Nghiên cứu biểu hiện gen kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc

• Tác giả: Hoàng Thị Hồng Hạnh
• Người hướng dẫn: Phan Thị Hồng Phúc
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
• MỤC LỤC
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Tính cấp thiết của của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC
• 2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
• 2.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 2.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
• 2.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• 2.1.5. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 2.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa
• 2.2. VECTOR TÁCH DÒNG
• 2.2.1. Các loại vector tách dòng
• 2.3. VECTOR BIỂU HIỆN
• 2.3.1. Các hệ thống biểu hiện gen
• 3. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
• 3.2. Chủng vi khuẩn và plasmid
• 3.3. Các bộ sinh phẩm, thang chuẩn
• 3.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị
• 3.5. Môi trường và đệm
• 3.6. Cặp mồi sử dụng
• 3.7. NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 3.7.1. Phương pháp nghiên cứu. Các phương pháp nghiên cứu
• 3.7.2. Phương pháp biểu hiện
• 3.7.3. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
• 3.7.4. Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
• 3.7.5. Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
• 3.7.6. Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
• 3.7.7. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA
• 3.7.8. Xác định độ lặp lại của kết quả phản ứng ELISA
• 4. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET-RoTAT
• 4.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.2.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT
• 4.2.2. Nghiên cứu xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện
• 4.2.3. Nghiên cứu xác định nhiệt độ tăng sinh chủng biểu hiện
• 4.2.4. Nghiên cứu xác định mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT
• 4.2.5. Nghiên cứu xác định độ pH phù hợp để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT
• 4.2.6. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.3. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT
• 4.4. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT xây dựng quy trình phản ứng ELISA phát hiện bệnh tiên mao trùng
• 4.4.1. Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA
• 4.4.2. Khảo sát tác nhân block giếng
• 4.4.3. Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của T.evansi và anti-bovine IgG:HRPO
• 4.4.4. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA
• 4.4.5. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng
• 4.4.6. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu bò nghi nhiễm tiên mao trùng
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH

I. Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi

Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi tập trung vào việc xác định và phân tích các kháng nguyên bề mặt của loài ký sinh trùng này. Trypanosoma evansi là tác nhân gây bệnh tiên mao trùng ở gia súc, đặc biệt là trâu, bò và ngựa. Các kháng nguyên bề mặt như RoTAT 1.2 được nghiên cứu kỹ lưỡng do vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ miễn dịch của vật chủ. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp biểu hiện gen để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp, giúp tăng độ tinh khiết và hiệu quả trong chẩn đoán bệnh. Kết quả cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với kháng nguyên tự nhiên, mở ra hướng ứng dụng trong sản xuất kít chẩn đoán.

1.1. Đặc điểm kháng nguyên bề mặt

Kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi bao gồm hai loại chính: kháng nguyên ổn định và kháng nguyên biến đổi. Kháng nguyên ổn định như ISG 65, ISG 75 và ISG 100 không thay đổi trong quá trình ký sinh, trong khi kháng nguyên biến đổi như VSG (Variant Surface Glycoprotein) có khả năng thay đổi để né tránh hệ miễn dịch của vật chủ. RoTAT 1.2 là một kháng nguyên bề mặt đặc trưng của Trypanosoma evansi, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh.

1.2. Phương pháp biểu hiện gen

Phương pháp biểu hiện gen được áp dụng để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2. Quá trình này bao gồm việc tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt và biểu hiện trong hệ thống tế bào chủ như E. coli. Kết quả thu được là kháng nguyên tái tổ hợp có độ tinh khiết cao, phù hợp để sử dụng trong sản xuất kít chẩn đoán. Phương pháp này khắc phục được hạn chế của kháng nguyên tự nhiên, vốn dễ gây phản ứng dương tính giả.

II. Ứng dụng kháng nguyên trong sản xuất kít chẩn đoán

Ứng dụng kháng nguyên trong sản xuất kít chẩn đoán là bước quan trọng để phát hiện sớm và chính xác bệnh tiên mao trùng ở gia súc. Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được sử dụng làm thành phần chính trong kít chẩn đoán, giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Nghiên cứu đã xây dựng quy trình phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp, cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Kít chẩn đoán này có tiềm năng lớn trong việc thay thế các sản phẩm nhập khẩu, giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận cho người chăn nuôi.

2.1. Quy trình sản xuất kít chẩn đoán

Quy trình sản xuất kít chẩn đoán bao gồm các bước: tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp, chuẩn bị các thành phần của kít như kháng thể, chất nền và dung dịch đệm. Kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được sử dụng làm thành phần chính để phát hiện kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi trong mẫu máu gia súc. Quy trình này đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam.

2.2. Đánh giá hiệu quả kít chẩn đoán

Kít chẩn đoán được đánh giá thông qua các thử nghiệm về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ lặp lại. Kết quả cho thấy kít có khả năng phát hiện chính xác bệnh gia súc với tỷ lệ dương tính cao. So sánh với phương pháp PCR, kít chẩn đoán cho kết quả tương đương nhưng có ưu điểm về thời gian và chi phí. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng rộng rãi của kít chẩn đoán trong thực tiễn chăn nuôi.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học lớn khi cung cấp thông tin chi tiết về kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi và quy trình sản xuất kít chẩn đoán. Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp không chỉ giúp chẩn đoán nhanh chóng mà còn góp phần kiểm soát và phòng ngừa bệnh tiên mao trùng ở gia súc. Về mặt thực tiễn, việc sản xuất kít chẩn đoán trong nước giúp giảm chi phí, tăng khả năng tiếp cận cho người chăn nuôi, đồng thời thúc đẩy ngành thú y phát triển bền vững.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã làm sáng tỏ cấu trúc và chức năng của kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi, đặc biệt là RoTAT 1.2. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiện đại, góp phần vào sự hiểu biết sâu sắc hơn về bệnh tiên mao trùng.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Việc sản xuất thành công kít chẩn đoán trong nước giúp giảm sự phụ thuộc vào sản phẩm nhập khẩu, tiết kiệm chi phí và tăng hiệu quả chẩn đoán. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh gia súc, góp phần phát triển bền vững ngành chăn nuôi tại Việt Nam.