Luận văn thạc sĩ nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất

• Tác giả: Hoàng Thị Hồng Hạnh
• Người hướng dẫn: Phan Thị Hồng Phúc
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
• MỤC LỤC
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Tính cấp thiết của của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC
• 2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
• 2.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 2.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
• 2.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• 2.1.5. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 2.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa
• 2.2. VECTOR TÁCH DÒNG
• 2.2.1. Các loại vector tách dòng
• 2.3. VECTOR BIỂU HIỆN
• 2.3.1. Các hệ thống biểu hiện gen
• 3. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
• 3.2. Chủng vi khuẩn và plasmid
• 3.3. Các bộ sinh phẩm, thang chuẩn
• 3.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị
• 3.5. Môi trường và đệm
• 3.6. Cặp mồi sử dụng
• 3.7. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 3.7.1. Phương pháp nghiên cứu. Các phương pháp nghiên cứu
• 3.7.2. Phương pháp biểu hiện
• 3.7.3. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
• 3.7.4. Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
• 3.7.5. Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
• 3.7.6. Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
• 3.7.7. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA
• 3.7.8. Xác định độ lặp lại của kết quả phản ứng ELISA
• 4. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET-RoTAT
• 4.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.2.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT
• 4.2.2. Nghiên cứu xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện
• 4.2.3. Nghiên cứu xác định nhiệt độ tăng sinh chủng biểu hiện
• 4.2.4. Nghiên cứu xác định mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT
• 4.2.5. Nghiên cứu xác định độ pH phù hợp để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT
• 4.2.6. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.3. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.4. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT xây dựng quy trình phản ứng ELISA phát hiện bệnh tiên mao trùng
• 4.4.1. Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA
• 4.4.2. Khảo sát tác nhân block giếng
• 4.4.3. Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của T.evansi và anti-bovine IgG:HRPO
• 4.4.4. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA
• 4.4.5. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng
• 4.4.6. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu bò nghi nhiễm tiên mao trùng
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi

Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi tập trung vào việc xác định và phân tích các kháng nguyên bề mặt của loài ký sinh trùng này. Trypanosoma evansi là tác nhân gây bệnh tiên mao trùng ở gia súc, đặc biệt là trâu, bò và ngựa. Các kháng nguyên bề mặt như RoTAT 1.2 được nghiên cứu kỹ lưỡng do vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ miễn dịch của vật chủ. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp biểu hiện gen để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp, giúp tăng độ tinh khiết và hiệu quả trong chẩn đoán bệnh. Kết quả cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với kháng nguyên tự nhiên, mở ra hướng ứng dụng trong sản xuất kít chẩn đoán.

1.1. Đặc điểm kháng nguyên bề mặt

Kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi bao gồm hai loại chính: kháng nguyên ổn định và kháng nguyên biến đổi. Kháng nguyên ổn định như ISG 65, ISG 75 và ISG 100 không thay đổi trong quá trình ký sinh, trong khi kháng nguyên biến đổi như VSG (Variant Surface Glycoprotein) có khả năng thay đổi để né tránh hệ miễn dịch của vật chủ. RoTAT 1.2 là một kháng nguyên bề mặt đặc trưng của Trypanosoma evansi, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh.

1.2. Phương pháp biểu hiện gen

Phương pháp biểu hiện gen được áp dụng để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2. Quá trình này bao gồm việc tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt và biểu hiện trong hệ thống tế bào chủ như E. coli. Kết quả thu được là kháng nguyên tái tổ hợp có độ tinh khiết cao, phù hợp để sử dụng trong sản xuất kít chẩn đoán. Phương pháp này khắc phục được hạn chế của kháng nguyên tự nhiên, vốn dễ gây phản ứng dương tính giả.

II. Ứng dụng kháng nguyên trong sản xuất kít chẩn đoán

Ứng dụng kháng nguyên trong sản xuất kít chẩn đoán là bước quan trọng để phát hiện sớm và chính xác bệnh tiên mao trùng ở gia súc. Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được sử dụng làm thành phần chính trong kít chẩn đoán, giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Nghiên cứu đã xây dựng quy trình phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp, cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Kít chẩn đoán này có tiềm năng lớn trong việc thay thế các sản phẩm nhập khẩu, giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận cho người chăn nuôi.

2.1. Quy trình sản xuất kít chẩn đoán

Quy trình sản xuất kít chẩn đoán bao gồm các bước: tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp, chuẩn bị các thành phần của kít như kháng thể, chất nền và dung dịch đệm. Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được sử dụng làm thành phần chính để phát hiện kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi trong mẫu máu gia súc. Quy trình này đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam.

2.2. Đánh giá hiệu quả kít chẩn đoán

Kít chẩn đoán được đánh giá thông qua các thử nghiệm về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại. Kết quả cho thấy kít có khả năng phát hiện chính xác bệnh gia súc với tỷ lệ dương tính cao. So sánh với phương pháp PCR, kít chẩn đoán cho kết quả tương đương nhưng có ưu điểm về thời gian và chi phí. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng rộng rãi của kít chẩn đoán trong thực tiễn chăn nuôi.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học lớn khi cung cấp thông tin chi tiết về kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi và quy trình sản xuất kít chẩn đoán. Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp không chỉ giúp chẩn đoán nhanh chóng mà còn góp phần kiểm soát và phòng ngừa bệnh tiên mao trùng ở gia súc. Về mặt thực tiễn, việc sản xuất kít chẩn đoán trong nước giúp giảm chi phí, tăng khả năng tiếp cận cho người chăn nuôi, đồng thời thúc đẩy ngành thú y phát triển bền vững.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã làm sáng tỏ cấu trúc và chức năng của kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi, đặc biệt là RoTAT 1.2. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiện đại, góp phần vào sự hiểu biết sâu sắc hơn về bệnh tiên mao trùng.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Việc sản xuất thành công kít chẩn đoán trong nước giúp giảm sự phụ thuộc vào sản phẩm nhập khẩu, tiết kiệm chi phí và tăng hiệu quả chẩn đoán. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh gia súc, góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh tiên mao trùng do ký sinh trùng Trypanosoma evansi (T. evansi) gây ra là một trong những bệnh ký sinh trùng đường máu phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và năng suất của gia súc như trâu, bò, ngựa. Tỷ lệ mắc bệnh ở trâu dao động từ 13 – 30%, ở bò từ 7 – 14%, với tỷ lệ tử vong trong số gia súc mắc bệnh lên tới 6,3 – 20%. Bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi do làm giảm sản lượng thịt, sữa và sức kéo. Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng phổ biến gồm chẩn đoán truyền thống, huyết thanh học và sinh học phân tử. Trong đó, phương pháp huyết thanh học được đánh giá cao về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng xử lý số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, Việt Nam hiện vẫn phải nhập khẩu Kít chẩn đoán với chi phí cao, hạn chế khả năng ứng dụng rộng rãi.

Mục tiêu nghiên cứu là sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong nước với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thông qua biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T. evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp này trong kỹ thuật ELISA. Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội trong khoảng thời gian từ tháng 5/2012 đến tháng 6/2013. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp thông tin về biểu hiện gen kháng nguyên bề mặt của T. evansi và ý nghĩa thực tiễn trong việc chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kít chẩn đoán nhanh, chính xác, góp phần nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh tiên mao trùng ở gia súc tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi: Kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên ổn định, không biến đổi, có kích thước khoảng 215 bp, đặc hiệu cho T. evansi, không xuất hiện ở các chủng Trypanosoma khác. Kháng nguyên này có khả năng phát hiện kháng thể đặc hiệu của vật chủ với độ đặc hiệu lên đến 99% và độ nhạy tương đương kháng nguyên tự nhiên.

• Cơ chế biểu hiện gen tái tổ hợp: Sử dụng vector biểu hiện pET 32a(+) trong chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) để biểu hiện protein tái tổ hợp RoTAT 1.2. Vector này chứa promoter mạnh T7, đuôi His-tag giúp tinh sạch protein bằng cột ái lực Ni2+.

• Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Phản ứng ELISA gián tiếp được thiết lập để phát hiện kháng thể kháng T. evansi trong mẫu huyết thanh gia súc, sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 làm kháng nguyên bắt giữ.

Các khái niệm chính bao gồm: kháng nguyên tái tổ hợp, vector biểu hiện gen, phương pháp ELISA, phản ứng PCR, và kỹ thuật tinh sạch protein bằng cột ái lực.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu gen RoTAT 1.2 được phân lập từ T. evansi tại Việt Nam. Chủng vi khuẩn E. coli BL21/pET được sử dụng làm chủng biểu hiện gen. Mẫu huyết thanh trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng được thu thập để đánh giá hiệu quả chẩn đoán.

• Phương pháp phân tích:

  • Khuếch đại gen RoTAT 1.2 bằng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu.
  • Cắt enzym giới hạn EcoRI và HindIII để tạo đầu dính cho gen và vector pET 32a(+).
  • Ghép nối gen vào vector, biến nạp vào E. coli BL21(DE3).
  • Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu (nồng độ IPTG, pH, nhiệt độ, mật độ vi khuẩn) để biểu hiện protein tái tổ hợp.
  • Tinh sạch protein bằng cột ái lực Ni2+ dựa trên đuôi His-tag.
  • Kiểm tra protein bằng điện di SDS-PAGE và Western blot để xác định tính đặc hiệu.
  • Thiết lập và tối ưu phản ứng ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
  • Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại của phản ứng ELISA trên mẫu huyết thanh thực tế.

• Timeline nghiên cứu:

  • Tháng 5/2012 – 12/2012: Khuếch đại gen, xây dựng vector tái tổ hợp, biến nạp và biểu hiện protein.
  • Tháng 1/2013 – 4/2013: Tinh sạch protein, kiểm tra tính đặc hiệu và thiết lập phản ứng ELISA.
  • Tháng 5/2013 – 6/2013: Đánh giá hiệu quả chẩn đoán trên mẫu huyết thanh thực tế.

• Cỡ mẫu: Số lượng mẫu huyết thanh trâu, bò nghi nhiễm khoảng 100 mẫu được sử dụng để đánh giá phản ứng ELISA.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện biểu hiện gen RoTAT 1.2 tối ưu:

   • Nồng độ IPTG 0,1 mM kích thích biểu hiện protein tái tổ hợp cao nhất sau 5 giờ cảm ứng.
   • Nhiệt độ nuôi cấy 30°C cho mức biểu hiện protein cao hơn so với 37°C và 25°C.
   • Mật độ vi khuẩn OD600 khoảng 0,6 – 0,8 là phù hợp để bắt đầu cảm ứng.
   • Độ pH môi trường nuôi cấy tối ưu là 7,0 – 7,4.

2. Protein RoTAT 1.2 được tinh sạch thành công:

   • Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 25 kDa được phát hiện rõ trên gel SDS-PAGE.
   • Western blot xác nhận tính đặc hiệu của protein với kháng thể đặc hiệu T. evansi.
   • Độ tinh khiết protein đạt trên 90% sau quá trình tinh sạch bằng cột ái lực Ni2+.

3. Thiết lập phản ứng ELISA với kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2:

   • Độ nhạy của phản ứng ELISA đạt khoảng 95%, độ đặc hiệu đạt 98%.
   • Thời gian ủ kháng thể và anti-bovine IgG:HRPO tối ưu lần lượt là 60 phút và 45 phút.
   • Phản ứng có độ lặp lại cao với hệ số biến thiên dưới 5%.
   • Phản ứng ELISA phát hiện được 90% mẫu huyết thanh dương tính so với phương pháp PCR.

4. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán trên mẫu thực tế:

   • Tỷ lệ phát hiện trâu, bò nhiễm tiên mao trùng bằng ELISA là 22%, tương đương với kết quả PCR.
   • Phản ứng ELISA cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và phù hợp với quy mô xét nghiệm lớn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc biểu hiện gen RoTAT 1.2 trong chủng E. coli BL21/pET 32a(+) là khả thi và hiệu quả, tạo ra lượng protein tái tổ hợp lớn, tinh khiết và đặc hiệu. Điều kiện nuôi cấy và cảm ứng IPTG được tối ưu giúp tăng năng suất biểu hiện, phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp. Phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vượt trội so với các phương pháp huyết thanh học truyền thống, đồng thời giảm thiểu phản ứng dương tính giả do kháng nguyên tự nhiên không tinh khiết gây ra.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 cho thấy ưu điểm về tính đặc hiệu và khả năng ứng dụng trong sản xuất Kít chẩn đoán nội địa, giúp giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận của người chăn nuôi. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ biểu thị mức độ biểu hiện protein theo thời gian và nồng độ IPTG, bảng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của ELISA với các phương pháp khác, cũng như biểu đồ phân bố tỷ lệ dương tính trên mẫu thực tế.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai sản xuất Kít chẩn đoán ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2:

   • Mục tiêu: Cung cấp Kít chẩn đoán nội địa với chi phí hợp lý, độ nhạy và đặc hiệu cao.
   • Thời gian: 12 tháng kể từ khi hoàn thành nghiên cứu.
   • Chủ thể thực hiện: Các công ty công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y.

2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ thú y về sử dụng Kít ELISA mới:

   • Mục tiêu: Nâng cao năng lực chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại các cơ sở thú y.
   • Thời gian: 6 tháng đầu sau khi Kít được sản xuất.
   • Chủ thể thực hiện: Viện nghiên cứu, trường đại học và cơ quan thú y địa phương.

3. Mở rộng khảo sát dịch tễ và đánh giá hiệu quả Kít trên diện rộng:

   • Mục tiêu: Đánh giá chính xác tỷ lệ nhiễm và hiệu quả chẩn đoán trong thực tế.
   • Thời gian: 12 – 18 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu dịch tễ và thú y vùng.

4. Phát triển thêm các phương pháp chẩn đoán kết hợp PCR và ELISA:

   • Mục tiêu: Tăng cường độ chính xác và khả năng phát hiện sớm bệnh.
   • Thời gian: 24 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Thú y, Công nghệ sinh học:

   • Lợi ích: Hiểu rõ về kỹ thuật biểu hiện gen, tinh sạch protein tái tổ hợp và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh ký sinh trùng.
   • Use case: Áp dụng trong nghiên cứu phát triển các Kít chẩn đoán mới.

2. Cán bộ thú y và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm chẩn đoán:

   • Lợi ích: Nắm bắt quy trình sản xuất và sử dụng Kít ELISA nội địa, nâng cao hiệu quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
   • Use case: Triển khai chẩn đoán nhanh, chính xác tại các cơ sở thú y.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và sản xuất vật tư thú y:

   • Lợi ích: Tham khảo quy trình công nghệ sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp và Kít chẩn đoán, giảm chi phí nhập khẩu.
   • Use case: Phát triển sản phẩm Kít chẩn đoán nội địa, mở rộng thị trường.

4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách thú y:

   • Lợi ích: Cơ sở khoa học để xây dựng chính sách hỗ trợ sản xuất và ứng dụng Kít chẩn đoán trong nước.
   • Use case: Đưa ra các chương trình phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng nguyên RoTAT 1.2 là gì và tại sao được chọn để sản xuất Kít chẩn đoán?
   Kháng nguyên RoTAT 1.2 là một kháng nguyên bề mặt ổn định, đặc hiệu của T. evansi, không có ở các chủng Trypanosoma khác. Nó được chọn vì có độ đặc hiệu cao (99%) và độ nhạy tương đương kháng nguyên tự nhiên, giúp giảm phản ứng dương tính giả trong chẩn đoán.

2. Tại sao sử dụng E. coli BL21 để biểu hiện protein tái tổ hợp?
   E. coli BL21 là chủng vi khuẩn phổ biến trong biểu hiện gen do tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein cao, chi phí thấp và dễ dàng tinh sạch protein nhờ đuôi His-tag.

3. Phản ứng ELISA gián tiếp hoạt động như thế nào trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng?
   ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để bắt giữ kháng thể đặc hiệu trong mẫu huyết thanh. Sau đó, kháng thể thứ cấp gắn enzyme được thêm vào để tạo phản ứng màu, giúp định lượng mức độ nhiễm bệnh.

4. Độ nhạy và độ đặc hiệu của Kít chẩn đoán này so với các phương pháp khác ra sao?
   Kít ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 có độ nhạy khoảng 95% và độ đặc hiệu 98%, cao hơn nhiều so với các phương pháp huyết thanh học truyền thống và tương đương với PCR nhưng có ưu điểm về chi phí và thời gian.

5. Làm thế nào để đảm bảo tính lặp lại và ổn định của phản ứng ELISA?
   Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện phản ứng như thời gian ủ, nồng độ kháng nguyên và kháng thể, đồng thời đánh giá hệ số biến thiên dưới 5%, đảm bảo kết quả ổn định và có thể tái lập trong các lần xét nghiệm khác nhau.

Kết luận

• Đã thành công trong việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của T. evansi trong chủng E. coli BL21/pET 32a(+).
• Phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy 95% và độ đặc hiệu 98%, phù hợp cho chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc.
• Kít chẩn đoán nội địa giúp giảm chi phí, tăng khả năng tiếp cận và ứng dụng rộng rãi trong ngành thú y Việt Nam.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển các phương pháp chẩn đoán hiện đại, góp phần nâng cao hiệu quả phòng trị bệnh tiên mao trùng.
• Đề xuất triển khai sản xuất và ứng dụng Kít chẩn đoán trong vòng 12 tháng tới, đồng thời mở rộng khảo sát dịch tễ và đào tạo kỹ thuật viên.

Call-to-action: Các đơn vị nghiên cứu, sản xuất và cơ quan thú y cần phối hợp để đưa Kít chẩn đoán này vào sử dụng thực tế, góp phần bảo vệ sức khỏe đàn gia súc và phát triển ngành chăn nuôi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam. Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước. Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra.

Trâu, bò, ngựa mắc bệnh dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản xuất. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng 1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh Theo Levine và cs (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997 [5]), vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau: Ngành Sarcomastigophora Phân ngành Mastigophora Lớp Zoomastigophorasida Bộ Kinetoplastorida Phân bộ Trypanosomatorida Họ Trypanosomatidae Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901 Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909 Loài Trypanosoma (S) cruzi Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918 Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trvpanosoma (D) uniform n 5 Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (N) congolense Loài Trypanosoma (N) siminae Loài Trypanosoma (N) vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906 Loài Trypanosoma (T) brucei Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843 Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885) Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng Tiên mao trùng T.

evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm), chiều rộng 1,5 – 2 µm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae.

Cấu trúc từ ngoài vào trong được chia thành 3 phần chính: - Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [26]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).

n 6 - Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi. - Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng. Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể.

Ngoài nhân, về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [26]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).

Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi * Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết thanh thỏ tối miễn dịch với T. evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30 thành phần kháng nguyên khác nhau.

Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100. Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại này không kết hợp với kháng thể của vật chủ.2 của tiên mao trùng Theo Urakawa và cs, (2001) [30] dựa trên trình tự mã hóa gen của T. evansi thì kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 không tương đồng với các kháng nguyên bề mặt khác trong 39 mẫu Trypanosoma khác nhau và có kích thước khoảng 215 bp. Kháng nguyên RoTAT 1.2 không xuất hiện ở các chủng T.

Theo Ventura và cs 2004 [31] khi làm phản ứng PCR trên 9 mẫu T. gambiense và một mẫu T. Cho thấy các n 7 epitope RoTAT 1.2 có mặt ở tất cả các mẫu T. evansi nhưng không có mặt ở các chủng khác.

Như vậy kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 chỉ được tìm thấy ở T. evansi * Kháng nguyên biến đổi Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG (Variant Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi. Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins (1969) đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt. Lớp áo bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type kháng nguyên biến đổi VAT (Variable Antigen Type).

Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới có khả năng kích thích vật chủ tạo miền dịch chủ động. Người ta ước lượng rằng, một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số gen của tiên mao trùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này. Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên, Van Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ).

Theo Hajduc và Vickernlan (1981), hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất. * Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG), làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá của gen.

Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng n 8 các phân tử VSG mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này. Theo Barry và Tumer (1991) [22], các VSG được mã hoá nhờ các gen chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn đến khác nhau, một gen VSG được hoạt hoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG.

Mỗi bên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính. Cơ chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứ nhất là, sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện trên (expression side) khác nhau, không có sự sắp xếp của ADN. Các điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự thay đổi type kháng nguyên.

Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm. Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên của các điểm biểu hiện gen này. Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn ADN khác nhau để tái tổ hợp gen, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc từng phần gen; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứ không phải dựa vào tái tổ hợp gen. Trường hợp này được diễn giải như sau: một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác.

Do có sự thay thế một phần của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trưng. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng 1. Phân bố của bệnh Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu. Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi cho đến Philippine.

Bệnh tiên mao trùng phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi,châu Á và Nam Mỹ. Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạc Sahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa trung hải. n 9 Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả rập Saudi, Yêmen, Sultanate, Ả Rập thống nhất, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan, Pakistan. Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ, Malaysia, bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine.

Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiện chỉ còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ). Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ở Brazil, Mexico, Venezuela, Colombia. Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng (Reid, 2002) cho rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi, từ Ấn Độ đến Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia, Iran, Philippine. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển.

Theo Phạm Sỹ Lăng (1982) [7], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây). Trâu, bò nhiễm bệnh với tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng nhiễm tiên mao trùng cao hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò có nguồn gốc từ miền núi chuyển xuống vùng đồng bằng). Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [11] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu bò Việt Nam.