phần mở đầu và kết luận, luận văn gồm 3 chƣơng: Chƣơng 1: TỔNG QUAN Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. Ong không ngòi đốt Ong không ngòi đốt có tên tiếng Anh là Stingless bee, thuộc ngành Insecta, bộ Hymenoptera, họ Apidae, tông Meliponini. Ong không ngòi đốt có hơn 500 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ các nƣớc châu Nam Mỹ, các nƣớc Đông Nam Á, Australia và châu Phi. Hơn 400 loài đã đƣợc xác định, trong đó hơn 300 loài ở Brazil, 14 loài ở Australia và có 46 loài đã đƣợc ghi nhận ở Mexico, 26 loài tại châu Phi và 43 loài đã đƣợc tìm thấy tại châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan,Indonesia, Ấn Độ, Malaysia, Lào, Campuchia.
Ở Việt Nam có khoảng 14-15 loài đã tìm thấy, đƣợc phân chia thuộc hai giống Lisotrigona và Trigona, chủ yếu ở các tỉnh từ Đà Nẵng trở vào nam [34, 36] (Bảng 1). Năm 2004, Tống Xuân Chinh và cộng sự có công bố nghiên cứu về một số loài thuộc giống Lisotrigona ở các tỉnh phía Bắc [10]. Các loài ong không ngòi đốt khác nhau ở Việt Nam [10, 34, 36] STT Loài ong không ngòi Phân bố đốt Giống Lisotrigona Phổ biến ở nhiều tỉnh miền Trung, Nam Việt 1 Lisotrigona cacciae nam Phổ biến ở nhiều tỉnh miền Trung, Nam Việt 2 Lisotrigona scintillans nam 3 Lisotrigona carpenteri Ninh Bình, Nghệ An, một số tỉnh phía Nam 4 Lisotrigona furva Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận Giống Trigona 5 Homotrigona fimbriata Khánh Hòa, Kontum, Đắc Lắc, Lâm Đồng hay Homotrigona anamitica 3 6 Lepidotrigona terminata Một số tỉnh phía Nam 7 Lepidotrigona ventralis Một số tỉnh phía Nam, Buôn Mê Thuột, Đắc Lắc 8 Tetragonila collina Một số tỉnh phía Nam (Trigona collina) 9 Tetrigona apicalis Một số tỉnh phía Nam 10 Trigona gressitti Lâm Đồng (Tetragonula gressitti) 11 Trigona laeviceps Bình Định, Khánh Hòa, Kontum, Đắc Lắc, (Tetragonula laeviceps) Lâm Đồng 12 Trigona pagdeni Phan Thiết (Tetragonula pagdeni) 13 Trigona fuscobalteata Pleiku (Tetragonula fuscobalteata) 14 Trigona minor Bến tre 1. Tổng quan nghiên cứu về keo ong không ngòi đốt ở nƣớc ngoài Thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt gồm các nhóm chất tƣơng tự nhƣ thành phần hóa học của keo ong mật Apis melifera chủ yếu nhƣ các hợp chất flavonoid, terpene, phenolic.
Gần đây, một số nhóm hợp chất nhƣ xanthone, alkaloids lần đầu tiên đƣợc phát hiện từ keo ong không ngòi đốt. Thành phần keo ong không ngòi đốt là khá đa dạng, phụ thuộc theo loài ong , đặc điểm địa lý, khí hậu và nguồn thực vật có hoa [32]. Flavonoid Flavonoid là các hợp chất thƣờng đƣợc tìm thấy trong keo ong mật Apis melifera cũng nhƣ keo ong không ngòi đốt. Từ keo ong không ngòi đốt Melipona orbignyi, nhóm nghiên cứu Brazil đã phát hiện ra các hợp chất 4 flavonoid nhƣ aromadendrin (1), naringenin (2), methyl aromadendrin (3) và methyl narigenin (4) [7, 38].
Các hợp chất này đƣợc ong hút từ nhựa quả cây Corymbia torelliana (Myrtaceae). Các hợp chất Terpene 1. Hợp chất diterpene Nhóm nghiên cứu của Bankova đã xác định thành phần hóa học của keo ong Melipona quadrifasciata anthidioides tại Brazil và phân lập đƣợc các chất là acid ent-Kaur-16-en-19-oic (acid kaurenoic) (27) và acid ent-15β-3- methylbutanoyloxy -16-kauren-19-oic (28) [40]. Acid ent-Kaur-16-en-19-oic Acid ent-15β-3-methylbutanoyloxy-16- (Kaurenoic acid) (27) kauren-19-oic (28) Từ keo ong Tetragonula carbonaria tại Australia, ngoài các flavanone còn có 1 hợp chất diterpene là acid abietic (29) [26].
Hợp chất acid abietic (29) 7 còn đƣợc phát hiện trong keo ong Melipona quadrifasciata tại Brazil [12, 15] cùng với các hợp chất 7-hydroxydehydroabietic (30), acid 7-oxydehydroabietic (31) và pinusenocarp (32). Hợp chất triterpene Các hợp chất triterpene là nhóm hợp chất đƣợc phát hiện hay phân lập từ các loài ong không ngòi đốt khác nhau. Các nhà khoa học Brazil đã nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt Trigona spinipes và phân lập đƣợc các triterpene khung cycloartane là acid mangiferolic (33) và acid 3β- hydroxy-24-methylenecycloartan-26-oic (42) [18]. Các hợp chất Phenolic Hợp chất phenolic cũng là 1 trong các nhóm hợp chất chính đƣợc phát hiện từ keo ong bao gồm nhiều hợp chất khác nhau nhƣ các acid phenolic và dẫn chất, hợp chất coumarin, lignan, xanthone… 1.
Acid Phenolic và các dẫn chất Các acid phenolic đƣợc phát hiện từ các loại keo ong khác nhau ví dụ acid gallic đƣợc phát hiện trong keo ong Trigona apicalis tại Malaysia. Các hợp chất phenolic nhƣ acid benzoic, acid dihydrocinnamic, acid cinnamic là thành phần đƣợc xác định có trong keo ong tại Brazil Melipona orbignyi bằng phƣơng pháp GC-MS [38]. Ngoài ra từ keo ong Scaptotrigona depilis và Melipona quadrifasciata anthidioides đã phát hiện ra các acid nhƣ vanilic acid, caffeic acid, ferulic acid, p-coumaric acid [6]. Các dẫn chất ester glucoside của các acid phenolic cũng đƣợc phát hiện từ keo ong không ngòi đốt.
Từ keo ong Melipona subnitida đã phân lập đƣợc 2 hợp chất 6-O-p-coumaroyl-D-galactopyranose (41) và 6-O-cinnamoyl-1-O-p- coumaroyl-β-D-glucopyranose (42) [16]. 9 6-O-p-coumaroyl-D- 6-O-cinnamoyl-1-O-p-coumaroyl-β-D- galactopyranose (41) glucopyranose (42) Tại Brazil, nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt Melipona fasciculata đã xác định đƣợc các hợp chất nhƣ Acid valoneic dilactone (43), Acid hexahydroxydiphenic (HHDP) glucose (44) và corilagin (45) [25]. Acid valoneic dilactone (43) Acid hexahydroxydiphenic (HHDP) glucose (44) Acid galloyl hexahydroxydiphenic (HHDP) glucose (corilagin) (45) 1. Các hợp chất Xanthone Nhóm hợp chất xanthone đã phát hiện lần đầu tiên từ keo ong không ngòi đốt ở Thái Lan.
Năm 2015, các nhà khoa học Thái Lan đã phân lập đƣợc hai hợp chất α-mangostin (46) và γ-mangostin (47) từ keo ong Tetragonula pagdeni [41]. Trong cùng năm, Bankova và cộng sự đã phát hiện ra các hợp chất xanthone gồm α-mangostin, γ-mangostin, mangostanin (48), 8- deoxygartanin (49), gartanin (50) và garcinone B (51) từ keo ong Tetragonula 10 laeviceps [37]. Các hợp chất Coumarin Từ keo ong không ngòi đốt Melipona scutellaris tại Brazil đã phân lập đƣợc các hợp chất coumarin nhƣ 4-propyl coumarin (52), 4-phenyl coumarin (53) và 5 coumarin khác đã biết (54–58) [14]. (53) R1=Cinnamoylo R2=H (54) R1=H (52 R1=Cinnamoyl xy (55) R1=OH ) oxy (58 R2=H (56) R1=H R2=preny ) l (57 R1=Cinnamoylo R2=preny xy l 1.
Các hợp chất Alkaloid Mặc dù có nhiều nghiên cứu trƣớc đây về thành phần hóa học, alkaloids là nhóm hợp chất chƣa đƣợc phát hiện từ keo ong Mật Apis melifera. Tuy nhiên từ 11 nghiên cứu keo ong Scaptotrigona bipunctata Brazil, một số alkaloid có chứa khung piperidin nhƣ lobeline (59), lobelanidine (60), lenobanonoline (61), norlobelin (62) và norlebelanidine (63) đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HRMS [12]. Đây là nghiên cứu đầu tiên phát hiện ra hợp chất alkaloid từ keo ong không ngòi đốt. Lobeline (59) Lobelanidine (60) Lenobanonoline (61) Norlobelin (62) Norlebelanidine (63) Nhƣ vậy từ keo ong không ngòi đốt trên thế giới đã phát hiện, phân lập đƣợc khá nhiều hợp chất thuộc các nhóm hợp chất flavonoids, terpene, phenolic acid, xanthones, v.
Đặc biệt hợp chất nhƣ xanthone, alkaloids lần đầu tiên đƣợc phát hiện từ keo ong không ngòi đốt và chƣa từng đƣợc phát hiện từ keo ong mật Apis melifera. Hoạt tính sinh học của keo ong không ngòi đốt Các dịch chiết của keo ong không ngòi đốt hay các hợp chất phân lập thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, chống viêm. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nƣớc Ở Việt Nam, các nghiên cứu về ong không ngòi đốt còn rất ít. Ong không ngòi đốt ở Việt Nam đƣợc phát hiện có 14-15 loài thuộc chi Lisotrigona và Trigona [10].
Một số loài ong không ngòi đốt nhƣ Lisotrigona carpenteri, Lisotrigona cacciae, Lisotrigna furva đƣợc phát hiện ở rừng Cúc Phƣơng hay 12 Hoài Ân, Bình Định. Một số loài ong thuộc chi Trigona nhƣ Trigona laeviceps, Trigona gressitti, Trigona pagdeni, Trigona fuscobalteata đƣợc phát hiện ở các tỉnh miền Trung Việt Nam [36]. Về nghiên cứu thành phần hóa học, có nghiên cứu năm 2017 về keo ong không ngòi đốt Trigona minor tại Bến tre. Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc 16 hợp chất triterpene trong đó có 5 hợp chất mới (64-68) khung cycloartan, cùng với 10 hợp chất đã biết khung cyloartan gồm cycloartenone (69), acid mangiferonic (70), acid 23-hydroxymangiferonic (71), acid 27- hydroxymangiferonic (72), acid mangiferolic (73), acid 23- hydroxymangiferolic (74), acid 27-hydroxymangiferolic (75), acid 27- hydroxyisomangiferolic (76), (24E)-3β-hydroxycycloart-24-en-26-al (77), (23E)-27-nor-3β-hydroxy-cycloart-23-en-25-one (78), và triterpene khung lanostane là lanosterol (79) [29].
Trong số các hợp chất đƣợc phân lập thì acid 23-hydroxyisomangiferolic (71) và acid 27-hydroxyisomangiferolic (72) có hoạt tính tốt chống lại dòng tế bào ung thƣ tuyến tụy ở ngƣời PANC-1 với nồng độ PC50 là 4,3 và 3,7 μM [29]. R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 (66) COOH OAc H βOH (64) COOH OAc H (67) COOH H OH αOH (65) COOH OCOMe H (68) COOH H OH αOH (69) CH3 H H (73) COOH H βOH (70) COOH H H (74) COOH H OH βOH (71) COOH H OH (75) COO OH H βO (72) COOH OH H (76) COOH OH H OH (77) CHO H H OH 13 Năm 2018, nhóm nghiên cứu báo cáo 3 hợp chất phân lập từ cặn chiết CHCl3 gồm hợp chất mới alkylphenol 80 và hai hợp chất đã biết 81-82. Hợp chất 80 thể hiện hoạt tính khá tốt trên dòng tế bào ung thƣ tuyến tụy ở ngƣời PANC-1 với nồng độ PC50 là 2,4 μM [30]. Gần đây, từ dịch chiết EtOH của keo ong Trigona minor đã phân lập đƣợc 4 hợp chất lignan là (+)-isolariciresinol (83), 5-methoxy-(+)-isolariciresinol (84), (+)-lyoniresinol (85), and 6-(4- hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,7- dioxabicyclo[3.
Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế với Bulgaria, nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành đã thu đƣợc một số hợp chất xanthones (101-104) và triterpen keo ong không ngòi đốt từ loài ong Lisotrigona furva ở Bình Định. Dịch chiết EtOH của keo ong Bình Định thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên chủng vi khuẩn E. 14 Các kết quả nghiên cứu bƣớc đầu của keo ong Việt Nam rất đáng chú ý vì các hợp chất xanthones và lignan đƣợc phân lập lần đầu từ keo ong không ngòi đốt ở Bình Định khác với kết quả từ keo ong không ngòi đốt ở Bến Tre. Điều này cho thấy sự đa dạng trong thành phần hóa học keo ong, phụ thuộc vào loài ong cũng nhƣ vùng miền lấy mẫu.
15 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu keo ong không ngòi đốt đƣợc thu tại trại nuôi ong dú Đỗ Sơn ở huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình vào tháng 11/2018. Loài ong không ngòi đốt đƣợc PGS.TS Nguyễn Thị Phƣơng Liên và ThS Trần Thị Ngát, Phòng sinh thái côn trùng, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học là Lisotrigona cacciae (NURSE 1907), tông Meliponini, họ Apidae. Mẫu ong không ngòi đốt đƣợc lƣu tại phòng sinh thái côn trùng học, với mã số HB03/11/18.
Phƣơng tiện nghiên cứu 2. Trang thiết bị cho chiết xuất, phân lập - Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn (Merck 60 F254, Đức).