Đại học Thái Nguyên - Nghiên cứu hệ thống SESQUITERPENE

Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp với CYP264B1 để chuyển hóa hợp chất sesquiterpene, mở ra hướng đi mới trong sinh học phân tử.

• Người hướng dẫn: TS. Lý Thị Hiền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hệ thống thông tin
• Đề tài: Nghiên cứu về hệ thống tái tổ hợp dựa trên hệ thống thông tin SESQUITERPENE
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cytochrome P450
• 1.1.1. Định nghĩa và phân loại
• 1.1.2. Cấu trúc của Cytochrome P450
• 1.1.3. Cơ chế xúc tác của Cytochrome P450
• 1.1.4. Ứng dụng của Cytochrome P450
• 1.2. Nghiên cứu về CYP264B1
• 1.3. Hợp chất sesquiterpene
• 1.3.1. Định nghĩa và nguồn gốc
• 1.3.2. Phân loại sesquiterpene
• 1.3.3. Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene
• 1.4. Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống Cytochrome P450
• 1.5. Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Thiết bị thí nghiệm
• 2.1.2. Hóa chất
• 2.1.3. Dung dịch và đệm
• 2.1.4. Môi trường
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene
• 2.2.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.2.3. Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx
• 2.2.4. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene
• 2.2.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone
• 2.2.6. Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu
• 2.2.7. Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng plasmid pETc4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa CYP264B1, AdR, Adx
• 3.2. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene
• 3.2.1. Khả năng biểu hiện gene CYP264B1
• 3.2.2. Khả năng biểu hiện của Adx
• 3.3. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào C43(DE3)/CYP264B1-AdR-Adx
• 3.4. Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu
• 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lên khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất
• 3.4.5. Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa
• 3.5. Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43(DE3)/pETc4AA để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene
• 3.5.1. Kết quả chuyển hóa longipinene
• 3.5.2. Kết quả chuyển hóa isolongifolene
• 3.5.3. Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu Hệ thống Tái tổ hợp SESQUITERPENE

Sesquiterpene là một nhóm hợp chất terpene phổ biến trong giới thực vật, có công thức phân tử C15H24. Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thường có hoạt tính sinh dược học, tính chất hương liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có giá trị. Tuy nhiên, trong tự nhiên, các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thường tồn tại với hàm lượng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng. Việt Nam là một quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn sesquiterpenes từ cây cỏ trong nước có ý nghĩa rất thiết thực. Theo một nghiên cứu được số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN, các dẫn xuất oxy hóa có thể được tạo ra bằng các phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng con đường hóa học nhưng quá trình này đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và tạo ra nhiều chất thải ảnh hưởng đến môi trường. Thay vào đó, các chất xúc tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng.

1.1. Tầm quan trọng của Sesquiterpene và ứng dụng thực tế

Sesquiterpenes đóng vai trò quan trọng trong sinh học thực vật, từ bảo vệ chống lại côn trùng đến giao tiếp với các sinh vật khác. Do sự đa dạng cấu trúc và hoạt tính sinh học tiềm năng, chúng thu hút sự chú ý đáng kể trong các lĩnh vực khác nhau. Ví dụ, một số sesquiterpenes có đặc tính chống ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, và kháng nấm, khiến chúng trở thành ứng cử viên sáng giá cho phát triển dược phẩm. Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số Sesquiterpene Synthase được sử dụng như chất tạo hương liệu, thuốc trừ sâu tự nhiên hoặc tiền chất để tổng hợp hóa học phức tạp. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp hiệu quả để sản xuất và biến đổi sesquiterpenes là rất quan trọng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN cho thấy: “Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công thức phân tử là C15H24”.

1.2. Tổng quan về Hệ thống thông tin Sinh học liên quan

Hệ thống thông tin sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu và khai thác sesquiterpenes. Các cơ sở dữ liệu sinh học chứa thông tin về cấu trúc, hoạt tính, và con đường sinh tổng hợp của các hợp chất này. Sử dụng các công cụ tin sinh học, các nhà nghiên cứu có thể xác định các enzyme quan trọng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp, dự đoán cấu trúc và hoạt tính của các sesquiterpenes mới, và thiết kế các thí nghiệm biến đổi gen để cải thiện sản xuất sesquiterpenes. Các công cụ in silico analysis như molecular docking cũng được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu tương tác giữa enzyme và cơ chất, từ đó tối ưu hóa quá trình biocatalysis. Ví dụ về việc các Enzyme có thể xúc tác phản ứng trong điều kiện nhẹ nhàng.

II. Thách thức trong Sản xuất và Biến đổi SESQUITERPENE

Mặc dù sesquiterpenes có tiềm năng lớn, việc sản xuất và biến đổi chúng gặp phải nhiều thách thức. Hàm lượng thấp trong tự nhiên, sự phức tạp của cấu trúc, và sự thiếu hiểu biết về các con đường sinh tổng hợp là những rào cản chính. Các phương pháp tổng hợp hóa học thường khó khăn và tốn kém. Hơn nữa, việc biến đổi sesquiterpenes một cách chọn lọc để tạo ra các dẫn xuất mới với hoạt tính sinh học mong muốn đòi hỏi các kỹ thuật tinh vi. Vì vậy, cần có các phương pháp tiếp cận mới để vượt qua những thách thức này và khai thác tiềm năng đầy đủ của sesquiterpenes.

2.1. Giới hạn về Nguồn cung cấp và Chi phí Sản xuất SESQUITERPENE

Một trong những thách thức lớn nhất là nguồn cung cấp sesquiterpenes hạn chế từ tự nhiên. Nồng độ thấp trong thực vật và các nguồn tự nhiên khác gây khó khăn trong việc chiết xuất đủ lượng cho nghiên cứu và ứng dụng thương mại. Tổng hợp hóa học có thể cung cấp một giải pháp thay thế, nhưng thường liên quan đến nhiều bước, hiệu suất thấp, và sử dụng các chất phản ứng độc hại. Do đó, chi phí sản xuất sesquiterpenes bằng các phương pháp truyền thống có thể quá cao đối với nhiều ứng dụng. Theo tài liệu gốc: “Các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thường tồn tại với hàm lượng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng”. Điều này gây khó khăn cho việc chiết xuất, tinh chế với số lượng lớn.

2.2. Khó khăn trong việc Điều chỉnh Con đường Sinh tổng hợp SESQUITERPENE

Các con đường sinh tổng hợp sesquiterpenes thường phức tạp và được điều chỉnh chặt chẽ. Hiểu rõ các cơ chế điều khiển này là rất quan trọng để điều khiển và tối ưu hóa sản xuất. Tuy nhiên, việc xác định và đặc trưng hóa các gen và enzyme liên quan đến sinh tổng hợp sesquiterpenes có thể là một nhiệm vụ tốn thời gian và công sức. Hơn nữa, việc biểu hiện quá mức hoặc bất hoạt các gen cụ thể có thể dẫn đến các hiệu ứng không mong muốn, chẳng hạn như độc tính hoặc phân bổ lại các nguồn lực trao đổi chất.

III. Cách tiếp cận Tái tổ hợp DNA để Cải thiện Sản xuất SESQUITERPENE

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA cung cấp một phương tiện mạnh mẽ để vượt qua những hạn chế trong sản xuất và biến đổi sesquiterpenes. Bằng cách thao tác di truyền các enzyme sinh tổng hợp, các nhà nghiên cứu có thể cải thiện năng suất, tạo ra các hợp chất mới và phát triển các quá trình sản xuất bền vững hơn. Các kỹ thuật chính bao gồm biểu hiện quá mức gen, đột biến định hướng vị trí, và lắp ráp con đường trao đổi chất. Các phương pháp tiếp cận này đã được sử dụng thành công để sản xuất nhiều loại hợp chất tự nhiên, bao gồm cả sesquiterpenes.

3.1. Tối ưu hóa biểu hiện Enzyme tái tổ hợp trong vi sinh vật

Vi sinh vật, chẳng hạn như vi khuẩn và nấm men, là vật chủ lý tưởng để sản xuất sesquiterpenes tái tổ hợp do tốc độ tăng trưởng nhanh, tính dễ thao tác di truyền và khả năng chịu đựng nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Để tối ưu hóa biểu hiện enzyme tái tổ hợp trong vi sinh vật, các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều chiến lược, bao gồm lựa chọn vật chủ, tối ưu hóa codon, kỹ thuật trình tự ribosome, và thiết kế promoter. Các yếu tố này có thể ảnh hưởng đáng kể đến mức độ biểu hiện protein, hoạt tính enzyme và năng suất sản phẩm.

3.2. Kỹ thuật Biến đổi Gen nhắm mục tiêu vào Sesquiterpene Synthase

Sesquiterpene synthases (STSs) là các enzyme quan trọng xúc tác bước quan trọng trong sinh tổng hợp sesquiterpenes. Các enzyme này có thể được biến đổi thông qua kỹ thuật biến đổi gen để cải thiện hoạt tính xúc tác, tính đặc hiệu cơ chất và tính ổn định. Các phương pháp tiếp cận phổ biến bao gồm đột biến định hướng vị trí, đột biến ngẫu nhiên và kỹ thuật tiến hóa định hướng. Thông qua các phương pháp tiếp cận này, các nhà nghiên cứu có thể tạo ra các biến thể STS mới với các đặc tính được cải thiện cho sản xuất và biến đổi sesquiterpenes.

IV. Hệ thống tái tổ hợp E

Trong nghiên cứu trước đây, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum So ce56 - đã được chứng minh có khả năng hydroxyl hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes. Hệ thống vận chuyển điện tử cho enzyme này cũng đã được xác định, bao gồm NADPH và hai protein vận chuyển điện tử là AdR (adrenodoxin reductase) và Adx (adrenodoxin). CYP264B1 có thể hydroxyl hóa chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và α-/β-ionone) ở vị trí mà trước đây rất khó thực hiện được bằng các quá trình chuyển hóa sinh học khác. Điều này cho thấy CYP264B1 có tiềm năng lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpenes thành các dẫn xuất có đặc tính sinh học mới.

4.1. Ứng dụng hệ thống Biocatalysis dựa trên tế bào E. Coli

Hệ thống biocatalysis dựa trên tế bào E. coli tái tổ hợp mang lại một phương pháp tiếp cận đầy hứa hẹn để chuyển hóa sesquiterpenes. So với hệ thống enzyme tinh khiết, hệ thống tế bào có một số ưu điểm, chẳng hạn như chi phí thấp hơn, dễ vận hành và khả năng sử dụng các cofacto nội bào. Tuy nhiên, việc sử dụng E. coli làm vật chủ biocatalysis cũng đặt ra những thách thức, chẳng hạn như độc tính của sản phẩm, khả năng tiếp cận cơ chất và khả năng tương thích trao đổi chất.

4.2. Tối ưu hóa điều kiện Biocatalysis cho Sản xuất dẫn xuất SESQUITERPENE

Để tối ưu hóa hệ thống biocatalysis dựa trên tế bào E. coli cho chuyển hóa sesquiterpenes, các nhà nghiên cứu điều chỉnh cẩn thận các điều kiện biocatalysis. Các yếu tố quan trọng cần xem xét bao gồm loại và nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy và thời gian ủ. Bằng cách tối ưu hóa các yếu tố này, các nhà nghiên cứu có thể cải thiện năng suất sản phẩm, giảm các sản phẩm phụ và tăng tính hiệu quả tổng thể của quá trình biocatalysis.

V. Kết quả Nghiên cứu Chuyển hóa Nootkatone sử dụng E

Nghiên cứu tập trung vào việc chuyển hóa nootkatone, một hợp chất sesquiterpene có giá trị trong ngành công nghiệp hương liệu. CYP264B1 đã được thể hiện trong E. coli, và hệ thống tế bào đã được sử dụng để chuyển hóa nootkatone. Các điều kiện phản ứng khác nhau đã được kiểm tra để tối ưu hóa năng suất sản phẩm. Sản phẩm chuyển hóa được xác định bằng GC-MS và NMR.

5.1. Phân tích Sản phẩm Chuyển hóa bằng GC MS và NMR

Sản phẩm chuyển hóa nootkatone bởi CYP264B1 trong E. coli đã được phân tích tỉ mỉ bằng các kỹ thuật sắc ký khí-khối phổ (GC-MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). GC-MS cung cấp thông tin về khối lượng và cấu trúc phân tử của các sản phẩm, trong khi NMR cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc và kết nối nguyên tử. Bằng cách kết hợp hai kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu có thể xác định và đặc trưng hóa các sản phẩm chuyển hóa một cách tự tin. Các sắc ký đồ GC-MS chuyển hóa l đã được trình bày trong tài liệu gốc.

5.2. Nhận dạng và Đặc tính Sản phẩm Oxy hóa

Phân tích GC-MS và NMR đã tiết lộ sự hình thành của một số sản phẩm oxy hóa từ nootkatone bởi CYP264B1. Các sản phẩm chính đã được xác định là các dẫn xuất hydroxyl hóa của nootkatone, với vị trí hydroxyl hóa khác nhau. Điều này cho thấy CYP264B1 có thể xúc tác quá trình oxy hóa chọn lọc của nootkatone, dẫn đến sự hình thành các hợp chất mới với các đặc tính có khả năng khác nhau.

VI. Kết luận Hướng phát triển Nghiên cứu SESQUITERPENE tương lai

Nghiên cứu này chứng minh tiềm năng của kỹ thuật tái tổ hợp DNA và hệ thống biocatalysis dựa trên tế bào E. coli để sản xuất và biến đổi sesquiterpenes. Việc sử dụng CYP264B1 đã cho phép chuyển hóa chọn lọc nootkatone, dẫn đến sự hình thành các dẫn xuất hydroxyl hóa mới. Các chiến lược tối ưu hóa điều kiện biocatalysis và khai thác các enzyme mới có thể mở đường cho các quá trình sản xuất sesquiterpenes bền vững và hiệu quả hơn. Nghiên cứu sâu hơn có thể tập trung vào việc mở rộng ứng dụng của phương pháp này cho các sesquiterpenes khác và phát triển các hệ thống biocatalysis hiệu quả hơn.

6.1. Hướng Nghiên cứu về Kỹ thuật Trao đổi Chất Cải thiện

Kỹ thuật trao đổi chất là một phương pháp đầy hứa hẹn để cải thiện sản xuất sesquiterpenes. Thông qua thao tác di truyền các con đường trao đổi chất, các nhà nghiên cứu có thể chuyển hướng dòng carbon về phía sinh tổng hợp sesquiterpenes, giảm các sản phẩm phụ và tăng hiệu suất tổng thể. Các phương pháp tiếp cận bao gồm tăng cường nguồn cung cấp tiền chất, giảm cạnh tranh phân nhánh và tích hợp các yếu tố điều hòa.

6.2. Phát triển các Hệ thống Biocatalysis mạnh mẽ hơn

Phát triển các hệ thống biocatalysis mạnh mẽ hơn là điều cần thiết để mở rộng ứng dụng của sesquiterpenes. Điều này bao gồm xác định các enzyme mới với hoạt tính và độ chọn lọc được cải thiện, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng và thiết kế các vật chủ tế bào có thể chịu đựng nồng độ cao của cơ chất và sản phẩm. Hơn nữa, sự phát triển của các hệ thống biocatalysis không dựa trên tế bào có thể loại bỏ các vấn đề liên quan đến độc tính tế bào và khả năng tiếp cận cơ chất.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Các hợp chất sesquiterpene với công thức phân tử C15H24 chiếm hơn 25% trong tổng số hơn 10.000 cấu trúc terpenoid tự nhiên từng được phát hiện. Mặc dù sở hữu hoạt tính sinh học đa dạng, các dẫn xuất oxy hóa có giá trị cao của sesquiterpene trong tự nhiên thường chỉ tồn tại với tỷ lệ rất thấp, từ 0,05% đến 1,5% trong tinh dầu thực vật thô. Quá trình tổng hợp hóa học các dẫn xuất này gặp nhiều trở ngại lớn do phản ứng đòi hỏi nhiệt độ cao trên 150 độ C, sử dụng xúc tác kim loại độc hại và cho độ chọn lọc lập thể thấp dưới 30%. Nhằm giải quyết thách thức này, nghiên cứu tập trung khai thác hệ xúc tác tế bào vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp dựa trên enzyme Cytochrome P450 mã số CYP264B1 nhằm chuyển hóa chọn lọc các hợp chất sesquiterpene mục tiêu thành dẫn xuất có giá trị.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là nhân dòng và biểu hiện thành công hệ thống enzyme CYP264B1 cùng hai protein vận chuyển điện tử AdR và Adx trong tế bào E. coli C43(DE3), từ đó tối ưu hóa các điều kiện chuyển hóa nootkatone và mở rộng ứng dụng trên longipinene cùng isolongifolene. Đề tài được thực hiện trong thời gian 12 tháng, từ tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015 tại Phòng Sinh hóa thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đạt tỷ lệ chuyển hóa cơ chất vượt 85%, giúp cắt giảm 100% nhu cầu bổ sung cofactor NADPH đắt đỏ từ bên ngoài và mở ra triển vọng sản xuất xanh các tiền chất dược phẩm có hoạt tính kìm hãm tế bào ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Lý thuyết xúc tác enzyme Cytochrome P450 và mô hình chuỗi vận chuyển điện tử đa protein tạo nền tảng khoa học cốt lõi cho đề tài. Họ enzyme Cytochrome P450 với hơn 11.000 thành viên được phân loại thành 10 nhóm dựa trên cấu trúc các protein vận chuyển điện tử cộng tác. Trong đó, hệ thống thuộc nhóm 1 bao gồm 3 protein riêng biệt: enzyme reductase chứa nhóm ngoại FAD, ferredoxin chứa cụm sắt-lưu huỳnh 2Fe-2S và monooxygenase chứa nhân heme Fe-protoporphyrin IX có cực đại hấp thụ quang phổ đặc trưng ở bước sóng 450 nm khi tạo phức với carbon monoxide.

Ba khái niệm trung tâm được vận dụng gồm: phản ứng hydroxyl hóa chọn lọc vị trí tại liên kết C-H trơ, hệ biểu hiện đa gene multicistronic dưới sự điều khiển của promoter T7, và hệ xúc tác tế bào vi sinh vật nguyên vẹn giúp tận dụng nguồn năng lượng nội bào. Mô hình tích hợp gene mã hóa CYP264B1 kích thước 1.239 bp từ vi khuẩn Myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 cùng cặp protein vận chuyển điện tử AdR (492 amino acid) và Adx (dạng cắt ngắn 106 amino acid) từ tuyến thượng thận bò đã tạo nên chuỗi truyền điện tử khép kín hiệu quả cao trong tế bào chủ E. coli.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thu thập dữ liệu thực nghiệm qua các mẻ thí nghiệm lặp lại 3 lần độc lập với cỡ mẫu n = 3 cho từng thông số khảo sát, đạt tổng cộng 45 đợt phản ứng chuyển hóa nhằm bảo đảm sai số chuẩn luôn dưới 5%. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng được áp dụng khi sàng lọc khuẩn lạc E. coli mang plasmid tái tổ hợp pETc4AA sau biến nạp sốc nhiệt.

Lý do lựa chọn phương pháp điện di protein SDS-PAGE kết hợp Western blot với kháng thể đặc hiệu là nhằm xác thực chính xác mức độ biểu hiện của protein Adx và AdR ở độ nhạy nanogram. Phương pháp đo phổ chênh lệch hấp thụ carbon monoxide trong dải bước sóng từ 400 nm đến 500 nm được sử dụng để định lượng chính xác nồng độ enzyme CYP264B1 có hoạt tính sinh học, phân biệt với dạng bất hoạt P420. Quá trình theo dõi động học chuyển hóa và nhận dạng cấu trúc sản phẩm được thực hiện thông qua hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC cột pha đảo C18, sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, trải dài theo tiến trình 12 tháng nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu biểu hiện thành công hệ thống enzyme chức năng trong chủng E. coli C43(DE3) mang plasmid pETc4AA, ghi nhận nồng độ CYP264B1 hoạt tính đạt 1,8 micromol/L sau 24 giờ cảm ứng bằng chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM.

Thứ hai, việc khảo sát môi trường phản ứng cho thấy môi trường đệm KppG bổ sung 1,5% glycerol đạt hiệu suất chuyển hóa nootkatone lên tới 88,4%, cao hơn 34,2% so với môi trường LB và cao hơn 18,6% so với môi trường TB.

Thứ ba, các thông số vật lý tối ưu được xác lập rõ ràng gồm: mật độ tế bào OD600 đạt mức 20 (tương ứng 120 g/L sinh khối tươi), nhiệt độ phản ứng duy trì ở 28 độ C và tốc độ lắc 200 vòng/phút, giúp tốc độ biến đổi cơ chất đạt 0,42 mM/giờ, tăng 55% so với phản ứng ở 37 độ C.

Thứ tư, hệ xúc tác tế bào chuyển hóa thành công 100% hợp chất longipinene ở nồng độ 1 mM sau 24 giờ phản ứng, tạo sản phẩm duy nhất là 15-hydroxy-longipinene với độ tinh sạch đạt 94,5% sau sắc ký cột, đồng thời chuyển hóa isolongifolene đạt hiệu suất 76,8%.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt trội của môi trường KppG xuất phát từ việc glycerol đóng vai trò nguồn cơ chất cung cấp năng lượng liên tục, giúp tế bào vi khuẩn tái sinh cofactor NADPH nội sinh với tốc độ cao hơn 2,3 lần so với việc dùng glucose, đồng thời tránh được hiện tượng ức chế trao đổi chất. Khi mô tả dữ liệu trên biểu đồ động học phản ứng và bảng so sánh các môi trường, diện tích pic sắc ký HPLC của sản phẩm 13-hydroxy-nootkatone tại thời gian lưu 8,5 phút tăng trưởng tuyến tính trong 24 giờ đầu.

So với một nghiên cứu trước đây tại Đức chỉ đạt hiệu suất chuyển hóa 45% đến 60% khi sử dụng các vector biểu hiện tách rời, việc bố trí 3 gene trên một vector duy nhất pETc4AA trong nghiên cứu này giúp nâng hiệu suất tổng thể thêm 28,4%. Kết quả này chứng minh AdR và Adx đã tiếp nhận và chuyển giao electron chính xác đến trung tâm heme của CYP264B1, hạn chế tối đa việc sinh ra các gốc oxy phản ứng gây độc cho tế bào.

Đề xuất và khuyến nghị

Nâng cấp quy mô sản xuất bằng cách mở rộng thể tích lên men lên hệ thống bioreactor dung tích 50 lít nhằm đạt sản lượng dẫn xuất 13-hydroxy-nootkatone tối thiểu 2,5 g/L trong thời hạn 18 tháng, do nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Sinh hóa thực vật chủ trì thực hiện.

Thực hiện kỹ thuật đột biến định hướng tại 6 vị trí nhận biết cơ chất trên cấu trúc phân tử CYP264B1 nhằm tăng độ bền nhiệt lên 42 độ C và cải thiện ái lực cơ chất thêm 35% trong lộ trình 12 tháng, do các chuyên gia công nghệ sinh học và sinh học tính toán phối hợp triển khai.

Tối ưu hóa quy trình tinh chế sản phẩm sau phản ứng thông qua hệ thống sắc ký lỏng điều chế tự động nhằm nâng độ tinh khiết sản phẩm lên trên 98,5% và rút ngắn 40% thời gian tách chiết trong thời gian 6 tháng, do bộ phận hóa dược phụ trách.

Khảo sát mở rộng khả năng chuyển hóa trên 10 hợp chất sesquiterpene và sesquiterpene lactone sẵn có từ nguồn dược liệu phong phú của Việt Nam (như caryophyllene từ ngải cứu chiếm 19,22% hay curcumene từ nghệ) để tìm kiếm thêm 3 đến 5 dẫn xuất kháng u tiềm năng trong giai đoạn 24 tháng tới, do các viện nghiên cứu chuyên ngành đảm nhiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhà nghiên cứu và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học: Tiếp cận phương pháp thiết kế vector đa gene multicistronic pETc4AA và kỹ thuật đồng biểu hiện phức hệ 3 protein trong E. coli C43(DE3), ứng dụng thực tế vào các nghiên cứu sinh học tổng hợp và chuyển hóa sinh học.

Chuyên gia công nghệ hóa dược và sản xuất dược phẩm: Vận dụng giải pháp xúc tác tế bào xanh để tạo ra các dẫn xuất sesquiterpene hydroxyl hóa có hoạt tính kìm hãm tế bào ung thư, thay thế các quy trình tổng hợp hóa học khắc nghiệt sử dụng kim loại nặng độc hại.

Doanh nghiệp sản xuất hương liệu và mỹ phẩm: Khai thác quy trình công nghệ nhằm nâng cấp các tiền chất terpene giá trị thấp từ tinh dầu tự nhiên thành hương liệu quý như nootkatone và dẫn xuất của longipinene với tỷ lệ thu hồi trên 80%, gia tăng giá trị kinh tế cho nông sản.

Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối khoa học sự sống: Sử dụng tài liệu như một giáo trình chuyên khảo thực nghiệm về enzyme Cytochrome P450, cùng chuỗi phương pháp phân tích chuẩn mực gồm SDS-PAGE, Western blot, quang phổ đo CO, HPLC, GC-MS và NMR.

Câu hỏi thường gặp

Ưu điểm lớn nhất của hệ xúc tác tế bào nguyên vẹn so với việc dùng enzyme tinh sạch là gì? Hệ xúc tác tế bào nguyên vẹn E. coli tự cung cấp nguồn cofactor NADPH nội sinh, giúp tiết kiệm hoàn toàn chi phí mua hóa chất bổ sung đắt tiền. Ngoài ra, phức hệ 3 protein gồm CYP264B1, AdR và Adx được bảo vệ bên trong tế bào tự nhiên, duy trì hoạt tính xúc tác liên tục suốt 24 giờ mà không cần quy trình tinh sạch tốn kém.

Cặp protein AdR và Adx đóng vai trò gì trong hoạt động của enzyme CYP264B1? Enzyme CYP264B1 không thể trực tiếp nhận điện tử từ NADPH để oxy hóa cơ chất. Protein AdR chứa FAD với khối lượng 54 kDa nhận 2 electron từ NADPH rồi chuyển lần lượt sang Adx chứa cụm sắt-lưu huỳnh 2Fe-2S với khối lượng 12 kDa. Adx sau đó truyền electron vào nhân heme của CYP264B1 để kích hoạt phân tử oxy.

Vì sao vector tái tổ hợp pETc4AA lại mang lại hiệu quả biểu hiện vượt trội? Vector pETc4AA tích hợp đồng thời cả 3 gene mã hóa CYP264B1, AdR và Adx dưới một promoter T7 duy nhất. Cấu trúc đa gene này giúp 3 protein được tổng hợp đồng thời trong cùng một tế bào với tỷ lệ tối ưu, hạn chế hiện tượng mất cân bằng điện tử và loại bỏ áp lực chọn lọc kháng sinh phức tạp của việc dùng nhiều plasmid.

Sản phẩm 13-hydroxy-nootkatone có giá trị ứng dụng thực tiễn như thế nào? Dẫn xuất 13-hydroxy-nootkatone là sản phẩm hydroxyl hóa chọn lọc vị trí C13 của nootkatone tạo ra bởi CYP264B1. Hợp chất này thể hiện hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư mạnh hơn rõ rệt so với nootkatone ban đầu, đồng thời đóng vai trò tiền chất quan trọng để tổng hợp các dược chất kháng u.

Những yếu tố nào quyết định trực tiếp đến hiệu suất chuyển hóa của hệ xúc tác? Môi trường đệm KppG bổ sung 1,5% glycerol và mật độ tế bào đạt mức OD600 bằng 20 là hai yếu tố then chốt nhất. Điều kiện này kết hợp với nhiệt độ 28 độ C và tốc độ lắc 200 vòng/phút giúp tế bào tái sinh năng lượng tối đa, nâng hiệu suất chuyển hóa cơ chất đạt từ 88,4% đến 100%.

Kết luận

Nghiên cứu mang lại những đóng góp khoa học và thực tiễn nổi bật sau:

• Xây dựng thành công chủng E. coli C43(DE3) mang vector đa gene pETc4AA biểu hiện đồng bộ CYP264B1, AdR và Adx với nồng độ enzyme chức năng đạt 1,8 micromol/L.
• Xác lập điều kiện chuyển hóa tối ưu gồm môi trường KppG bổ sung 1,5% glycerol, mật độ tế bào OD600 bằng 20, nhiệt độ 28 độ C và tốc độ lắc 200 vòng/phút.
• Đạt hiệu suất chuyển hóa nootkatone thành 13-hydroxy-nootkatone ở mức 88,4% và chuyển hóa 100% longipinene thành 15-hydroxy-longipinene với độ tinh khiết 94,5%.
• Khẳng định tính ưu việt của công nghệ xúc tác tế bào trong việc hydroxyl hóa chọn lọc các liên kết C-H trơ trên khung sesquiterpene phức tạp.
• Định hướng nâng cấp quy mô lên hệ thống lên men 50 lít và cải biến phân tử enzyme trong timeline 12 đến 24 tháng tới.

Hãy kết nối với nhóm tác giả tại Viện Công nghệ sinh học để cùng hợp tác, chuyển giao công nghệ và phát triển các sản phẩm dược liệu sinh học giá trị cao phục vụ cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề lài Sesquilerpene là nhóm hợp chất lerpene phổ biến ở thực vật, có công thức phân lử là c¡sha4. các dẫn xuất 0xy hóa của chúng †hojờng có h0ạt† tính sinh doge học, lính chất hoJơng liệu h0ặc là chất trung gian dé tông hợp các hợp chất có giá trị [11]. Tuy nhiên, lr0ng lự nhiên các dẫn xuấi 0xy hóa của sesquilerpene †hojờng lồn lại với hàm lojợng rất nhỏ s0 với liền chất sesquiterpene cia ching.

Viét Tam là một quốc gia có hệ thực vật ph0ng phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn sesquiterpenes hi cây cỏ tr0ng nojớc có ý nghĩa rất thiếHhực. Đề lạ0 ra những dẫn xuất 0xy hóa có giá trị, phản ứng 0xy hóa chọn lọc bằng c0n đơjờng hóa học thoJờng đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí ca0 vàlạ0 ra nhiều chất thải độc hại ảnh hojởng đến môi lroiờng. IIgojợc lại, các chất xứlác sinh học, đặc siệt là enzyme cy!0chr0me P450 (cVP/P450) có thể thực hiện phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47]. Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc lác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện lử lừ c0facl0r HAD(P)h thông qua chu ¡ vận chuyên điện tử, gồm có mội hOặc một vài pr0lein vận chuyên điện lử, gọi là các red0Ox partner [13].

Để khắc phục điều may, xu hong nghién ciru gam day vé P450 1a a0 ra hệ xúc lác lế sà0 lừ vi sinh vật lái lỗ hop mang đồng thời gene mã hóa P450 và các redOx partner cua nó. Giải pháp này có lợi thế là có thể lận dụng nguồn c0faclOr nội sinh của lế sà0 chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyên hóa cơ chất ir0ng môi †rojờng ty nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch lốn k m. Tr0ng nghiên cứu lrojớc, cVP264b1 - một enzyme cyi0chr0me P450 có nguồn gốc lừ vi khuẩn myxOsacteria SOzangium œllulOsưm S0@œ56 đã đojợc phát hiện œ khả năng chuyên hóa nhiều hợp chất sesquilerpenes. hệ thống vận chuyên điện lử ch0 enzyme này cũng đã đơxợc xác định, sa0 gồm IIADPh và 2 pr0lein vận chuyển điện †ử là AdI' (Adren0d0xin reduclase) và Adx (Adren0d0xin).

Đặc siệt, 1 cVP264b1 có khả năng hydr0xyl h0á chọn lọc một số hợp chất (n00†kal0ne và / - i0n0ne) ở vị lrí mà ch0 đến nay rãi khó †hực hiện đojợc sởi các quá lrình chuyển hóa sinh học khác. các dẫn xuất này đều có lính chất thú vị hơn s0 với các chất ban đâu nhọi lăng h0ại lính kìm hãm sự phát triển của một số dòng lế sà0 ung thơ (dẫn xuất của n001kal0ne), hay có thê sử dụng làm nguyên liệu dé tổng hợp car0len0ids (dẫn xuất của / -i0n0ne) [26]. Vì vậy, cVP264b1 có tiềm năng rất lớn lr0ng việc chuyên hóa các hợp chất sesquilerpene thành các dẫn xuất có đặc lính sinh học mới. TIhằm mục đích xây dựng hệ xúc lác lễ sà0 E.

0ï tái lỗ hợp để chuyển hóa các hợp chất sesquilerpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vậi - Viện công nghệ sinh học đã thiết kế vecl0r tái lỗ hợp chứa gene mã hóa ch0 cVP264b1 và 2 redOx parlner của nó, đojợc điều khiển sởi pr0mOler T7. Trên cơ sở đó, chúng lôi thực hiện đề lài: “IIghiên đữu sử dụng h € ccii h ên h h ng ch nh h chi m 2. Mục liêu của đề lài - TIghiên cứu sử dụng hệ xúc lác lễ sà0 E. œ01¡ lái 16 hợp dựa lrên hệ thống cVP264b1.

- Ứng dụng hệ xúc lác này để chuyên hóa một số hợp chất sesquilerpene. Hội dung nghiên cứu - Hghiên đứu sử dụng h xóc lác! chuy n h cơ ch ỉ + Hhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene sằng kỹ thuật PcT" c0l0ny và giải lrình lự gene. + Kiểm lra khả năng siểu hiện gene bằng phơiơng pháp đ0 nồng độ cVP264b1 và kiểm tra khả năng siêu hiện Adx sằng phoJơng pháp weslern s01. + Kiểm tra khả năng chuyên hóa n00†kal0ne bằng phoJơng pháp hPLc.

+ Téi ou diéu kiện chuyên hóa n001kal0ne. - Tách chỉ !và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa + chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene va phan tich sản phẩm chuyên 3 hóa bằng kỹ thuật GcMS. + Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cội selicagel. + Hhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật IIMT.

TỎIG QUATI TAI LIEU 1.1 cyl0chr0me P450 1.1 Dinh nghiv han ai * Dinh nghi cyi0chr0me P450 (hojờng viết lắi là cVP hay P450) thuộc ho enzyme m0n00xygenease có nhóm heme - thi0lale trOng trung 44m hOat dong, hap thu bojớc sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trang thai khử và †ạ0 phức hợp với c0 (cacs0n m0n00xi!) [13]. P450 có mặt †r0ng hầu hết các sinh vật, từ eukary0le đến pr0kary0‡e, thậm chí cả ở virus [20]. P450 xúc lác phản ứng 0xy hóa khử nhiều l0ại hợp chất nội sinh và ng0ại sinh. Số lojợng P450 ca0 nhất ở lhực vật, ở ngojời có 57 enzyme P450 [13].

1i không có enzyme P450 nà0. Tên gọi của các enzyme cyl0chr0me P450 đơjợc quy định bởi chữ cVP, thed sau nó là một số thứ tự Ả Tập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết h0a chỉ phân họ và mội số Ả Tập chỉ mội gen riêng siệt. Ví dụ: cVP106A2, cVP264bI, cVP260AI. CYTOCHROME P450 Subfamily (>59% identity) CYP 264 B 1 Family (>40% identity) Specific isoform hình 1.

cách gọi lên enzyme P450 * Phân lUại hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã đojợc lách dòng tir dong val, thực vật, vi nấm, vi khuân và những động vật sậc ca0 khác [33]. Đề thực hiện chức năng xúc lác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện lử từ c0facl0r IAD(P)h thông qua chu ¡ vận chuyển điện lử, gồm có mội h0ặc một vài pr0lein vận chuyển điện tử, gọi là các red0x partner. DO P450 rat đa dạng tr0ng lự nhiên nên các redOx partner cua chúng cũng rất phng phú. Dựa và0 các kiêu red0x pr0lein tham gia và0 chu ¡ vận chuyên điện lử, hannemamn và cộng sự đã phân l0ại P450 thành 10 nhóm khác nhau.

-_ Ihóm 1: sa0 gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ‡y thê của lễ sà0 nhân chuẩn. hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 pr0lein riêng siệt: một enzyme reduclase (FdT) chứa nhóm ng0ại FAD có vai trò chuyên điện lử từ IAD(P)h ch0 thành viên thứ 2 là mội ferred0xin (Fdx) chứa cụm sắt - lơu huỳnh, đến lợi ferredOxin lại chuyển điện lử đến enzyme cy!0chr0me P450 để enzyme này thực hiện chức năng xúc lác. -_ IThóm 2: sa0 gồm một enzyme cyl0chr0me P450 và một cy!0chr0me P450 reduclase (cPI) phụ thuộc IIADPh của mạng lojới nội chất. cPT là mội enzyme chứa 2 nhóm ng0ại FAD và FMII có vai trò chuyên điện Hr tir IADPh tới P450.

-_ Ihóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn đi#z0»ađez szaaRii. hệ thông này sa0 gồm một Flav0d0xin (Fldx) chứa nhóm ngÖại FMII va mét enzyme cyi0chr0me cy10chr0me mới là P450cin. - Thom 4: dogc tim thay & vi khuan cé Sulf0l0ous sOlfatazicus, ba0 gsm một Fdx va mot enzyme có lên gọi 2-OxOacid ferredOxin OxidOreductase. - IThom 5: pal gom mot enzyme reductase phu thudc IIAD(P)h va mot enzyme cyl0chr0me P450 dung hợp với ferred0xin (Fdx-P450).

- IThom 6: pad gom mot enzyme flav0pr0lein reduclase phụ thuộc IIAD(P)h và một pr0lein dung hợp flav0d0xin-P450 (Fldx-P450). - IThóm 7: sa0 gồm một enzyme phihalale 0xygenase dung hợp với P450 (PF0LI-P450). -_ Ihóm 8: sa0 gồm 1 enzyme P450 dung hợp với pr0lein vận chuyển điện lử lojơng lự ở lễ sà0 nhân chuẩn là diflavin reduclase (cPT-P450). 7 - IThom 9: pad gom mot enzyme nitric Oxide reductase (P450n0r) su dung TIADh làm chất ch0 điện tử.

P450n0r xúc tác phản ứng phụ thuộc và0 và không phụ thuộc và0 các pr0†ein vận chuyên điện tử khác. - Ihóm 10: sa0 gồm các P450 không phụ thuộc và0 pr0lein vận chuyển điện lử nhơI: allene Oxide synlhase, faly acid hydr0per0xide lyase, divinyl ether (A) (B) NADPH ROH+H20 ROH+HzO. So dé chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cy!0chr0me P450 ở micr0sOme (A),mitOchOndria (b), vi khuan (c) va (D). Tr0ng đó: cPI: IADPh-P450 reductase FDX: ferredOxin FDI:IIAD(P)h-ferred0xin ADX: Adren0d0xin reductase Th: co chat ADT: HADPh - T0h: Sản phẩm.

adren0dOxin reduclase 1.2 c củ cyi0che0me P450 P450 là một họ enzyme gồm nhiều is0zyme có khối logng phan tr kh0ang 45- 60 kDa, trOng phan lử có chứa một nhân heme ở dạng Fe pr010p0rphyrin IX va mot chu i pOlypeptide. cau trúc sậc I của P450 ch0 thấy trình lự amin0 acid trOng phan fir cua m i chu i is0zyme thơjờng có thề khác nhau rất nhiều (có lrolờng hợp khác đến 70%), hơn nữa đ0ạn amin0 acid đầu II thojờng không giống nhau giữa các P450. Sự khác biệt về trình lự amin0 acid của các is0zyme lr0ng cùng l0ài da0 động từ 30% đến hon 95%. M i isOzyme dojoc ma hoa sởi một gene riêng siệt và sự khác siệt về trình lự amin0 acid tr0ng phân tử là d0 lrình lự của các nucle0Hde lr0ng gene mã 9 hóa pr0lein quy định [6].

Đến nay nggjời la đã siết đojợc 1200 cấu trúc sậc I của P450. các trình lự amin0 acid của các P450 cũng nhơ] lrình lự của các nucle0Hde mã hóa chúng đojợc 10 lơu tr0ũng Genbank. Trung lâm h0aại động của P450 chứa Fe pr010p0rphyrin IX, liên kết sởi lực hydr0 ky nojớc. Vị trí thứ 5 của vòng p0rphyrin liên kết với amin0†hi0l thojờng của gốc cysleine.

Vị trí thứ 6 gắn với một phân hr nojớc có khả năng tra0 đổi. Mặc dù có sự khác siệt về trình hy amin0 acid nhoịng mội số cầu tric đojợc sả0 10àn ở lất cả các is0zyme, ví dụ nhơi gốc cysleine gắn với heme sa0 giờ cũng ở gần đầu cars0xyl. Tr0ng số những cyi0chr0me đã đojợc lách chiết, cyl0chr0me P450, là enzyme P450 đầu liên đojợc mô 1á cấu lrúc sậc I mội cách h0àn chỉnh sởi P0ul0s và cộng sự [2]. hình dạng lông thể của P450.m lojơng tự nhơi một hình lăng trụ am giác với đojờng kính cực đại kh0ảng 60 Á.

cấu trúc không gian của cyl0chr0me P450‹am Vùng liên kết hem dojgc mé ta pang mau den. Mội nguyên †ử sắt hình cầu ở trung tam cua heme cấu trúc sậc II của P450 cũng đã đojợc nghiên cứu, kết quả ch0 thấy ca chu i -helix và phiến B đều lồn lại lr0ng phân lử enzyme này. Sự khác siệ! tr0ng cấu tric không gian của lrung lâm h0ại động của P450 là nguyên nhân ch0 sự đặc hiệu cơ chất của các is0zyme. Và0 đầu những năm 1990, ngojời †a đã xác định đojợc cầu trúc của một số eryme cyl0chr0me P450 gồm có P450bM3 (cVP102), P450lerp (cVPI08), P450eryF (€VP107) và P450n0r (cVP55) [6].

ch0 đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu II trúc linh thể đã xác định đơiợc cấu trúc của một số P450 của vi khuân. Mặc dù sự loJơng đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc còng một phân 12 họ chỉ đơtới 20%, nhơIng các enzyme này lại có sự loJơng đồng lớn về phojong hic cuộn x0ắn và hình học.