Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên s của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn pedv trên cây thuốc lá nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hướng tạo vacxin thế hệ mới

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo kháng nguyên s của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn pedv trên cây thuốc lá, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Hồ Thị Thương
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu kháng nguyên S của virus PEDV trên cây thuốc lá để phát triển vacxin mới
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu kháng nguyên S của virus PEDV

Nghiên cứu kháng nguyên S của virus PEDV trên cây thuốc lá là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển vacxin mới. Virus PEDV gây ra bệnh tiêu chảy cấp ở lợn, với tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở lợn con. Việc tìm hiểu về kháng nguyên S giúp xác định các mục tiêu tiềm năng cho việc phát triển vacxin hiệu quả hơn. Cây thuốc lá, đặc biệt là giống Nicotiana benthamiana, đã được chứng minh là một hệ thống biểu hiện hiệu quả cho các protein tái tổ hợp.

1.1. Khái niệm về virus PEDV và bệnh tiêu chảy cấp ở lợn

Virus PEDV là tác nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy cấp ở lợn, dẫn đến thiệt hại kinh tế lớn. Bệnh này có thể lây lan nhanh chóng và gây tử vong cao, đặc biệt ở lợn con dưới 7 ngày tuổi.

1.2. Tầm quan trọng của kháng nguyên S trong phát triển vacxin

Kháng nguyên S của virus PEDV là yếu tố quyết định trong việc phát triển vacxin. Nó tương tác với các thụ thể tế bào, tạo ra phản ứng miễn dịch cần thiết để bảo vệ lợn khỏi bệnh.

II. Thách thức trong việc phát triển vacxin phòng virus PEDV

Việc phát triển vacxin phòng virus PEDV gặp nhiều thách thức. Các chủng virus mới xuất hiện có sự khác biệt về gen so với các chủng trong vacxin hiện tại, dẫn đến hiệu quả bảo vệ thấp. Hơn nữa, việc sản xuất vacxin truyền thống thường tốn kém và không đáp ứng kịp thời với sự bùng phát dịch bệnh.

2.1. Sự khác biệt giữa các chủng virus PEDV

Các chủng virus PEDV mới có thể có sự khác biệt lớn về trình tự gen, ảnh hưởng đến khả năng trung hòa của vacxin hiện tại. Điều này làm giảm hiệu quả bảo vệ của vacxin trên thực địa.

2.2. Chi phí và thời gian sản xuất vacxin truyền thống

Sản xuất vacxin truyền thống thường yêu cầu nhiều thời gian và chi phí cao. Điều này gây khó khăn trong việc đáp ứng nhanh chóng với các đợt bùng phát dịch bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu kháng nguyên S trên cây thuốc lá

Nghiên cứu kháng nguyên S của virus PEDV được thực hiện thông qua phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá. Phương pháp này cho phép sản xuất nhanh chóng các protein tái tổ hợp với số lượng lớn, giúp đáp ứng kịp thời với dịch bệnh. Cây thuốc lá N. benthamiana đã được sử dụng để biểu hiện kháng nguyên S, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển vacxin mới.

3.1. Quy trình biểu hiện kháng nguyên S trong cây thuốc lá

Quy trình biểu hiện kháng nguyên S bao gồm việc sử dụng hệ thống agro-infiltration để đưa gen mã hóa kháng nguyên vào cây thuốc lá. Điều này giúp tạo ra protein tái tổ hợp một cách hiệu quả.

3.2. Phân tích mức độ biểu hiện kháng nguyên S

Mức độ biểu hiện của kháng nguyên S được phân tích bằng các phương pháp như SDS-PAGE và Western blot. Những phương pháp này giúp xác định sự thành công trong việc sản xuất protein tái tổ hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng nguyên S tái tổ hợp có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch ở chuột và lợn. Việc sử dụng cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên S không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn tăng cường khả năng sản xuất vacxin. Những kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vacxin phòng virus PEDV.

4.1. Đánh giá khả năng gây miễn dịch của kháng nguyên S

Kháng nguyên S tái tổ hợp đã cho thấy khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG, IgA và IgM ở chuột. Điều này chứng tỏ tiềm năng của kháng nguyên S trong việc phát triển vacxin.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất vacxin phòng PEDV

Việc sản xuất kháng nguyên S từ cây thuốc lá có thể được áp dụng để phát triển vacxin phòng PEDV. Điều này không chỉ giúp giảm chi phí mà còn tăng cường khả năng đáp ứng nhanh chóng với dịch bệnh.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu kháng nguyên S của virus PEDV trên cây thuốc lá mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển vacxin hiệu quả. Những kết quả đạt được cho thấy tiềm năng của phương pháp này trong việc sản xuất vacxin phòng bệnh tiêu chảy cấp ở lợn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp mới cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng nguyên S tái tổ hợp có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Điều này cho thấy tiềm năng của nó trong việc phát triển vacxin mới.

5.2. Hướng đi tương lai trong phát triển vacxin

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả của vacxin trong thực địa. Điều này sẽ giúp đảm bảo an toàn cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Tiêu chảy cấp ở lợn hay tiêu chảy thành dịch (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một bệnh nguy hiểm và có khả năng lây lan trên lợn ở tất cả các độ tuổi. Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), một loại virus thuộc họ Coronaviridae, là tác nhân gây ra bệnh PED. Tỷ lệ tử vong ở lợn cao, lên đến 80-100% sau khi mắc bệnh PED, đặc biệt ở lợn con mới sinh dưới 7 ngày tuổi [1]. Dịch PED đã bùng phát và gây ra tổn thất kinh tế nghiêm trọng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là Châu Á và Châu Mỹ [2].

Tại Việt Nam, dịch PED đã có mặt ở nhiều tỉnh thành khắp cả nước [3]. Các chủng PEDV được phát hiện tại ba miền Bắc, Trung, Nam từ năm 2015 đến năm 2016 thuộc về nhóm gen G1b, G2a và G2b [4]. Các chủng PEDV G2 đã gây ảnh hưởng đến kinh tế nghiêm trọng, làm giảm năng suất đàn lợn nái và lợn giống ở nhiều tỉnh thành [5]. Hiện nay, hầu hết các vacxin phòng PEDV được sử dụng ở Việt Nam là vacxin truyền thống có nguồn gốc ngoại nhập hoặc sử dụng các chủng nhập khẩu thuộc nhóm G1a cổ điển để sản xuất vacxin.

Sự khác biệt trong trình tự bộ gen của các chủng PEDV mới bùng phát và các chủng PEDV trong vacxin, đặc biệt là ở các thụ thể trung hòa, dẫn đến vacxin hiện tại có hiệu quả bảo hộ thấp chống lại các chủng PEDV trên thực địa [3]. Vì vậy, để đảm bảo an toàn cho ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam, cần có những nghiên cứu phát triển vacxin phòng PEDV, đặc biệt là các chủng virus thuộc nhóm G2 gây bệnh thực địa. Vacxin tiểu đơn vị được tạo ra nhờ sử dụng hệ thống thực vật có nhiều lợi thế bao gồm mức đầu tư sản xuất thấp, dễ dàng nhân rộng, độ ổn định cao và thời hạn sử dụng lâu dài [6]. Phương pháp biểu hiện tạm thời dựa trên agro-infiltration có lợi thế trong việc sản xuất các protein tái tổ hợp nhanh chóng với số lượng lớn, điều này cho phép phản ứng kịp thời khi xảy ra các dịch bệnh [7].

Protein S của PEDV là nhân tố không thể thiếu trong tương tác của virus với các thụ thể tế bào [8] và được xem là mục tiêu chính để phát triển vacxin [9]. Vùng CO-26K equivalent (COE) (aa 499-638) là một vùng quyết định kháng nguyên trên protein S của PEDV phản ứng với kháng thể trung hòa [8] và được nhận diện bởi kháng thể đơn dòng 2C10 ở đầu C của protein S [10]. Kháng nguyên COE được xem là mục tiêu chính để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV [11]. Vùng COE đã được nghiên cứu biểu hiện trên hệ thống thực vật trong nhiều công bố trước đây [12, 13].

Protein COE tái tổ hợp ở dạng monomer có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên chuột. Dạng cấu trúc pentamer của COE đã được biểu hiện thành công nhưng chưa có các đánh giá về khả năng gây miễn dịch [12]. 2 Ngoài vùng COE thuộc protein S của PEDV, vùng S1D (aa 636-789) có 2 vùng được nhận biết bởi thụ thể tế bào lympho B là SS2 (aa 748-755) và vùng SS6 (aa 764-771) cũng là các vùng kháng nguyên quan trọng tương tác với các kháng thể có khả năng trung hòa [14]. Thêm vào đó, tiểu phần S2 có chứa các vùng kháng nguyên tương tác với các kháng thể có khả năng trung hòa virus bao gồm các aa 744-759, các aa 747-774, các aa 756-771 và các aa 1371-1377 [15].

Tiểu phần S2 đã được biểu hiện dưới dạng từng phần hoặc đầy đủ trong E. Chuột được tiêm tiểu phần S2 có sự hiện diện của các kháng thể có khả năng trung hòa PEDV [16]. Protein S đã được phát hiện có sự biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá N. benthamiana ở mức độ thấp [18] hoặc không biểu hiện [19].

Toàn bộ protein S1 dung hợp motif GCN4pII (pII) đã được báo cáo có mức độ biểu hiện tạm thời tương đối thấp trong cây thuốc lá N. benthamiana, chỉ đạt 0,005% protein hòa tan tổng số (TSP) [20]. Tính đến nay, chưa có công bố nào ở trong và ngoài nước nghiên cứu về việc biểu hiện vùng COE (aa 499-638), COE-S1D (aa 499-789) hoặc S2 (aa 730- 1324) thuộc protein S dung hợp motif GCN4pII hoặc dung hợp motif GCN4pII-tp trên hệ thống cây thuốc lá N. benthamiana cũng như chứng minh được tính sinh miễn dịch của các protein này trên động vật.

Chính vì vậy, một số câu hỏi nghiên cứu lần lượt được đặt ra trong khuôn khổ của luận án bao gồm: i). Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G1a dung hợp motif GCN4pII (viết tắt COE/G1a-pII) trên cây thuốc lá N. benthamiana có tính sinh miễn dịch tương đương với vacxin thương mại sẵn có chứa chủng PEDV thuộc nhóm G1a hay không? ii). Liệu có tạo được kháng nguyên COE tái tổ hợp của chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (viết tắt là COE/G2a-pII) trên cây thuốc lá N.

benthamiana có tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ tốt hay không? iii). Liệu có tạo ra được các kháng nguyên tái tổ hợp khác như kháng nguyên COE-S1D, S2 từ chủng PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII (lần lượt viết tắt là COE-S1D/G2a-pII và S2/G2a-pII) và kháng nguyên COE từ PEDV G2a gây bệnh tại Việt Nam dung hợp motif GCN4pII-tp (viết tắt là COE/G2a-pII-tp) trên cây thuốc lá N. benthamiana có mức độ biểu hiện và tính sinh miễn dịch tốt hơn kháng nguyên COE/G2a-pII hay không? Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‗Nghiên cứu tạo kháng nguyên S của virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (PEDV) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana có tính sinh miễn dịch định hƣớng tạo vacxin thế hệ mới‘. 3 Mục tiêu nghiên cứu của luận án Tạo được kháng nguyên S tái tổ hợp của PEDV từ cây thuốc lá N.

benthamiana và đánh giá tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm phục vụ phát triển vacxin. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Nội dung 1: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G1a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G1a Nội dung 2: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên COE/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam Nội dung 3: Tạo và đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên COE- S1D/G2a-pII, COE/G2a-pII-tp và S2/G2a-pII tái tổ hợp từ chủng PEDV thuộc nhóm G2a gây bệnh tại Việt Nam Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Các chủng PEDV thuộc nhóm G2 đang là tác nhân gây bệnh chính trong các đợt dịch PED tại Việt Nam. Việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả phòng các chủng PEDV thuộc nhóm G2 gây bệnh ở Việt Nam là điều vô cùng cần thiết. Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy các protein tái tổ hợp được tạo ra trên cây thuốc lá N.

benthamiana sử dụng công nghệ biểu hiện tạm thời như COE/G2a-pII, COE-S1D/G2a-pII và COE/G2a-pII-tp đều tính kháng nguyên cao, tính sinh miễn dịch tốt và có thể là các ứng viên vacxin đầy triển vọng định hướng ứng dụng trong công tác phòng chống PED tại Việt Nam. Những đóng góp mới của luận án Luận án đã nghiên cứu một cách hệ thống về tạo kháng nguyên COE tái tổ hợp từ chủng PEDV DR13 nhược độc thuộc nhóm G1a và các kháng nguyên COE, COE-S1D và S2 tái tổ hợp từ chủng NAVET/PEDV/PS6/2010 độc lực cao thuộc nhóm G2a gây bệnh thực địa tại Việt Nam dung hợp motif pII hoặc motif pII-tp trên cây thuốc lá N. benthamiana bằng công nghệ biểu hiện tạm thời; và đã đánh giá được đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp tạo ra trên động vật thử nghiệm. Kháng nguyên COE/G2a-pII tiêm cho lợn nái (100µg/liều) có khả năng bảo vệ lợn con sinh ra từ lợn nái chống lại PEDV sau công cường độc.

Kháng nguyên COE-S1D/G2a-pII (50µg/liều) kèm chất bổ trợ Emulsigen®-D (MVP) đã kích thích sinh đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu PEDV mạnh hơn, đồng thời sinh đáp ứng kháng thể IgA đặc hiệu PEDV có khả năng trung hòa PEDV tương đương vacxin thương mại Corning (Wuhan Keqian Biology). Đây là các ứng viên tiềm năng để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng PEDV gây bệnh tại Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh tiêu chảy cấp ở lợn 1.

Tình hình dịch bệnh PED trên thế giới Từ sau khi được báo cáo về sự xuất hiện lần đầu ở Anh và Bỉ năm 1970, dịch bệnh PED tiếp tục được phát hiện ở nhiều nước khác ở Châu Âu, Châu Á và Châu Mỹ. Dịch bệnh PED nghiêm trọng được phát hiện ở Nhật Bản và Hàn Quốc vào các năm 1980 và 1990 [2]. Trong cùng khoảng thời gian đó, ở Châu Âu, các đợt bùng phát PED xuất hiện không thường xuyên nhưng tác nhân gây bệnh PED tiếp tục lây lan và tồn tại ở dạng đặc hữu trong quần thể lợn. Sự bùng phát của PED đã được quan sát thấy ở Hà Lan vào năm 1989–1991, ở Hungary vào năm 1995, và ở Anh vào năm 1998.

Dịch bệnh PED lây lan và được phát hiện có tỷ lệ gây chết cao trên lợn con mới đẻ ở Ý vào các năm 2005–2006 [21]. Tại Mỹ, bệnh PED được báo cáo lần đầu tiên vào tháng 4/2013. Tác nhân gây bệnh PED đã thoát khỏi các các hệ thống kiểm soát và an toàn sinh học, lây lan rất nhanh chóng đến các khu vực khác và lây nhiễm cho hàng trăm trang trại. Đến tháng 3/2015, sự hiện diện của bệnh PED đã được xác nhận tại 31 tiểu bang của Mỹ.

Dịch bệnh PED dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể tại Mỹ, với gần 10% số lợn (bảy triệu con lợn) đã bị chết do dịch PED gây ra, gây thiệt hại gần 440 triệu USD [22]. Bệnh PED có các dấu hiệu đặc trưng như tiêu chảy nhiều nước, mất nước, và nôn mửa liên tục. Tất cả các con lợn đều bị ảnh hưởng bởi dịch PED, nhưng tỷ lệ chết ở lợn sữa đạt tới 95-100% [23]. Tại Châu Âu, bệnh PED không nằm trong danh sách các bệnh được thống kê ở Tổ chức Thú y thế giới (World Organisation for Animal Health, WOAH), do đó rất khó để mô tả chính xác sự xuất hiện của bệnh này trong Châu Âu.

Trong 10 năm qua, chỉ một số quốc gia có các trường hợp lâm sàng được báo cáo về PED và/hoặc có huyết thanh lợn dương tính với PEDV [24]. Các đợt bùng phát dịch PED ở Châu Âu có các đặc điểm khác biệt so với dịch bệnh PED được phát hiện ở Mỹ hoặc Châu Á.