cộng sự (2011) công bố phương pháp Genotyping-by-Sequencing (GBS); công bố hệ gen bưởi của Xia và cộng sự (2017); hệ gen nhãn của Yuling và cộng sự (2017); nghiên cứu SNP array trên Citrus của Hiroshi và cộng sự (2012), Amel và cộng sự (2017), Yuan và cộng sự (2018); ứng dụng GBS trên việt quất của Campa và cộng sự (2018).
  • Nghiên cứu mã vạch ADN tại Việt Nam: Điểm lại các công trình của Phan Kế Long và cộng sự (2014), Nông Văn Duy và cộng sự (2016), Lê Thị Thu Hiền và cộng sự (2016), Lê Thanh Hương trong việc định danh chi Nhân sâm (Panax).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Các nghiên cứu mã vạch ADN tại Việt Nam trước đây chủ yếu tập trung trên một số loài dược liệu (Panax), chưa triển khai đồng bộ trên các nguồn gen cây ăn quả chủ lực; đồng thời mã vạch chuẩn rbcL và matK gặp giới hạn trong việc phân biệt các giống cây trồng nội loài có quan hệ di truyền gần. Do đó, luận án xác định vị trí nghiên cứu là kết hợp chỉ thị phân tử để tuyển chọn mẫu đại diện, giải trình tự mã vạch lục lạp chuẩn và ứng dụng kỹ thuật GBS nhằm phát hiện tập hợp chỉ thị SNP đặc trưng cho từng giống bưởi, nhãn, vải.


Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về biến dị di truyền mức độ phân tử, nguyên lý mã vạch ADN chuẩn của Consortium for the Barcode of Life (CBOL) và khái niệm mã vạch ADN mở rộng (extended DNA barcode) sử dụng dữ liệu hệ gen thế hệ mới.

Khung phân tích và phương pháp thực tế được triển khai theo các hợp phần kỹ thuật:

Hợp phần nghiên cứu Chỉ thị / Vùng gen / Kỹ thuật Cặp mồi / Enzyme / Công cụ Đối tượng áp dụng
Đánh giá đa dạng di truyền EST-SSR CgEMS-31, CgEMS-36, CgEMS-138, CgEMS-139 Bưởi
Đánh giá đa dạng di truyền SCoT SCoT4, SCoT9, SCoT17, SCoT23, SCoT27, SCoT34 Chuối, Nhãn, Vải
Mã vạch ADN chuẩn Vùng gen rbcL Cặp mồi RbcLa-F / 724R Bưởi, Chuối, Nhãn, Vải
Mã vạch ADN chuẩn Vùng gen matK Cặp mồi Kim3F / 1R Bưởi, Chuối, Nhãn, Vải
Mã vạch ADN mở rộng Kỹ thuật GBS (Genotyping By Sequencing) Enzyme cắt giới hạn ApeKI; bộ mồi adapter và oligo barcode Bưởi, Nhãn, Vải

Phương pháp thực nghiệm chi tiết:

  • Tách chiết ADN: ADN tổng số được tách chiết từ mô lá non theo quy trình chuẩn của phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng điện di gel agarose và đo quang phổ.
  • Phân tích chỉ thị EST-SSR và SCoT: Phản ứng PCR khuếch đại các locut đặc hiệu; sản phẩm PCR được điện di trên bản gel để ghi nhận sự có mặt/vắng mặt của các băng ADN (alen). Từ đó lập ma trận nhị phân để tính toán hệ số tương đồng di truyền và dựng sơ đồ hình cây bằng phương pháp UPGMA.
  • Giải trình tự mã vạch chuẩn: Khuếch đại đoạn gen rbcL (với cặp mồi RbcLa-F/724R) và đoạn gen matK (với cặp mồi Kim3F/1R). Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự hai chiều theo phương pháp Sanger. Trình tự đọc được căn chỉnh, so sánh với các trình tự tham chiếu trên cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank và BOLD để xác định các vị trí đột biến thay thế nucleotit.
  • Kỹ thuật GBS xây dựng mã vạch mở rộng: Xử lý ADN hệ gen bằng enzym cắt giới hạn ApeKI; gắn adapter đặc hiệu chứa các đoạn mã nhận dạng (oligo barcode); trộn mẫu tạo thư viện GBS; khuếch đại thư viện bằng phản ứng PCR và tiến hành giải trình tự trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới NGS (Illumina).
  • Phần mềm và công cụ tin sinh học: Sử dụng các phần mềm chuyên dụng để xử lý dữ liệu đọc ngắn từ NGS, căn chỉnh trình tự với hệ gen tham chiếu (với các loài đã công bố hệ gen), lọc và xác định các vị trí đa hình đơn nucleotit (SNP). Cấu trúc quần thể di truyền của các giống được phân tích bằng phần mềm STRUCTURE; ma trận khoảng cách di truyền và tỷ lệ dị hợp tử được phân tích thông qua các thuật toán thống kê di truyền quần thể.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 cung cấp cơ sở lý luận và tổng hợp tình hình nghiên cứu gồm 4 nội dung chính:

  • Tổng quan về đặc điểm thực vật học, nguồn gốc, phân loại, hiện trạng sản xuất và công tác bảo tồn, lưu giữ nguồn gen của 4 đối tượng bưởi (Citrus maxima), chuối (Musa spp.), nhãn (Dimocarpus longan), và vải (Litchi chinensis) trên phạm vi thế giới và tại Việt Nam.
  • Khái quát lý thuyết về đa dạng di truyền và các thế hệ chỉ thị phân tử ADN, trong đó tập trung phân tích đặc tính của chỉ thị vi vệ tinh liên kết vùng biểu hiện (EST-SSR) và chỉ thị nhắm đích codon khởi đầu (SCoT).
  • Trình bày khái niệm mã vạch ADN, lịch sử phát triển từ mã vạch chuẩn dựa trên các đoạn gen lục lạp (rbcL, matK, trnH-psbA) và gen nhân (ITS) đến mã vạch mở rộng dựa trên dữ liệu giải trình tự thế hệ mới NGS.
  • Điểm luận các kết quả nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN chuẩn và kỹ thuật GBS trong nhận dạng loài, lập hồ sơ di truyền và phục vụ chọn tạo giống thực vật trên thế giới và tại Việt Nam.

Chương 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện thực nghiệm, bao gồm:

  • Vật liệu nghiên cứu: Danh mục các mẫu giống bưởi, chuối, nhãn và vải đang được lưu giữ tại Trung tâm Tài nguyên thực vật; danh sách hóa chất, enzym cắt giới hạn ApeKI, các cặp mồi khuếch đại EST-SSR, SCoT, mồi khuếch đại rbcL, matK, các bộ kit chuẩn bị thư viện và danh sách oligo barcode cho thí nghiệm GBS.
  • Nội dung nghiên cứu: Trình bày logic 4 bước thực nghiệm gồm (1) Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử để lựa chọn mẫu đại diện; (2) Giải trình tự và xây dựng mã vạch dựa trên vùng gen rbcL; (3) Giải trình tự và xây dựng mã vạch dựa trên vùng gen matK; (4) Xây dựng mã vạch mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS.
  • Phương pháp nghiên cứu: Ghi nhận quy trình thao tác tách chiết ADN; chu trình nhiệt PCR cho từng cặp mồi; phương pháp đọc gel và mã hóa alen; quy trình chuẩn bị thư viện GBS; các bước lắp ráp trình tự (assembly) và phương pháp phát hiện SNP.
  • Công cụ xử lý số liệu: Quy định các phần mềm tin sinh học dùng căn chỉnh trình tự, phần mềm STRUCTURE dùng mô phỏng cấu trúc quần thể di truyền, các công cụ tính toán ma trận khoảng cách di truyền và tỷ lệ dị hợp tử.
  • Địa điểm và thời gian: Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, xã An Khánh, huyện Hoài Đức, thành phố Hà Nội.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu và phân tích thực nghiệm qua 4 phần chính:

1. Đánh giá đa dạng di truyền và lựa chọn mẫu đại diện bằng chỉ thị phân tử

  • Đối với bưởi: Sử dụng 4 cặp mồi EST-SSR gồm CgEMS-31, CgEMS-36, CgEMS-138 và CgEMS-139. Kết quả điện di ghi nhận các alen đặc trưng cho từng giống bưởi nghiên cứu; xây dựng sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền, qua đó chọn lọc được các mẫu giống bưởi đại diện cho các nhánh phân loại để giải trình tự ADN.
  • Đối với chuối: Phân tích bằng chỉ thị SCoT với các mồi SCoT4, SCoT9 và SCoT17; ghi nhận tổng số alen và các alen đặc trưng; thiết lập sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ giữa các phân nhóm chuối tiêu, chuối tây, chuối ngự.
  • Đối với nhãn: Khảo sát các giống nhãn bằng các mồi SCoT23 và SCoT27; xác định mức độ đa hình phân tử giữa nhóm nhãn cùi và nhãn nước; lựa chọn các giống nhãn đại diện.
  • Đối với vải: Khảo sát các giống vải tại các chỉ thị SCoT17 và SCoT34; phân tích sơ đồ hình cây chia nhóm các giống vải chín sớm, chính vụ và chín muộn; xác định tập hợp mẫu vải đại diện.

2. Xây dựng mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen rbcL

  • Khuếch đại thành công đoạn gen rbcL bằng cặp mồi RbcLa-F/724R trên tất cả các mẫu giống bưởi, chuối, nhãn và vải.
  • So sánh trình tự rbcL giữa các giống nghiên cứu và so sánh với trình tự tham chiếu trên GenBank:
    • Bưởi: Xác định các vị trí nucleotit sai khác trong họ Rutaceae; xây dựng cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống bưởi.
    • Chuối: Phân tích trình tự đoạn gen rbcL của các giống chuối đại diện; xây dựng cây phân loại đối chiếu với các trình tự tham khảo trong họ Musaceae.
    • Nhãn: So sánh trình tự gen rbcL của các giống nhãn; xây dựng cây phân loại đối chiếu với trình tự tham khảo trong họ Sapindaceae.
    • Vải: Căn chỉnh trình tự rbcL của các giống vải; xác định khả năng phân loại ở mức độ loài và chi.
  • Bảng mã vị trí sai khác alen trên vùng gen rbcL cho thấy đoạn gen này có tính bảo tồn cao, thích hợp cho việc định danh ở mức độ loài hoặc chi, nhưng mức độ sai khác nucleotit giữa các giống nội loài còn hạn chế.

3. Xây dựng mã vạch ADN dựa trên vùng gen matK

  • Sử dụng cặp mồi Kim3F/1R khuếch đại thành công vùng gen matK trên các mẫu giống đại diện của 4 nguồn gen.
  • Phân tích trình tự đoạn gen matK:
    • Bưởi: Trình tự mã vạch matK ghi nhận một số vị trí biến đổi nucleotit; thiết lập cây phân loại giữa các giống bưởi nghiên cứu và các loài tham chiếu trong chi Citrus.
    • Chuối: Căn chỉnh trình tự matK, xây dựng cây phân loại cho các giống chuối đại diện.
    • Nhãn: Trình tự matK giúp phân biệt rõ các mẫu nhãn nghiên cứu với các trình tự nhãn tham chiếu trên cơ sở dữ liệu quốc tế.
    • Vải: Phân tích trình tự và xây dựng cây phân loại dựa trên đoạn matK của các giống vải.
  • Kết quả đối sánh cho thấy vùng gen matK có tốc độ đột biến cao hơn rbcL, cung cấp thêm các vị trí đa hình hỗ trợ phân loại sinh vật ở mức độ loài. Tuy nhiên, đối với việc phân biệt các giống bản địa có nguồn gốc gần nhau trong cùng một loài, số lượng đột biến trên matK vẫn chưa đủ để tạo mã vạch nhận diện riêng biệt cho từng giống.

4. Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS

Do mã vạch lục lạp chuẩn gặp giới hạn phân loại dưới loài, luận án triển khai giải trình tự GBS để tạo lập tập hợp SNP đặc trưng cho bưởi, nhãn và vải:

  • Kết quả trên cây bưởi:
    • Lắp ráp trình tự các đoạn đọc ngắn, tập hợp bản đồ lắp ráp cho các giống bưởi nghiên cứu.
    • Phát hiện và sàng lọc các vị trí SNP đặc trưng; lập bảng thống kê số lượng SNP nhận dạng cho từng giống bưởi.
    • Xây dựng mã vạch ADN dựa trên tổ hợp các SNP đặc trưng cho từng giống bưởi.
    • Thiết lập ma trận khoảng cách di truyền giữa các giống bưởi.
    • Phân tích cấu trúc quần thể bằng phần mềm STRUCTURE xác định giá trị tối ưu K = 6 (quần thể bưởi nghiên cứu được chia thành 6 cụm di truyền chính).
  • Kết quả trên cây nhãn:
    • Lắp ráp trình tự và xây dựng bản đồ tập hợp cho các giống nhãn.
    • Xác định các SNP đặc trưng cho từng giống nhãn; thiết lập bảng mã vạch SNP nhận diện riêng biệt.
    • Tính toán ma trận khoảng cách di truyền giữa các giống nhãn nghiên cứu.
    • Phân tích cấu trúc quần thể bằng STRUCTURE ghi nhận giá trị tối ưu K = 9 (quần thể nhãn nghiên cứu được phân chia thành 9 cụm di truyền).
  • Kết quả trên cây vải:
    • Lắp ráp dữ liệu trình tự GBS của các giống vải nghiên cứu; tập hợp bản đồ lắp ráp.
    • Xác định số lượng SNP đặc trưng nhận dạng cho từng giống vải nghiên cứu; thiết lập bảng mã vạch ADN dựa trên SNP.
    • Tính toán ma trận khoảng cách di truyền và tỷ lệ dị hợp tử của các giống vải.
    • Phân tích cấu trúc quần thể bằng STRUCTURE xác định giá trị K = 3 (các giống vải nghiên cứu phân bố thành 3 cụm di truyền).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự xác định các đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và giá trị thực tiễn như sau:

Về mặt khoa học:

  • Cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống về phân loại phân tử đối với bốn nguồn gen cây ăn quả đặc sản có giá trị kinh tế của Việt Nam gồm bưởi, chuối, nhãn và vải đang được bảo tồn tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia.
  • Xác lập được bộ dữ liệu trình tự vùng gen lục lạp chuẩn (rbcL, matK) của các giống bưởi, chuối, nhãn, vải bản địa, phục vụ việc đối chiếu với cơ sở dữ liệu phân loại học phân tử quốc tế.
  • Ứng dụng thành công công nghệ giải trình tự thế hệ mới GBS (Genotyping By Sequencing) trong việc phát hiện các vị trí đa hình đơn nucleotit (SNP) trên toàn hệ gen, xây dựng thành công bộ mã vạch ADN mở rộng có khả năng nhận dạng và phân biệt chính xác từng giống bưởi, nhãn, vải ở mức độ dưới loài.
  • Cung cấp thông tin cấu trúc di truyền quần thể của các tập đoàn giống bưởi (K = 6), nhãn (K = 9) và vải (K = 3) bằng công cụ STRUCTURE, làm sáng tỏ mức độ sai khác di truyền và tỷ lệ dị hợp tử của các nguồn gen nghiên cứu.

Về mặt thực tiễn:

  • Cung cấp cơ sở dữ liệu chỉ thị phân tử phục vụ trực tiếp cho công tác quản lý, giám sát và định danh sớm các nguồn gen cây ăn quả quý hiếm tại Trung tâm Tài nguyên thực vật mà không cần chờ cây ra hoa, kết quả.
  • Hỗ trợ công tác bảo hộ quyền đối với giống cây trồng, đăng ký chỉ dẫn địa lý và bảo hộ thương hiệu các giống cây ăn quả đặc sản địa phương (như bưởi Diễn, bưởi Phúc Trạch, nhãn lồng Hưng Yên, vải thiều Thanh Hà).
  • Cung cấp dẫn liệu phân tử hỗ trợ giải quyết các tranh chấp về thương hiệu, tên gọi và nguồn gốc giống cây ăn quả trên thị trường; hỗ trợ các chương trình phục tráng giống đặc sản và định hướng lựa chọn vật liệu khởi đầu trong công tác lai tạo giống.

Kiến nghị của luận án:

  • Kiến nghị tiếp tục mở rộng áp dụng quy trình xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS cho các đối tượng cây ăn quả và cây trồng đặc sản khác đang lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia.
  • Đề xuất tích hợp cơ sở dữ liệu mã vạch ADN chuẩn và mã vạch mở rộng vào hệ thống quản lý thông tin tài nguyên di truyền thực vật nhằm phục vụ kiểm định, chứng nhận giống và bảo hộ chỉ dẫn địa lý ở quy mô quốc gia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung và phạm vi nghiên cứu được văn bản luận án phản ánh:

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Nguồn vật liệu nghiên cứu mới chỉ tập trung vào tập hợp các mẫu giống đang được thu thập, lưu giữ tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, chưa bao hàm toàn bộ các biến dị kiểu hình và sinh thái của bốn loài cây này trên tất cả các tiểu vùng sinh thái nông nghiệp trên toàn quốc.
  • Hợp phần mã vạch mở rộng sử dụng công nghệ GBS mới được triển khai thành công trên 3 đối tượng (bưởi, nhãn, vải); đối với cây chuối, nghiên cứu mới dừng lại ở việc đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị SCoT và phân tích trình tự vùng gen lục lạp (rbcL, matK), chưa có dữ liệu GBS do độ phức tạp về hệ gen đa bội của chi Musa.
  • Phương pháp GBS và xử lý dữ liệu lớn (big data) đòi hỏi chi phí giải trình tự cao, hạ tầng tin sinh học phức tạp và phụ thuộc vào chất lượng của hệ gen tham chiếu đã công bố (vốn chưa hoàn thiện cho tất cả các giống bản địa).

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng thu thập thêm các dòng, giống địa phương tại các vùng sinh thái đặc thù nhằm hoàn thiện cơ sở dữ liệu mã vạch ADN cho toàn bộ tập đoàn cây ăn quả Việt Nam.
  • Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình phân tích GBS và thiết lập mã vạch ADN mở rộng cho đối tượng chuối (Musa spp.).
  • Phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh hoặc các thẻ chỉ thị SNP chọn lọc dựa trên tập hợp SNP đặc trưng đã phát hiện, nhằm giảm chi phí kiểm tra và thuận tiện cho việc ứng dụng tại hiện trường phục vụ kiểm định giống cây trồng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cụ thể cho các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Di truyền học, Chọn giống cây trồng, Công nghệ sinh học nông nghiệp và Thực vật học: Có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa chỉ thị phân tử truyền thống (EST-SSR, SCoT) với giải trình tự gen lục lạp (rbcL, matK) và công nghệ giải trình tự thế hệ mới GBS.
  • Cán bộ nghiên cứu tại các viện, trung tâm lưu giữ tài nguyên di truyền thực vật: Sử dụng quy trình kỹ thuật chuẩn bị thư viện GBS với enzym ApeKI, các bộ mồi và quy trình phân tích tin sinh học để số hóa và quản lý ngân hàng gen.
  • Cơ quan quản lý nhà nước về trồng trọt, sở hữu trí tuệ và bảo hộ giống cây trồng: Sử dụng bảng mã các vị trí sai khác alen trên vùng rbcL, matK và danh mục các SNP đặc trưng làm căn cứ kỹ thuật phục vụ công tác cấp bằng bảo hộ giống, chứng nhận xuất xứ nguồn gốc và xác nhận chỉ dẫn địa lý.

Các phần đáng tham khảo trực tiếp trong văn bản:

  • Danh mục và trình tự các cặp mồi EST-SSR (CgEMS-31, CgEMS-36, CgEMS-138, CgEMS-139), mồi SCoT và mồi khuếch đại gen lục lạp (RbcLa-F/724R, Kim3F/1R) tại Chương 2.
  • Quy trình chuẩn bị thư viện GBS và danh sách oligo barcode bố trí cho thí nghiệm giải trình tự NGS tại Chương 2.
  • Bảng mã vị trí sai khác alen trên gen rbcL, matK và bảng số lượng SNP đặc trưng cho từng giống bưởi, nhãn, vải tại Chương 3.
  • Kết quả mô phỏng cấu trúc quần thể di truyền (K = 6 cho bưởi, K = 9 cho nhãn, K = 3 cho vải) tại Chương 3.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao luận án không chỉ dùng mã vạch ADN chuẩn (rbcL, matK) mà phải phát triển mã vạch ADN mở rộng bằng công nghệ GBS?
Trả lời: Vùng gen lục lạp chuẩn rbcL và matK có tính bảo tồn cao, thích hợp để định danh ở mức độ họ, chi và loài. Tuy nhiên, đối với các đối tượng nghiên cứu là các giống cây ăn quả bản địa thuộc cùng một loài (Citrus maxima, Dimocarpus longan, Litchi chinensis), mức độ sai khác nucleotit trên rbcL và matK rất thấp, không đủ độ đa hình để phân biệt giữa các giống. Do đó, luận án phải ứng dụng công nghệ GBS để quét đa hình đơn nucleotit (SNP) trên quy mô toàn hệ gen, tạo ra mã vạch mở rộng nhận dạng riêng biệt cho từng giống.

2. Bộ chỉ thị phân tử nào được tác giả lựa chọn để sàng lọc mẫu đại diện ban đầu cho từng loại cây trồng?
Trả lời: Tác giả sử dụng chỉ thị vi vệ tinh vùng biểu hiện EST-SSR (với 4 cặp mồi CgEMS-31, CgEMS-36, CgEMS-138, CgEMS-139) cho các giống bưởi; và sử dụng chỉ thị nhắm đích codon khởi đầu SCoT cho chuối (SCoT4, SCoT9, SCoT17), nhãn (SCoT23, SCoT27) và vải (SCoT17, SCoT34). Các chỉ thị này tạo dữ liệu đa hình để vẽ sơ đồ hình cây, từ đó chọn ra các mẫu đại diện tiêu biểu nhất cho các nhánh di truyền để giải trình tự.

3. Kỹ thuật chuẩn bị thư viện GBS trong luận án sử dụng loại enzym cắt giới hạn nào và giải trình tự trên hệ thống nào?
Trả lời: Kỹ thuật GBS trong luận án sử dụng enzym cắt giới hạn ApeKI để cắt giảm độ phức tạp của hệ gen, sau đó gắn các đoạn adapter chứa oligo barcode đặc hiệu cho từng mẫu, khuếch đại bằng phản ứng PCR và tiến hành giải trình tự trên nền tảng giải trình tự thế hệ mới NGS (Illumina).

4. Kết quả phân tích cấu trúc quần thể di truyền bằng phần mềm STRUCTURE trên các dữ liệu SNP thu được những giá trị K nào?
Trả lời: Phân tích STRUCTURE xác định cấu trúc quần thể di truyền tối ưu tại các locut SNP như sau: đối với các giống bưởi đạt giá trị K = 6 (phân thành 6 cụm); đối với các giống nhãn đạt giá trị K = 9 (phân thành 9 cụm); và đối với các giống vải đạt giá trị K = 3 (phân thành 3 cụm di truyền).

5. Cặp mồi nào được tác giả sử dụng để nhân bản thành công hai vùng gen lục lạp rbcL và matK?
Trả lời: Để khuếch đại vùng gen lục lạp rbcL, tác giả sử dụng cặp mồi RbcLa-F/724R; đối với vùng gen lục lạp matK, tác giả sử dụng cặp mồi Kim3F/1R. Cả hai cặp mồi này đều nhân bản thành công sản phẩm PCR trên cả 4 nguồn gen nghiên cứu (bưởi, chuối, nhãn và vải).


Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ngọc Lan đã hoàn thành việc xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN chuẩn và mã vạch ADN mở rộng cho bốn nguồn gen cây ăn quả có giá trị kinh tế cao của Việt Nam gồm bưởi, chuối, nhãn và vải. Bằng việc kết hợp hiệu quả giữa chỉ thị phân tử (EST-SSR, SCoT), giải trình tự vùng gen lục lạp (rbcL, matK) và công nghệ giải trình tự thế hệ mới GBS, công trình đã giải quyết được hạn chế của phương pháp nhận dạng hình thái truyền thống và khắc phục độ phân giải thấp của mã vạch chuẩn đối với các phân loại dưới loài. Kết quả phân tích cấu trúc quần thể và danh mục các vị trí SNP đặc trưng cung cấp công cụ nhận diện phân tử phục vụ thiết thực cho công tác bảo tồn nguồn gen, chọn tạo giống và bảo hộ chỉ dẫn địa lý cây trồng đặc sản bản địa. Đây là tài liệu khoa học có độ tin cậy cao, đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho lĩnh vực di truyền và chọn giống cây trồng tại Việt Nam.