Đánh Giá Hoạt Động Của Một Số Gen Liên Quan Đến Tinh Bột Trong Cây Sắn

Nghiên cứu về gen sắn và tinh bột sắn có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện năng suất và chất lượng cây sắn… 186 trang · Đại học Hồng Đức · 2018.

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Đại học Hồng Đức
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Động Của Các Gen Liên Quan Đến Tinh Bột Trong Cây Sắn
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn
• 1.2. Nguồn gốc và phân loại
• 1.3. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền
• 1.4. Giá trị của cây sắn
• 1.5. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam
• 1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn
• 1.7. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay
• 1.8. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn
• 1.9. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật
• 1.10. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
• 1.11. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen
• 1.12. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn
• 1.13. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn
• 1.14. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu thực vật
• 2.3. Chủng vi khuẩn, vector
• 2.4. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm
• 2.5. Môi trường nuôi cấy
• 2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh giá
• 2.7.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.7.3. Phương pháp phân lập gen và promoter
• 2.7.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen
• 2.7.5. Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giống sắn phục vụ cho nghiên cứu
• 2.7.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.7.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
• 2.7.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển
• 2.7.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen
• 2.7.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột
• 3.2. Lựa chọn các giống sắn sử dụng
• 3.3. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn
• 3.4. Tách chiết ARN tổng số
• 3.5. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA
• 3.6. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột
• 3.7. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và củ sắn
• 3.8. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen
• 3.8.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu
• 3.8.2. Phân lập gen SSIV ở sắn
• 3.8.3. Thiết kế vector chuyển gen
• 3.9. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá
• 3.9.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen chuyển
• 3.9.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển
• 3.10. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn
• 3.10.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn
• 3.10.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen GUS
• 3.10.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột
• 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột
• 4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc lá
• 4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn
• 4.4. Hệ thống tái sinh cây sắn
• 4.5. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua Agrobacterium
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÓM TẮT TIẾNG ANH
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Gen Sắn và Tinh Bột Sắn 55 ký tự

Nghiên cứu về gen sắn và tinh bột sắn có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện năng suất và chất lượng cây sắn (Manihot esculenta). Cây sắn là một nguồn cung cấp tinh bột quan trọng cho nhiều quốc gia, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới. Việc hiểu rõ về các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột sẽ mở ra cơ hội để tạo ra các giống sắn có hàm lượng tinh bột cao hơn, khả năng chống chịu tốt hơn. Các nghiên cứu phân tích gen cũng giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cấu trúc gen sắn, chức năng gen sắn và cách chúng được điều hòa gen. "Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây 5000 năm" (Rogers, 1965).

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu bộ gen sắn và tinh bột

Nghiên cứu bộ gen sắn đóng vai trò then chốt trong việc xác định các gen chủ chốt ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Từ đó, các nhà khoa học có thể áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học sắn, bao gồm cả chỉnh sửa gen, để cải thiện chất lượng tinh bột sắn và tăng năng suất sắn. Việc phân tích bản đồ gen sắn giúp xác định các marker phân tử sắn liên kết với các đặc tính mong muốn, hỗ trợ quá trình chọn giống hiệu quả hơn.

1.2. Giới thiệu chung về cây sắn Manihot esculenta

Cây sắn (Manihot esculenta) là cây lương thực quan trọng, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Cây sắn có khả năng chịu hạn tốt và có thể trồng trên các loại đất nghèo dinh dưỡng, đây là một lợi thế lớn. Nghiên cứu sâu hơn về gen sắn sẽ giúp tối ưu hóa tiềm năng của cây sắn trong việc đảm bảo an ninh lương thực.

II. Thách Thức Nghiên Cứu và Cải Thiện Năng Suất Sắn 57 ký tự

Mặc dù cây sắn có nhiều ưu điểm, năng suất tinh bột vẫn còn là một thách thức. Các yếu tố môi trường và di truyền đều ảnh hưởng đến sinh tổng hợp tinh bột trong cây sắn. Việc xác định và điều hòa gen liên quan đến quá trình này là rất quan trọng. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc tìm hiểu cơ chế biểu hiện gen và các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme liên quan tinh bột. Theo "Trong kế hoạch 5 năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn".

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh bột sắn

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến chất lượng tinh bột sắn, bao gồm giống sắn, điều kiện trồng trọt và thời gian thu hoạch. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các gen liên quan đến chất lượng tinh bột sắn, chẳng hạn như hàm lượng amylose và amylopectin, và tìm cách điều chỉnh biểu hiện gen để cải thiện chất lượng tinh bột sắn.

2.2. Khó khăn trong việc cải thiện năng suất sắn truyền thống

Các phương pháp cải thiện năng suất sắn truyền thống thường tốn thời gian và công sức. Việc ứng dụng công nghệ sinh học sắn và các kỹ thuật phân tích gen hiện đại có thể giúp rút ngắn thời gian chọn giống và tăng hiệu quả cải thiện năng suất sắn. Việc nghiên cứu đột biến gen sắn cũng có thể mang lại những giống sắn mới với năng suất và chất lượng tinh bột sắn được cải thiện.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Gen Tổng Hợp Tinh Bột Sắn 58 ký tự

Nghiên cứu hoạt động của các gen liên quan đến tinh bột sắn sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm phân tích gen, biểu hiện gen và kỹ thuật chuyển gen. Các phương pháp này giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về vai trò của từng gen trong quá trình sinh tổng hợp tinh bột và cách chúng tương tác với nhau. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp phân tích gen thường tập trung vào việc xác định trình tự gen sắn và so sánh chúng giữa các giống sắn khác nhau.

3.1. Phân tích biểu hiện gen sử dụng Real time PCR

Phân tích biểu hiện gen bằng kỹ thuật Real-time PCR là một phương pháp quan trọng để đo lường mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột trong các mô khác nhau của cây sắn. Kỹ thuật này giúp xác định các gen có vai trò quan trọng trong quá trình tích lũy tinh bột và các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện gen.

3.2. Kỹ thuật chuyển gen và đánh giá trên cây sắn

Kỹ thuật chuyển gen cho phép các nhà khoa học đưa các gen quan tâm vào cây sắn để nghiên cứu chức năng của chúng và cải thiện các đặc tính mong muốn. Việc đánh giá hoạt động của các gen chuyển trong cây sắn là rất quan trọng để xác định hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen và tác động của các gen này đến sinh tổng hợp tinh bột.

3.3. Sử dụng marker phân tử sắn trong chọn giống

Các marker phân tử sắn liên kết với các đặc tính quan trọng như hàm lượng tinh bột và khả năng chống chịu bệnh có thể được sử dụng để hỗ trợ quá trình chọn giống. Việc sử dụng marker phân tử sắn giúp chọn lọc các giống sắn ưu tú một cách nhanh chóng và chính xác hơn.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Cải Tiến Chất Lượng Tinh Bột 52 ký tự

Kết quả nghiên cứu về gen sắn có thể được ứng dụng để cải thiện chất lượng tinh bột sắn và tăng năng suất sắn. Các kỹ thuật công nghệ sinh học sắn, bao gồm chuyển gen và chỉnh sửa gen, có thể được sử dụng để tạo ra các giống sắn mới với hàm lượng tinh bột cao hơn, chất lượng tinh bột tốt hơn và khả năng chống chịu tốt hơn. "Bước đầu đã chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới sự điều khiển của promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens thông qua FEC".

4.1. Tạo giống sắn biến đổi gen gen sắn

Việc tạo giống sắn biến đổi gen sắn là một hướng đi đầy tiềm năng để cải thiện năng suất sắn và chất lượng tinh bột sắn. Các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột có thể được chuyển vào cây sắn để tăng hàm lượng tinh bột hoặc thay đổi thành phần tinh bột. Tuy nhiên, cần có các đánh giá kỹ lưỡng về an toàn sinh học trước khi đưa các giống sắn biến đổi gen ra sản xuất.

4.2. Ứng dụng công nghệ sinh học sắn trong sản xuất

Công nghệ sinh học sắn có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của sản xuất sắn, từ chọn giống đến chế biến. Các kỹ thuật phân tích gen có thể được sử dụng để xác định các giống sắn phù hợp với các mục đích sử dụng khác nhau, chẳng hạn như sản xuất tinh bột, ethanol hoặc thức ăn chăn nuôi.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Gen Cây Sắn Tương Lai 59 ký tự

Nghiên cứu về gen cây sắn liên quan đến tinh bột đã đạt được nhiều tiến bộ, nhưng vẫn còn nhiều câu hỏi cần được giải đáp. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tìm hiểu sâu hơn về cơ chế điều hòa gen và sự tương tác giữa các gen khác nhau trong quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Theo "Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này bao gồm các gen và hệ thống các vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh bột".

5.1. Hướng nghiên cứu sinh tổng hợp tinh bột mới

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc khám phá các gen mới liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột và tìm hiểu vai trò của chúng trong quá trình này. Việc sử dụng các kỹ thuật phân tích gen và biểu hiện gen hiện đại có thể giúp xác định các gen có tiềm năng ứng dụng trong việc cải thiện năng suất sắn và chất lượng tinh bột sắn.

5.2. Ứng dụng tin sinh học trong nghiên cứu gen sắn

Tin sinh học đóng vai trò ngày càng quan trọng trong nghiên cứu gen sắn. Các công cụ tin sinh học có thể được sử dụng để phân tích dữ liệu gen, dự đoán chức năng của các gen và xác định các marker phân tử sắn tiềm năng.

VI. Bí Quyết Tối Ưu Hóa Năng Suất Tinh Bột ở Sắn 53 ký tự

Để tối ưu hóa năng suất tinh bột ở cây sắn, cần kết hợp các phương pháp chọn giống truyền thống với các kỹ thuật công nghệ sinh học sắn hiện đại. Việc lựa chọn các giống sắn phù hợp với điều kiện địa phương và áp dụng các biện pháp canh tác tiên tiến là rất quan trọng. Đồng thời, cần tiếp tục nghiên cứu về gen sắn để tìm ra các giải pháp cải thiện năng suất sắn một cách bền vững.

6.1. Vai trò của dinh dưỡng và điều kiện canh tác

Dinh dưỡng và điều kiện canh tác đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến năng suất tinh bột của cây sắn. Việc cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết và áp dụng các biện pháp canh tác phù hợp có thể giúp cây sắn phát triển tốt và tích lũy được nhiều tinh bột hơn.

6.2. Quản lý sâu bệnh hại và ảnh hưởng đến tinh bột

Sâu bệnh hại có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất tinh bột của cây sắn. Việc quản lý sâu bệnh hại hiệu quả là rất quan trọng để bảo vệ cây sắn và đảm bảo năng suất tinh bột cao. Việc sử dụng các giống sắn kháng bệnh và áp dụng các biện pháp phòng trừ sâu bệnh tổng hợp có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do sâu bệnh gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong ba loại cây lương thực chủ lực tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới nhờ khả năng cung cấp nguồn carbohydrate dồi dào, sinh trưởng được trong các điều kiện bất lợi như đất nghèo dinh dưỡng và hạn hán. Tại Việt Nam, theo định hướng quy hoạch của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn giai đoạn 2015 - 2020, diện tích trồng sắn được định hướng duy trì ổn định khoảng 450.000 - 500.000 ha với năng suất kỳ vọng đạt 21 tấn/ha (tương đương sản lượng 11 triệu tấn). Tuy nhiên, trước sự gia tăng nhu cầu sử dụng sắn làm nguyên liệu cho sản xuất cồn sinh học (phục vụ lộ trình xăng sinh học E5, E10 với nhu cầu cần 6,8 - 8,0 triệu tấn sắn tươi vào năm 2025), chế biến tinh bột và thức ăn chăn nuôi, nguy cơ thiếu hụt 2,2 - 2,5 triệu tấn sắn củ tươi nguyên liệu là thách thức lớn.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định: Các nghiên cứu nông sinh học trước đây ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào lai tạo giống truyền thống hoặc nhân giống in vitro sạch bệnh. Các hướng tiếp cận sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học nhằm giải mã cơ chế biểu hiện của hệ gen nội sinh liên quan đến con đường sinh tổng hợp tinh bột trên các giống sắn bản địa, cũng như ứng dụng công nghệ chuyển gen để nâng cao hàm lượng tinh bột trong củ sắn, vẫn chưa được triển khai đầy đủ.

• Mục tiêu nghiên cứu: Bước đầu chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC) của giống sắn KM140 nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
• Nội dung nghiên cứu:
  1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột.
  2. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen.
  3. Đánh giá khả năng tổng hợp tinh bột của gen SSIV trên cây thuốc lá mô hình (Nicotiana tabacum).
  4. Xây dựng hệ thống tái sinh và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn (Manihot esculenta Crantz).
• Đối tượng nghiên cứu: Các giống sắn phổ biến tại Việt Nam (KM140, HB80, KM94, SM937-26, F01, H124, Trắng Hòa Bình, Trắng Nghệ An, Đỏ địa phương); cây thuốc lá mô hình (Nicotiana tabacum); chủng vi khuẩn Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens; các vector nhân dòng và vector chuyển gen thực vật (pK7WG2D, pBI121).
• Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát sự biểu hiện gen, phân lập gen, thiết kế cấu trúc biểu hiện, nuôi cấy mô tế bào thực vật, tạo mô sẹo phôi hóa (FEC) và biến nạp gen tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế và Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Cây sắn thuộc chi Manihot, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), có bộ nhiễm sắc thể $2n = 36$. Nghiên cứu phân loại chi Manihot đã được chuẩn hóa bởi Rogers & Appan (1973) với 98 loài thuộc 17 nhóm. Về giá trị dinh dưỡng và công nghiệp, củ sắn chứa 30 - 40% chất khô, trong đó hàm lượng tinh bột chiếm 27 - 36% khối lượng tươi (84 - 87% khối lượng khô), tỷ lệ amylose dao động từ 15 - 29% (Christopher et al., 1995).

Thành phần dinh dưỡng / Chỉ tiêu	Giá trị ghi nhận ở sắn
Tỷ lệ chất khô (%)	30 - 40
Hàm lượng tinh bột (%)	27 - 36
Đường tổng số (% khối lượng tươi)	0,5 - 2,5
Đạm tổng số (% khối lượng tươi)	0,5 - 2,0
Năng lượng (KJ/100g)	607
Hàm lượng Amylose (%)	15 - 29
Nhiệt độ hồ hóa (°C)	49 - 73

Số liệu thống kê của FAOSTAT (2015) cho thấy sản lượng sắn toàn cầu đạt 270,2 triệu tấn; trong đó Nigeria dẫn đầu với 54,8 triệu tấn. Tại Việt Nam, sản lượng sắn năm 2016 đạt 10,93 triệu tấn với diện tích canh tác 569,9 nghìn ha và năng suất bình quân 19,1 tấn/ha.

Năm	Diện tích (nghìn ha)	Năng suất (tấn/ha)	Sản lượng (nghìn tấn)
2010	489,0	17,3	8595,6
2012	551,8	17,6	9735,7
2014	552,7	18,5	10209,8
2016	569,9	19,1	10931,8

Về con đường sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật, các công trình của Zeeman (2010) và Geigenberger (2011) đã xác định chu trình gồm ba bước: (1) Cung cấp Glucose-6-phosphate vào thể lạp; (2) Chuyển hóa Glucose-1-phosphate và ATP thành ADP-glucose dưới sự xúc tác của enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase gồm tiểu đơn vị lớn AGPL và tiểu đơn vị bé AGPS); (3) Tổng hợp chuỗi glucan nhờ enzyme Starch Synthase (SS gồm GBSS tổng hợp amylose, các nhóm hòa tan SSI, SSII, SSIII tổng hợp amylopectin), enzyme phân nhánh Starch Branching Enzyme (SBE) và enzyme khử phân nhánh Debranching Enzyme (DBE).

Các nghiên cứu về enzyme SSIV (Roldán et al., 2007; Szydlowski et al., 2009; D'Hulst & Mérida, 2010; Gámez-Arjona et al., 2011) chứng minh SSIV giữ vai trò chủ chốt trong việc khởi đầu hình thành các hạt tinh bột trong lục lạp và lạp bột. Việc biểu hiện quá mức gen SSIV đã làm tăng hàm lượng tinh bột tích lũy ở cây mô hình Arabidopsis thaliana và củ khoai tây.

Về công nghệ chuyển gen trên cây sắn, Taylor et al. (2004) tổng kết 4 hệ thống mô đích gồm: mô lá non, cấu trúc phôi, mảnh lá mầm và mô sẹo phôi hóa (FEC). Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens vào FEC được đánh giá tối ưu hơn súng bắn gen (Schöpke et al., 1996) do tỷ lệ tích hợp 1 bản sao cao (khoảng 50% so với 10% của súng bắn gen) và ít tạo thể khảm (Li et al., 1996; González et al., 1998; Bull et al., 2009; Evans et al., 2015).

Vị trí của luận án: Kế thừa các phát hiện quốc tế về vai trò của gen SSIV và quy trình tạo FEC ở sắn, luận án lựa chọn phân lập gen SSIV trực tiếp từ giống sắn bản địa Việt Nam, kết hợp sử dụng promoter chuyên biệt cho củ C54 để khắc phục hiện tượng biểu hiện phân tán của promoter cấu trúc CaMV 35S, tạo tiền đề nâng cao hàm lượng tinh bột trên giống sắn trồng trọt KM140.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh học phân tử thực vật, di truyền học chức năng và công nghệ tế bào thực vật. Nghiên cứu kết hợp phương pháp định tính (phân tích hình thái mô sẹo, phát sinh phôi vô tính, kiểm tra mô học GUS) và định lượng thực nghiệm (Real-time PCR, đo mật độ quang xác định hàm lượng tinh bột, Southern blot).

• Hệ thống gen và enzyme nghiên cứu:
  • AGPS, AGPL: Mã hóa tiểu đơn vị bé và lớn của ADP-glucose pyrophosphorylase.
  • GBSS: Enzyme Granule-bound starch synthase chịu trách nhiệm tổng hợp amylose.
  • SSI, SSII, SSIII, SSIV: Các enzyme Starch Synthase hòa tan tham gia kéo dài chuỗi và khởi động tạo hạt tinh bột.
  • SBE: Enzyme phân nhánh tinh bột tạo liên kết $\alpha-1,6$ glucan.
• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết RNA tổng số bằng phương pháp CTAB cải tiến hoặc bộ kit chuyên dụng; xử lý loại bỏ DNA bằng DNase I; kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch trên máy quang phổ đo chỉ số $A_{260}/A_{280}$.
  • Tổng hợp cDNA sợi một từ RNA tổng số; kiểm tra chất lượng cDNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen nội chuẩn Actin.
  • Định lượng mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Real-time PCR trên hệ thống máy luân nhiệt với hóa chất huỳnh quang SYBR Green.
  • Nhân dòng đoạn gen SSIV và promoter C54 bằng kỹ thuật PCR sử dụng enzyme Taq polymerase / Pfu polymerase với các cặp mồi đặc hiệu; giải trình tự nucleotide và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI.
  • Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang cấu trúc: (1) pK7WG2D mang 35S:SSIV:T35S (biểu hiện cấu trúc toàn cây); (2) pBI121 mang C54:SSIV-cmyc:NOST (biểu hiện đặc hiệu ở rễ củ).
  • Kiểm tra thể chuyển gen bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu, kỹ thuật Southern blot (xác định số bản sao T-DNA tích hợp) và RT-PCR (đánh giá mức phiên mã gen chuyển).
• Phương pháp nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen:
  • Khởi tạo mô sẹo, cảm ứng phôi soma sơ cấp và thứ cấp từ mảnh lá non, đỉnh sinh trưởng và chồi nách trên môi trường khoáng MS (Murashige and Skoog) bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Picloram (8 - 12 mg/L), 2,4-D, BAP.
  • Nuôi cấy huyền phù và cảm ứng tạo mô sẹo phôi hóa (FEC) trên môi trường chuyên dụng (CI, CIM, CAM).
  • Tái sinh chồi và tạo rễ hoàn chỉnh trên môi trường bổ sung Cytokinin (BAP, Kinetin) và Auxin (IBA, NAA).
  • Biến nạp gen qua Agrobacterium tumefaciens (chủng LBA4404 hoặc EHA105) có bổ sung Acetosyringone (AS) 100 - 200 µM trong giai đoạn đồng nuôi cấy.
  • Chọn lọc mô chuyển gen bằng kháng sinh Kanamycin (nồng độ xác định qua đường cong mẫn cảm).
  • Nhuộm hóa mô đánh giá hoạt tính enzyme GUS bằng cơ chất X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide).
• Phương pháp hóa sinh: Định lượng hàm lượng tinh bột tích lũy trong mô lá và rễ bằng phương pháp nhuộm Iodine và đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 620 nm, tính toán dựa trên đường chuẩn tinh bột tinh khiết.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 tổng thuật các kiến thức chuyên ngành về cây sắn, bao gồm: nguồn gốc phân loại thực vật học, đặc điểm hình thái học của rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt; các đặc tính nông học, sinh thái và di truyền ($2n = 36$). Chương này phân tích chi tiết tình hình sản xuất sắn trên thế giới (Châu Phi, Châu Á, Châu Mỹ Latinh) và tại Việt Nam qua các giai đoạn từ năm 2010 đến 2016.

Tác giả phân tích các yếu tố chính chi phối hàm lượng tinh bột trong củ sắn: yếu tố di truyền giống, cường độ quang hợp và sự phân bổ chất đồng hóa giữa thân lá và rễ củ, điều kiện chiếu sáng (tối ưu 12 giờ/ngày), nhiệt độ (thích hợp 20 - 40°C), hạn hán và thời vụ thu hoạch. Về mặt sinh hóa, chương tổng kết toàn diện chu trình sinh tổng hợp tinh bột với cấu trúc phân tử của amylose (liên kết $\alpha-1,4$) và amylopectin (liên kết $\alpha-1,4$ và $\alpha-1,6$), chức năng của các họ gen xúc tác (AGPase, SS, GBSS, SBE, DBE).

Phần cuối chương phân tích tiến trình ứng dụng công nghệ sinh học trên sắn: từ các kỹ thuật tái sinh in vitro (phát sinh cơ quan trực tiếp, tạo phôi soma, tạo mô sẹo phôi hóa FEC) đến các phương pháp chuyển gen (súng bắn gen, biến nạp nhờ A. tumefaciens), tổng hợp 25 công trình chuyển gen tiêu biểu trên thế giới từ năm 1996 đến 2015.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả hệ thống nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị, môi trường nuôi cấy và các quy trình thực nghiệm:

• Vật liệu thực vật và chủng vi sinh vật: Thu thập các mẫu lá và củ của các giống sắn (KM140, HB80, KM94, SM937-26...) tại Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế và Trung tâm Hưng Lộc. Chủng vi khuẩn E. coli DH5α, A. tumefaciens mang vector nhị thể pK7WG2D và pBI121.
• Quy trình sinh học phân tử: Trình bày chi tiết danh mục các cặp mồi PCR nhân dòng gen SSIV, mồi nhân promoter C54, mồi kiểm tra đoạn chèn cmyc, mồi định lượng Real-time PCR cho 8 gen trong con đường tổng hợp tinh bột và mồi nội chuẩn Actin. Mô tả quy trình tách chiết RNA bằng CTAB cải tiến, chuyển ngược cDNA, phản ứng Real-time PCR, giải trình tự Sanger và lắp ráp vector chuyển gen tái tổ hợp.
• Quy trình nuôi cấy mô và biến nạp: Mô tả công thức môi trường khử trùng mẫu, cảm ứng mô sẹo, tạo phôi soma và phát triển mô FEC; các bước đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens, khử vi khuẩn bằng Cefotaxime/Timentin, chọn lọc mô sống sót trên môi trường chứa Kanamycin và tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh.
• Quy trình phân tích hóa sinh và phân tử: Trình bày phương pháp nhuộm mô GUS, kỹ thuật lai Southern blot với mẫu dò đặc hiệu, quy trình chiết xuất tinh bột và đo quang với thuốc thử Iodine để xác định hàm lượng tinh bột trong mô thực vật.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 4 nội dung nghiên cứu chính:

1. Đánh giá mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến tổng hợp tinh bột

Kết quả Real-time PCR trên 4 giống sắn đại diện qua các giai đoạn phát triển cho thấy:

• Gen AGPS và AGPL có mức biểu hiện tăng mạnh ở giai đoạn bắt đầu tích lũy tinh bột ở củ, trong đó giống sắn có hàm lượng bột cao thể hiện mức phiên mã AGPase vượt trội so với giống có hàm lượng bột thấp.
• Gen GBSS biểu hiện ưu thế ở mô củ, liên quan trực tiếp đến hàm lượng amylose.
• Các gen SSI, SSII, SSIII và đặc biệt là SSIV có sự biến động biểu hiện rõ nét giữa mô quang hợp (lá) và mô dự trữ (củ). Gen SSIV duy trì mức độ phiên mã ổn định ở giai đoạn hình thành và phân chia lạp bột, đóng vai trò khởi động cấu trúc hạt tinh bột.

2. Phân lập gen SSIV, promoter C54 và thiết kế vector chuyển gen

• Phân lập thành công đoạn gen SSIV từ củ giống sắn KM140. Trình tự nucleotide của gen phân lập có một số sai khác nucleotide dẫn đến sự thay đổi ở chuỗi axit amin suy diễn so với trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen NCBI, nhưng vẫn bảo tồn các vùng chức năng xúc tác đặc thù của enzyme Starch Synthase nhóm IV.
• Phân lập thành công đoạn promoter C54 đặc hiệu biểu hiện ở rễ củ sắn.
• Thiết kế thành công hai vector chuyển gen thực vật:
  • Vector pK7WG2D mang cấu trúc 35S:SSIV:T35S (dưới sự điều khiển của promoter cấu trúc CaMV 35S).
  • Vector pBI121 mang cấu trúc C54:SSIV-cmyc:NOST (dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu rễ củ C54 và gắn thẻ cmyc).

3. Đánh giá hoạt động của gen SSIV trên cây thuốc lá mô hình

• Biến nạp thành công 2 cấu trúc vector vào mô lá cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
• Phân tích PCR xác nhận sự có mặt của gen chuyển SSIV ở các dòng thuốc lá tái sinh.
• Phân tích Southern blot xác nhận gen chuyển tích hợp ổn định vào hệ gen cây thuốc lá với số lượng bản sao từ 1 đến 2 bản copy.
• Phân tích RT-PCR khẳng định gen SSIV được phiên mã hiệu quả trong các dòng cây chuyển gen.
• Định lượng hàm lượng tinh bột tích lũy:
  • Các dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:SSIV:T35S có hàm lượng tinh bột trong lá tăng từ 15,6% đến 35,4% so với dòng đối chứng không chuyển gen (WT).
  • Các dòng thuốc lá mang cấu trúc C54:SSIV:NOST có mức độ tích lũy tinh bột ở rễ cao hơn các dòng mang cấu trúc 35S:SSIV:T35S từ 19,7% đến 48,1% và cao hơn đối chứng (WT) từ 15,6% đến 65,7%.

4. Thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

• Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu (mảnh lá non, đỉnh sinh trưởng, chồi nách) và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng; xác định môi trường bổ sung Picloram thích hợp để cảm ứng mô sẹo phôi hóa (FEC) ở giống sắn KM140 và HB80. Tỷ lệ mô sẹo tạo phôi đạt trên 80% và tái sinh chồi thành công từ FEC.
• Tối ưu quy trình chuyển gen qua chỉ thị GUS: Xác định mật độ vi khuẩn A. tumefaciens tối ưu ở mức $OD_{600} = 0,6 - 0,8$, thời gian lây nhiễm 20 - 30 phút, nồng độ Kanamycin chọn lọc mô sẹo phôi hóa là 25 - 30 mg/L và chọn lọc chồi ra rễ là 15 - 20 mg/L. Nhuộm mô GUS cho kết quả bắt màu xanh đặc trưng tại các cụm tế bào phôi.
• Chuyển cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140: Tiến hành biến nạp trên các khối mô sẹo phôi hóa FEC của giống sắn KM140. Sau quá trình chọn lọc trên môi trường chứa Kanamycin và tái sinh chồi, các cây sắn sống sót được đưa ra thuần hóa ngoài nhà lưới. Kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu Promoter C54F / SSIV-R và cặp mồi kiểm tra vi khuẩn virF/R đã xác nhận bước đầu thu nhận được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính, không bị nhiễm khuẩn ngoại lai.

BÀN LUẬN KẾT QUẢ

Phần bàn luận làm rõ mối tương quan giữa mức độ phiên mã của các gen tổng hợp tinh bột với đặc tính tích lũy vật chất khô ở củ sắn. Tác giả luận giải việc sử dụng promoter C54 mang lại hiệu quả định hướng tích lũy tinh bột cao vượt trội tại cơ quan dự trữ (rễ/củ) so với promoter CaMV 35S, hạn chế được sự xáo trộn sinh lý ở mô lá quang hợp. Đồng thời, bàn luận khẳng định mô sẹo phôi hóa (FEC) là mô đích thích hợp nhất để chuyển nạp gen thành công ở các giống sắn khó tái sinh tại Việt Nam.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Phân lập và đánh giá thành công đặc điểm cấu trúc, mức độ biểu hiện của gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột từ lá và củ các giống sắn tại Việt Nam.
2. Đánh giá chức năng của cấu trúc gen SSIV trên cây thuốc lá mô hình; chứng minh các dòng chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST có mức độ tích lũy tinh bột ở rễ cao hơn dòng mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7 - 48,1% và cao hơn cây đối chứng không chuyển gen từ 15,6 - 65,7%.
3. Lần đầu tiên thử nghiệm chuyển thành công gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC) của giống sắn trồng trọt KM140 nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Bước đầu thu được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính qua kiểm tra PCR.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tiếp tục nuôi dưỡng, nhân nhanh và trồng khảo nghiệm các dòng sắn KM140 chuyển gen SSIV trong điều kiện nhà lưới đạt chuẩn an toàn sinh học để đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học, khả năng tạo củ và đo lường hàm lượng tinh bột củ thực tế.
• Khai thác quy trình tái sinh qua mô sẹo phôi hóa (FEC) và hệ thống vector biểu hiện đặc hiệu củ C54 để phục vụ chuyển các gen mục tiêu khác (như gen kháng bệnh chổi rồng, gen kháng bệnh khảm lá CMD, gen tăng cường vi chất) vào các giống sắn sản xuất chính tại Việt Nam.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu ứng dụng cấu trúc biểu hiện C54:SSIV sang các đối tượng cây lấy củ và cây lương thực dự trữ tinh bột khác như khoai lang, khoai tây.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Do giới hạn về thời gian sinh trưởng của cây sắn (chu kỳ vụ trồng kéo dài 7 - 10 tháng) và các quy định nghiêm ngặt về an toàn sinh học biến đổi gen, kết quả trên cây sắn KM140 mới dừng lại ở việc tạo ra cây chuyển gen hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm và nhà lưới, kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ở mức phân tử (PCR), chưa kịp thu hoạch củ thương phẩm để đánh giá hàm lượng tinh bột tích lũy và năng suất củ ngoài đồng ruộng.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Phân tích Southern blot xác định số vị trí gắn xen T-DNA trên hệ gen của các dòng sắn KM140 chuyển gen.
  • Phân tích mức độ biểu hiện của protein SSIV tái tổ hợp trong củ sắn bằng phương pháp Western blot hoặc ELISA.
  • Đánh giá tính ổn định di truyền của gen chuyển qua các thế hệ nhân giống vô tính bằng hom.
  • Khảo nghiệm đánh giá năng suất củ tươi, tỷ lệ chất khô và hàm lượng tinh bột củ của các dòng chuyển gen ở quy mô khảo nghiệm diện hẹp.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho các đối tượng và lĩnh vực chuyên môn:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học thực vật và Khoa học cây trồng. Các phần có giá trị tham khảo cao gồm: cơ sở dữ liệu biểu hiện của 8 gen sinh tổng hợp tinh bột qua Real-time PCR; quy trình chi tiết cảm ứng mô sẹo phôi hóa (FEC) trên các giống sắn khó tái sinh; thiết kế vector nhị thể mang promoter đặc hiệu củ.
• Các nhà chọn tạo giống và nghiên cứu cây trồng: Cung cấp thông tin thực nghiệm về nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (Picloram, BAP, 2,4-D) và kỹ thuật đồng nuôi cấy A. tumefaciens tối ưu cho các giống sắn nội địa Việt Nam (KM140, HB80).
• Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Cung cấp số liệu tổng quan về ngành sản xuất sắn, cân đối nguyên liệu cho công nghiệp chế biến nhiên liệu sinh học (Bio-ethanol E5/E10) và cơ sở khoa học để phát triển giống cây trồng biến đổi gen nâng cao chất lượng nông sản.

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò chính của gen SSIV trong con đường sinh tổng hợp tinh bột ở cây sắn là gì?
Gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase nhóm IV. Khác với các enzyme SS khác tham gia kéo dài mạch amylopectin, SSIV giữ vai trò chủ chốt trong việc kiểm soát và khởi động quá trình hình thành các hạt tinh bột (starch granule initiation) trong lục lạp và lạp bột, quyết định số lượng hạt tinh bột được tạo ra trong mỗi tế bào.

2. Tại sao tác giả lại sử dụng promoter C54 thay vì promoter CaMV 35S để điều khiển gen SSIV trên cây sắn?
Promoter CaMV 35S là promoter cấu trúc, kích hoạt biểu hiện gen liên tục ở tất cả các cơ quan của cây (lá, thân, rễ), có thể gây xáo trộn quá trình chuyển hóa hydratcacbon ở lá quang hợp. Trong khi đó, promoter C54 là promoter chuyên biệt, chỉ kích hoạt biểu hiện gen mạnh ở cơ quan dự trữ (rễ củ), giúp tập trung nguồn cơ chất để tăng cường tổng hợp và tích lũy tinh bột trực tiếp tại củ.

3. Kết quả thử nghiệm cấu trúc C54:SSIV trên cây thuốc lá mô hình đạt được chỉ số tích lũy tinh bột như thế nào?
Các dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST có hàm lượng tinh bột tích lũy trong rễ cao hơn từ 19,7% đến 48,1% so với các dòng thuốc lá mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S, và cao hơn từ 15,6% đến 65,7% so với cây đối chứng không chuyển gen (WT).

4. Khâu then chốt để chuyển gen thành công vào giống sắn KM140 trong luận án là gì?
Khâu then chốt là xây dựng thành công hệ thống tạo mô sẹo phôi hóa (FEC - Friable Embryogenic Callus) từ mô lá non và đỉnh sinh trưởng bằng môi trường bổ sung Picloram. Mô FEC có khả năng phân chia mạnh, đồng nhất và cho tỷ lệ tái sinh chồi cao sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

5. Luận án đã ghi nhận được kết quả cụ thể nào trên giống sắn KM140 chuyển gen?
Nghiên cứu đã chuyển thành công cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST vào mô FEC của giống sắn KM140, chọn lọc trên Kanamycin, tái sinh thành cây hoàn chỉnh và đưa ra thuần hóa ngoài nhà lưới. Kiểm tra sinh học phân tử bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã xác nhận thu được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Minh Hồng đã làm rõ mức độ biểu hiện của các gen chủ chốt trong con đường sinh tổng hợp tinh bột ở cây sắn và phân lập thành công gen SSIV cùng promoter đặc hiệu củ C54. Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả tăng cường tích lũy tinh bột vượt trội của cấu trúc C54:SSIV trên cây thuốc lá mô hình, đồng thời thiết lập hoàn chỉnh quy trình tái sinh mô sẹo phôi hóa (FEC) và chuyển nạp thành công cấu trúc gen này vào giống sắn sản xuất KM140 qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả thu được 7 dòng sắn chuyển gen dương tính tạo cơ sở khoa học và vật liệu phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn năng suất cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH BỘT Ở SẮN 1. Nguồn gốc và phân loại 1. Nguồn gốc Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây 5000 năm.

Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900 - 200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời (Rogers, 1965). Ở Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, Việt Nam và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ XVIII. Tuy nhiên, đến thế kỷ XIX, nghề trồng sắn và tiêu thụ sắn mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ.

Từ đó đến nay, diện tích, năng suất và sản lượng sắn ngày một tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007). Phân loại Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu dầu. Vào năm 1651 Bauhin là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ chi này khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thày tu Pháp A. Thevet mang từ Brazin về, ông đặt tên loài là Manihot theveti.

Có thể cho rằng loài cây đó hiện nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965). Năm 1776, Crantz công bố sự mô tả loài với tên Manihot esculenta, căn cứ 5 vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam năm 1726. Sau đó nhiều tác giả đã nghiên cứu về chi Manihot với các cách phân nhóm khác nhau. Đến năm 1938, Cifferi trở lại cách gọi tên của Crantz, ông dùng lại tên loài M.esculenta và không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt, ông cung cấp một quan niệm về các giống trồng phổ biến (cultivar).

Bảng phân loại cuối cùng của Rogers và Appan (1973) là kết quả của một công trình nghiên cứu rất đầy đủ về chi Manihot, tiến hành trong 20 năm với phương pháp phân loại số lượng. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền 1. Đặc điểm hình thái * Thân cây Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1 - 3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng.

Thân sắn có khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây. Thân và cành già đã hoá gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng.

Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh, phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom không bị mất nước (Tribadi và cs. * Lá sắn Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá. Cuống lá dài từ 3 - 30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tuỳ theo giống (màu vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi). Phiến lá thường chia 5 - 7 thuỳ nhưng cũng có khi không chia thuỳ.

Lá của cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chí thuỳ không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ của phiến lá thường giảm. Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi và cs.1: Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (Nguồ n: Liu và cs., 2011) Chú thích: A.

Cây sắn khi trồng ở ruộng; B. Củ sắn khi thu hoạch; C. Cây con nảy mầm từ hạt; G. Thân sắn dùng để trồng cây.

* Hoa sắn Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ phân cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hoá hoa hoặc do mầm hoa rụng đi. Những cụm hoa sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm. Cụm hoa gồm một trục dài 2 - 10 cm và các trục bên hợp lại thành chuỳ (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).

Hoa cái có năm lá đài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có một bầu hoa 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhuỵ ngắn với đầu nhuỵ uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn ở bên trong và có lông ở phía ngoài.

Có khoảng 8 - 10 nhị đực xếp thành hai vòng và mọc lên từ các thuỳ của mỗi đĩa phía dưới. Bao phấm mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012). Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây.

Hoa 7 đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào cuối buổi chiều. Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1 giờ, sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là 1 tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhuỵ trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất sau 1 ngày.

Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8 - 19 giờ (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012). * Quả và hạt Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1 - 1,5 cm. Quả có 3 ngăn được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa 1 hạt. Màu sắc quả thường biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng dến lục hay đỏ tía.

Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả. Hạt sắn hình trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu đỏ nâu trên nền kem hoặc xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012).

* Rễ sắn Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau đó các rễ phụ mọc ra, cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ. Rễ mọc ra từ hom đầu tiên thì mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hoá và dự trữ. Rễ đồng hoá thường cắm sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc.

Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ có một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể có hoặc không có cuống củ (Ceballos & Cruz, 2012). Đặc điểm sinh thái Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới (Allem.

Sắn được phân bố phổ biến từ 33 o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam. 8 Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi trồng. Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yucca (tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca (tiếng Bồ Đào Nha). Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích khá rộng từ 20 – 40oC.

Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tuổi thọ lá và chỉ số diện tích lá. Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC, tuổi thọ của lá giảm nhưng tăng số lá mới hình thành. Là cây ưa sáng, cây sắn thích hợp với thời gian chiếu sáng 12h/ngày để tích luỹ tinh bột về củ (Keating và cs. Đặc điểm di truyền Chi Manihot thuộc họ thầu dầu, có tới hơn 300 chi và 8000 loài hầu hết là cây nhiệt đới.

Đặc điểm của họ thầu dầu là thường hay có mạch, nhựa mủ. Chi Manihot thuộc nhóm Manihotae. Tất cả các loài trong chi đều có số lượng nhiễm sắc thể 2n= 36. Rogers & Appan (1973) đã xây dựng một bảng phân loại cho 98 loài thuộc chi Manihot, phân thành 17 nhóm.

Sự nhận dạng các loài và các nhóm dựa vào sự phân tích nhiều mặt của đặc điểm hình thái ở các bộ phận trên mặt đất. Nhờ vào bảng phân loại người ta đã lập được một bảng nhận dạng các loài trong chi. Giá trị của cây sắn Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới sau lúa và ngô (Kim và cs. Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84 - 87% khối lượng khô, là nguồn cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới.

Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg,. Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn còn góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Abrahamian & Kantharajah, 2011).