Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu nho nhe vigna umbellata

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cho chuyển gen ở cây đậu nho nhe Vigna umbellata, góp phần nâng cao năng suất cây trồng.

• Tác giả: Vũ Thu Trang
• Người hướng dẫn: GS. Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu nho nhe (Vigna umbellata)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3.1. CÂY ĐẬU NHO NHE
• 3.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe
• 3.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe
• 3.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
• 3.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy in vitro mô tế bào thực vật
• 3.2.2. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
• 3.2.3. Các yếu tố đảm bảo thành công trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 4. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY IN VITRO PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY HỌ ĐẬU
• 5. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 5.1.1. Vật liệu thực vật
• 5.1.2. Hóa chất, thiết bị
• 5.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 5.2. Phương pháp nghiên cứu
• 5.2.1. Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro
• 5.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo
• 5.2.3. Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe từ lá mầm và chồi ngọn
• 5.2.4. Môi trường ra rễ
• 5.2.5. Ra cây và chế độ chăm sóc
• 5.2.6. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
• 6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 6.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt đậu Nho nhe
• 6.2. Tái sinh in vitro cây đậu Nho nhe
• 6.2.1. Tái sinh chồi cây đậu Nho nhe từ mô sẹo
• 6.2.2. Tái sinh chồi cây đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn
• 6.2.3. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn in vitro
• 6.2.4. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro
• 6.2.5. Chuyển cây in vitro ra môi trường tự nhiên
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cho cây đậu nho nhe

Cây đậu nho nhe, tên khoa học là Vigna umbellata, là một loài cây thuộc họ Đậu có giá trị dinh dưỡng cao. Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cho cây đậu nho nhe không chỉ giúp bảo tồn giống cây mà còn mở ra cơ hội cho việc cải thiện khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi. Hệ thống này cho phép tạo ra các cây con khỏe mạnh từ mô tế bào, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu nho nhe

Cây đậu nho nhe có chiều cao từ 30-100 cm, với hệ rễ phát triển mạnh mẽ. Hoa của cây thường có màu vàng và quả dài hình dải cong. Đậu nho nhe có khả năng phát triển tốt trong điều kiện khí hậu ẩm ướt và có thể chịu hạn tốt.

1.2. Giá trị dinh dưỡng và ứng dụng của cây đậu nho nhe

Hạt đậu nho nhe chứa nhiều protein, vitamin và khoáng chất, có giá trị dinh dưỡng cao. Loài cây này không chỉ được sử dụng làm thực phẩm mà còn có tác dụng trong y học, như chữa bệnh đau nhức xương khớp.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro

Mặc dù cây đậu nho nhe có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro gặp phải nhiều thách thức. Các yếu tố như môi trường nuôi cấy, chất kích thích sinh trưởng và điều kiện ánh sáng đều ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của cây. Việc tìm ra công thức môi trường tối ưu là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh in vitro

Các yếu tố như nồng độ hormone thực vật, pH của môi trường và nhiệt độ đều có ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh của cây đậu nho nhe. Nghiên cứu cần xác định các điều kiện tối ưu để đạt được tỷ lệ tái sinh cao.

2.2. Thách thức trong việc chuyển gen cho cây đậu nho nhe

Việc chuyển gen cho cây đậu nho nhe gặp khó khăn do khả năng tái sinh thấp và sự nhạy cảm với các tác nhân môi trường. Cần có các phương pháp cải tiến để nâng cao hiệu quả chuyển gen.

III. Phương pháp nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cho cây đậu nho nhe

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp nuôi cấy mô tế bào để tạo ra cây con từ mô sẹo, nách lá mầm và chồi ngọn. Các hormone như BAP và IBA được sử dụng để kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh để tối ưu hóa điều kiện phát triển.

3.1. Quy trình khử trùng và tạo mẫu sạch

Quy trình khử trùng hạt giống là bước đầu tiên quan trọng để tạo ra mẫu sạch cho nuôi cấy in vitro. Sử dụng các chất khử trùng như Javen giúp loại bỏ vi khuẩn và nấm mốc.

3.2. Môi trường nuôi cấy và hormone kích thích

Môi trường nuôi cấy được thiết kế với các thành phần dinh dưỡng cần thiết và hormone kích thích như BAP và IBA để thúc đẩy sự phát triển của chồi và rễ. Việc điều chỉnh nồng độ hormone là rất quan trọng để đạt được kết quả tối ưu.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ thống tái sinh in vitro cho cây đậu nho nhe có thể đạt được tỷ lệ tái sinh cao khi sử dụng môi trường và hormone phù hợp. Các cây con được tạo ra có khả năng sinh trưởng tốt và có thể chuyển ra môi trường tự nhiên.

4.1. Tỷ lệ tái sinh và chất lượng cây con

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh đạt khoảng 80% khi sử dụng môi trường nuôi cấy tối ưu. Các cây con có sức sống tốt và khả năng phát triển mạnh mẽ.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Hệ thống tái sinh in vitro có thể được áp dụng để sản xuất giống cây đậu nho nhe chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường và cải thiện năng suất nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro cho cây đậu nho nhe mở ra nhiều cơ hội cho việc cải thiện giống cây và nâng cao năng suất. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới sẽ giúp tối ưu hóa quy trình và ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu có thể mở rộng sang các loài cây khác trong họ Đậu, nhằm tìm ra các phương pháp tối ưu cho việc tái sinh in vitro và chuyển gen.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp

Công nghệ sinh học sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện giống cây trồng, giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây đậu Nho nhe (tên khoa học: Vigna umbellata) là cây họ Đậu giàu giá trị dinh dưỡng với hàm lượng protid đạt 20,9%, glucid chiếm 64,9% và cung cấp mức năng lượng khoảng 1373 kJ trên 100g hạt khô. Đây là nguồn thực phẩm giàu khoáng chất Ca, Fe, P cùng các vitamin nhóm B, đồng thời có khả năng cố định đạm sinh học giúp cải tạo đất bạc màu. Tuy nhiên, trước các tác động ngày càng gia tăng của biến đổi khí hậu, các loài cây họ Đậu thường có khả năng chống chịu kém với các stress phi sinh học như hạn mặn hoặc nhiệt độ cao. Việc ứng dụng công nghệ sinh học và kỹ thuật chuyển gen là hướng tiếp cận đột phá nhằm nâng cao tính chống chịu của cây trồng. Dù vậy, tỷ lệ thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc trực tiếp vào việc thiết lập được một hệ thống nuôi cấy và tái sinh in vitro ổn định với tần suất cao.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là xác định quy trình tái sinh đa chồi in vitro hoàn chỉnh ở cây đậu Nho nhe, làm cơ sở tin cậy phục vụ chuyển gen. Đề tài được triển khai từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, sử dụng mẫu hạt thu thập tại huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi giải quyết rào cản tái sinh ở loài cây hai lá mầm bản địa, đạt hiệu suất cảm ứng đa chồi lên tới 84,44% và hệ số tạo chồi đạt 4,07 chồi trên mỗi mẫu cấy, mở ra tiềm năng sản xuất giống cây họ Đậu chất lượng cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết tính toàn năng của tế bào thực vật (cellular totipotency) và cơ chế phản biệt hóa kết hợp tái biệt hóa tế bào dưới sự điều hòa của phytohormone. Khi được cung cấp nguồn dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, các tế bào mô phân sinh chưa hóa gỗ có khả năng phân chia, biệt hóa thành các cơ quan chức năng hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh.

Các khái niệm then chốt trong nghiên cứu gồm:

• Môi trường nuôi cấy cơ bản Murashige và Skoog (MS): Hệ dinh dưỡng tổng hợp chứa các khoáng đa lượng ở nồng độ trên 30 mg/l, các khoáng vi lượng cùng nguồn cacbon (sucrose 30 g/l) và agar 9 g/l làm chất đông tụ.
• Nhóm chất kích thích sinh trưởng Auxin (2,4-D, IBA, NAA): Tham gia kéo dài tế bào, phân chia tầng phát sinh và kích thích hình thành rễ bất định.
• Nhóm Cytokinin (BAP, Kinetin): Kích thích phân chia tế bào rất mạnh thông qua hoạt hóa tổng hợp acid nucleic và protein, đóng vai trò quyết định trong việc cảm ứng tạo đa chồi.
• Mô sẹo (Callus) và Tái sinh in vitro: Quá trình biến đổi mô biệt hóa thành mô chưa phân hóa, sau đó định hướng hình thành chồi hoặc phôi vô tính.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu thực vật là hạt đậu Nho nhe thu thập tại Yên Bái với tiêu chuẩn hạt mẩy, vỏ bóng, màu vàng nâu đồng đều và không nhiễm sâu bệnh.

• Quy mô và phương pháp chọn mẫu: Mỗi nghiệm thức khử trùng tiến hành trên 100 hạt; các thí nghiệm cảm ứng mô sẹo, tạo đa chồi và tạo rễ được thực hiện trên 30 mẫu cho mỗi công thức với 3 lần lặp lại độc lập. Mẫu cấy được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn trong các bình tam giác dung tích 250ml với mật độ tiêu chuẩn 6 mẫu trên một bình.
• Quy trình thực nghiệm: Tiến hành khử trùng hạt bằng cồn 70 độ kết hợp dung dịch Javen ở các nồng độ 50%, 60%, 70% trong các khoảng thời gian 15, 20, 25 phút. Khảo sát 3 nguồn mẫu cấy gồm mảnh lá 6 ngày tuổi (kích thước 0,5 x 1 cm), nách lá mầm 3-4 ngày tuổi có gây tổn thương cơ học và đoạn chồi ngọn 5-6 ngày tuổi (kích thước 0,5-1 cm). Mẫu được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 độ C, cường độ chiếu sáng 2000 lux với chu kỳ 12 giờ sáng mỗi ngày.
• Phương pháp xử lý số liệu: Toàn bộ dữ liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm định bằng phương pháp Duncan ở mức ý nghĩa alpha = 0,05 nhằm đảm bảo độ tin cậy khoa học cao nhất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện quan trọng có ý nghĩa quyết định đối với hệ thống tái sinh ở cây đậu Nho nhe:

Thứ nhất, việc khử trùng hạt bằng dung dịch Javen 60% trong thời gian 20 phút đem lại hiệu quả vượt trội nhất. Tỷ lệ mẫu sạch đạt 100%, tỷ lệ nảy mầm đạt 98% và tỷ lệ mẫu chết chỉ ở mức 1%. Ngược lại, Javen 50% khiến tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn lên tới 23-30%, trong khi Javen 70% gây độc làm tỷ lệ mẫu hạt bị chết tăng vọt từ 15% đến 35%.

Thứ hai, chồi ngọn (5-6 ngày tuổi) được xác định là vật liệu tiếp nhận cảm ứng tốt nhất. Các mảnh mô sẹo từ lá sau khi chuyển sang môi trường SIM đều bị hóa nâu đen và thoái hóa sau 4 tuần; các mẫu nách lá mầm dù được chích tổn thương cũng bị vàng úa và chết hoàn toàn sau 8 tuần nuôi cấy.

Thứ ba, môi trường MS bổ sung BAP 1,5 mg/l cùng 10% nước dừa cho hiệu quả tạo đa chồi cao nhất, đạt tỷ lệ cảm ứng 84,44% - 87,44% và số chồi trung bình đạt 4,07 chồi/mẫu với chiều cao chồi 3,03 cm sau 8 tuần. Hoạt tính tạo chồi của BAP cao hơn rõ rệt so với Kinetin ở cùng nồng độ (Kinetin chỉ đạt tỷ lệ 50% với 1,50 chồi/mẫu).

Thứ tư, môi trường cảm ứng ra rễ MS bổ sung IBA 0,3 mg/l cho kết quả tạo rễ tốt nhất với 4,70 rễ/mẫu và chiều dài rễ đạt 4,46 cm sau 8 tuần nuôi cấy, rễ mập, khỏe và phân nhánh mạnh, vượt trội so với đối chứng không bổ sung hormone (chỉ đạt 2,57 rễ/mẫu, rễ ngắn và còi cọc).

Thảo luận kết quả

Khả năng đáp ứng sinh học của các loại mô cấy ở đậu Nho nhe cho thấy tính chuyên hóa cao của tế bào. Việc nách lá mầm và mô sẹo từ lá thất bại trong việc tái sinh chồi phản ánh đặc thù khó tái sinh của cây họ Đậu, khi tế bào mô sẹo nhanh chóng bị phenolic hóa và mất khả năng tái biệt hóa. Trong khi đó, chồi ngọn chứa cụm mô phân sinh đỉnh với mật độ tế bào phôi non dồi dào, giúp duy trì khả năng phân chia liên tục khi tiếp nhận tín hiệu từ Cytokinin ngoại sinh.

BAP thể hiện hoạt tính kích thích vượt trội so với Kinetin do có ái lực liên kết thụ thể cao hơn, thúc đẩy quá trình phiên mã ARN và tổng hợp protein phân bào. Việc kết hợp 10% nước dừa bổ sung nguồn myo-inositol và các amino acid tự nhiên giúp tăng thêm khoảng 3% tỷ lệ tạo đa chồi và cải thiện độ mập của thân chồi. Đối với quá trình tạo rễ, nồng độ IBA 0,3 mg/l là ngưỡng sinh lý tối ưu; khi tăng nồng độ lên 0,5 mg/l, số rễ giảm mạnh xuống còn 2,27 rễ/mẫu do Auxin liều cao kích hoạt sinh tổng hợp ethylene ức chế sự kéo dài rễ.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị đường biểu diễn tốc độ tăng sinh chồi qua các mốc 2, 4, 6, 8 tuần và bảng ma trận phân hạng Duncan, khẳng định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức tối ưu BAP 1,5 mg/l so với các nghiệm thức còn lại.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra bốn đề xuất hành động cụ thể nhằm hoàn thiện và ứng dụng quy trình:

1. Triển khai quy trình chuyển gen mục tiêu: Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học và trường đại học cần ứng dụng ngay hệ thống tái sinh từ chồi ngọn để thực hiện chuyển các gen chống chịu hạn, mặn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, hướng tới mục tiêu đạt tỷ lệ chuyển gen thành công 15-20% trong giai đoạn 12 tháng tới.
2. Thử nghiệm các chất điều hòa sinh trưởng thế hệ mới: Nhóm nghiên cứu bộ môn sinh học thực vật nên tiếp tục khảo sát bổ sung Thidiazuron (TDZ) ở dải nồng độ thấp (0,05 - 0,2 mg/l) nhằm nâng cao tỷ lệ tái sinh cụm đa chồi đạt trên 90% trong chu kỳ nghiên cứu tiếp theo.
3. Chuẩn hóa quy trình vi nhân giống thương mại: Các trung tâm giống cây trồng nông nghiệp cần áp dụng công thức MS + BAP 1,5 mg/l + 10% nước dừa để nhân dòng vô tính các giống đậu Nho nhe đặc sản, duy trì hệ số nhân giống đạt trên 4 chồi/chu kỳ 8 tuần.
4. Hoàn thiện kỹ thuật thuần hóa cây giống ngoài vườn ươm: Các hợp tác xã nông nghiệp tại Yên Bái và Cao Bằng cần áp dụng giá thể phối trộn đất thịt và trấu hun theo tỷ lệ 2:1, kết hợp tưới dung dịch MS loãng 1/10 định kỳ 5 giờ/lần, nhằm đảm bảo tỷ lệ cây con sống sót đạt trên 85% sau 4 tuần chuyển ra môi trường tự nhiên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo học thuật và kỹ thuật giá trị dành cho các nhóm đối tượng sau:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học: Nắm vững phương pháp bố trí thí nghiệm in vitro, kỹ thuật giải phóng chồi nách và các thuật toán xử lý thống kê sinh học trên SPSS ở mức ý nghĩa alpha = 0,05.
• Cán bộ nghiên cứu tại các Viện Khoa học Nông nghiệp: Sử dụng hệ thống tái sinh chồi ngọn đã được chuẩn hóa để rút ngắn ít nhất 50% thời gian xây dựng quy trình chuyển gen hoặc chỉnh sửa gen trên cây họ Đậu.
• Giảng viên và kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật: Ứng dụng các công thức môi trường chuẩn (BAP 1,5 mg/l; IBA 0,3 mg/l) làm tài liệu thực hành giảng dạy nuôi cấy mô và nhân giống vô tính cây hai lá mầm.
• Kỹ sư nông nghiệp và doanh nghiệp phát triển giống cây trồng: Khai thác quy trình nhân nhanh giống đậu Nho nhe giàu dinh dưỡng để bảo tồn nguồn gen bản địa và sản xuất cây giống sạch bệnh phục vụ canh tác vùng cao.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao chồi ngọn là vật liệu tối ưu nhất cho tái sinh cây đậu Nho nhe?

Chồi ngọn chứa mô phân sinh đỉnh đang hoạt động phân bào mạnh mẽ, ít bị già hóa và dễ phản ứng với Cytokinin ngoại sinh. Trong khi mô sẹo từ lá bị chết do tích tụ độc tố phenolic và nách lá mầm bị thối đen sau 8 tuần, chồi ngọn đạt tỷ lệ tái sinh lên đến 87,44% với 4,07 chồi/mẫu.

Nồng độ BAP nào đem lại hiệu quả tạo đa chồi cao nhất?

Môi trường MS bổ sung BAP ở nồng độ 1,5 mg/l kết hợp 10% nước dừa cho hiệu quả tối ưu nhất. Ở nồng độ này, chồi phát triển xanh mập, đạt chiều cao 3,03 cm và hệ số nhân đạt 4,07 chồi/mẫu sau 8 tuần, cao hơn rõ rệt so với nồng độ 0,5 mg/l hoặc 2,0 mg/l.

Quy trình khử trùng hạt đậu Nho nhe cần tuân thủ những thông số nào?

Quy trình tối ưu bao gồm lắc hạt trong cồn 70 độ trong 1 phút, sau đó khử trùng bằng dung dịch Javen 60% trong thời gian 20 phút và rửa lại 3-4 lần bằng nước cất vô trùng. Phương pháp này mang lại tỷ lệ mẫu sạch 100% và tỷ lệ nảy mầm đạt 98%.

Môi trường nào kích thích chồi in vitro ra rễ tốt nhất?

Môi trường MS bổ sung Auxin IBA ở nồng độ 0,3 mg/l kích thích hình thành rễ tối ưu nhất. Sau 8 tuần nuôi cấy, cây đạt trung bình 4,70 rễ/mẫu với chiều dài rễ đạt 4,46 cm, rễ phát triển màu trắng khỏe mạnh và phân nhánh tốt.

Loại giá thể nào giúp cây con đạt tỷ lệ sống cao khi chuyển ra tự nhiên?

Giá thể phối trộn giữa đất thịt và trấu hun theo tỷ lệ 2:1 là môi trường tối ưu cho cây con thích nghi. Cây cần được luyện 2-3 ngày trong phòng sáng, rửa sạch thạch bám rễ và tưới dung dịch MS loãng 10 lần định kỳ 5 giờ/lần dưới mái che chắn cẩn thận.

Kết luận

• Luận văn đã xác lập thành công quy trình khử trùng hạt đậu Nho nhe đạt 100% mẫu sạch và 98% tỷ lệ nảy mầm bằng Javen 60% trong 20 phút.
• Khẳng định đoạn chồi ngọn 5-6 ngày tuổi là nguồn vật liệu cấy thích hợp nhất để cảm ứng tạo đa chồi trực tiếp.
• Xác định môi trường cảm ứng đa chồi tối ưu gồm MS + BAP 1,5 mg/l + 10% nước dừa, cho hệ số nhân đạt 4,07 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy.
• Hoàn thiện môi trường ra rễ với MS + IBA 0,3 mg/l, tạo 4,70 rễ/mẫu có chất lượng rễ mập khỏe và phân nhánh tốt.
• Xác định giá thể đất thịt kết hợp trấu hun tỷ lệ 2:1 giúp thuần hóa thành công cây con in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên.

Đóng góp then chốt của luận văn là đã giải quyết trọn vẹn nút thắt kỹ thuật trong công nghệ vi nhân giống và tạo nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu Nho nhe. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung chuyển nạp các cấu trúc gen mục tiêu trong vòng 12 đến 24 tháng tới để tạo ra các dòng cây chuyển gen chống chịu ưu việt. Quý bạn đọc và các nhà nghiên cứu hãy tham khảo toàn văn công trình để ứng dụng ngay quy trình chuẩn hóa này vào thực tiễn nghiên cứu và sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Đậu Nho nhe có tên khoa học Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi thuộc họ Đậu (Fabaceae) hay thường được gọi là đậu gạo, đậu nâu. Loài đậu này được phát hiện lần đầu tiên ở Ấn Độ, sau đó được Ohwi và Ohashi miêu tả khoa học đầu tiên vào năm 2010. Đậu Nho nhe phân bố khá rộng từ miền Nam Trung Quốc sau đó lan rộng ra miền Bắc Việt Nam, Lào, Thái Lan,.Ở nước ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lào Cai, Yên Bái. Ðậu đỗ nói chung và đậu Nho nhe nói riêng là nhóm cây có giá trị dinh dưỡng cao, đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người đặc biệt ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protein.

Ðậu Nho nhe thường được sử dụng làm thức ăn cho người và vật nuôi, là cây một năm, hệ rễ phát triển mạnh, có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm nên thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu chống xói mòn. Đậu Nho nhe là cây sinh trưởng rất nhanh, sau 3 tháng có thể phủ kín đất, đặc biệt hàm lượng dinh dưỡng trong thân và lá cao, làm phân bón rất tốt. Một số những nghiên cứu gần đây, còn cho thấy đậu Nho nhe ngoài là cây lương thực thiết yếu còn có tác dụng trong việc chữa bệnh. Ở Trung Quốc, đậu Nho nhe được dùng như một loại dược liệu để chữa các bệnh liên quan đến đau nhức xương khớp, hay sắc uống để giải độc, giảm phù nề [41].

Tuy nhiên, các cây trồng thuộc họ Đậu có khả năng chống chịu kém đối với các tác nhân bất lợi từ ngoại cảnh và khả năng này ngày càng bị suy giảm nghiêm trọng do biến đổi khí hậu. Do vậy nghiên cứu tìm biện pháp cải thiện khả năng chống chịu của cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêng được quan tâm và mang tính thời sự. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Có nhiều cách tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu của cây họ Đậu bằng lai hữu tính, đột biến thực nghiệm và công nghệ gen. Trong đó ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để làm tăng khả năng chống chịu các stress phi sinh học là một hướng tiếp cận có triển vọng.

Việc xây dựng hệ thống tái sinh là một trong những giai đoạn có ý nghĩa quan trọng và quyết định rất lớn đến sự thành công của kỹ thuật chuyển gen. Đối với các cây họ Đậu như đậu tương, đậu xanh, đậu cove việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đã được nghiên cứu và khẳng định. Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm có thể tái sinh trong ống nghiệm hay không, tái sinh từ bộ phận nào của cây, công thức môi trường thích hợp cho tái sinh đa chồi. Đây là những câu hỏi đặt ra cho nghiên cứu này.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu Nho nhe (Vigna umbellata)”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được hệ thống tái sinh đa chồi in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu Nho nhe. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt để tạo mẫu sạch trong ống nghiệm. - Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro qua mô sẹo, nách lá mầm, chồi ngọn.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin đến sự tạo đa chồi ở cây đậu Nho nhe. - Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro. - Nghiên cứu điều kiện chuyển cây đậu Nho nhe in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

CÂY ĐẬU NHO NHE Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe Đậu Nho nhe có những tên khác như: đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng, đậu đà, thua dài. Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna umbellata (Thunb. Đậu Nho nhe thuộc chi Đậu (Vigna), họ Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).

Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ là Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotrophic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis. Đậu Nho nhe theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotrophic. Chi phụ Ceratotrophic còn được gọi là nhóm đậu Châu Á mang những mức độ điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna. Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong 16 loài của Ceratotrophic đã được thuần hóa là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczel), đậu gạo (Vigna umbellata (Thunb.)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti (Jacp)), Vigna trilobala (L.

Đậu Nho nhe là dạng cây thân thảo, có thể mọc thẳng đứng, bán thẳng hoặc xoắn có dây leo, thường có chiều dài từ 30-100 cm, một số loài có thể cao đến 200 cm. Thân cây có rãnh, phân nhánh. Khi cây còn non có lông ngắn, mịn, trắng phát triển bao phủ, lông này sẽ rụng dần khi cây lớn lên. Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách, thường là lá kép ba lá chét, lá kèm hình ngọn giáo, chiều dài của lá từ 6-9 cm, cuống lá dài từ 5-10 cm.

Hệ thống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh mẽ, rễ cái có thể cắm sâu xuống đất 100-150 cm có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Hoa thường có màu vàng tươi hoặc vàng nhạt. Cụm hoa hình chùm mọc ra từ nách lá. Hoa lưỡng tính, đều hoặc không đều, mẫu 5.

Hoa thường có 10 nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ. Bộ nhụy gồm có 1 noãn với nhiều noãn đảo hay cong. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Quả của đậu Nho nhe dài hình dải cong, mọc đứng dài từ 7,5-12,5 cm, rộng 4- 6 mm, chứa khoảng 6-10 hạt. Hạt đậu dài 6-8 mm, rốn hạt lõm.

Hạt đậu Nho nhe có màu sắc đa dạng: vàng lục, vàng nâu, nâu, đen, đốm hoặc màu rơm. Các hạt màu vàng lục thường trở thành màu nâu vàng trong quá trình lưu trữ. Hạt màu vàng nâu được cho là có giá trị dinh dưỡng cao hơn cả. Đậu Nho nhe phát triển nhanh vào mùa hè.

Ở Ấn Độ và Nepal, đậu Nho nhe được gieo vào tháng 2, tháng 3 để thu hoạch vào mùa hè và tháng 7, tháng 8 để thu hoạch vào tháng 12. Thời kỳ sinh trưởng của cây thay đổi tùy theo giống và vùng địa lý. Khi được trồng ở Ăng-gô-la (vĩ độ 6°-17°S), theo báo cáo, cây trưởng thành sau 60 ngày kể từ khi gieo hạt, nhưng ở Tây Bengal ở bán cầu bắc, cây trồng cần khoảng 130 ngày để tạo ra năng suất hạt giống kinh tế [40]. Đậu Nho nhe là một cây họ đậu linh hoạt có thể phát triển ở vùng cận nhiệt đới ẩm đến khí hậu ôn đới ấm áp và mát mẻ.

Cây không chịu được sương giá nhưng chịu được nhiệt độ cao, thường được tìm thấy mọc ở những khu vực có nhiệt độ trung bình từ 18-30°C. Phạm vi nhiệt độ cho sự tăng trưởng là 10-40°C với mức tối ưu trong khoảng từ 18-30°C. Đậu Nho nhe phát triển tốt ở vùng khí hậu ẩm ướt và mặc dù có khả năng chịu hạn tốt, nhưng để có năng suất tốt, nó đòi hỏi lượng mưa hàng năm là 1000-1500 mm. Phạm vi lượng mưa hàng năm được báo cáo cho cây tăng trưởng là 300-2000 mm với mức tối ưu trong khoảng 700-1500 mm.

Đậu Nho nhe phát triển mạnh trong điều kiện ánh sáng đầy đủ, sự tăng trưởng của nó có thể bị cản trở nếu trồng xen canh với cây trồng khác chẳng hạn như ngô, lúa [40]. Loài đậu này có thể được trồng trên nhiều loại đất, cả những loại đất thoái hóa, khô cằn, nghèo dinh dưỡng nhưng để có năng suất tối ưu, nó đòi hỏi phải có đất màu mỡ. Tuy nhiên, độ phì nhiêu của đất cao có thể cản trở sự hình thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] quả và làm giảm năng suất hạt. Phạm vi pH đất cho sự tăng trưởng là 5,5-8 với mức tối ưu trong khoảng 6-7,5.

Đậu Nho nhe là một loại cây khỏe mạnh, có khả năng chống lại nhiều loại sâu bệnh, nó không cần phân bón hoặc chăm sóc đặc biệt trong quá trình tăng trưởng. Nó có nguồn gốc từ châu Á, được tìm thấy đầu tiên ở Ấn Độ và miền trung Trung Quốc sau đó lan sang Malaysia. Loài đậu này được người Ả Rập đưa vào Ai Cập, dọc theo bờ biển phía Đông châu Phi và các đảo Ấn Độ Dương. Ngày nay, đậu Nho nhe được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới châu Á, ít được trồng ở Hoa Kỳ, Úc, Tây Nam châu Á, vùng nhiệt đới châu Phi và châu Mỹ.

Ở các cùng nhiệt đới châu Phi, nó được trồng ở Tây Phi, Đông Phi và các đảo Ấn Độ Dương, và ít gặp hơn ở Trung và Nam Phi. Ở nước ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lào Cai, Yên Bái,. Hiện nay, chưa có số liệu cụ thể về tình hình sản xuất đậu Nho nhe, tuy nhiên loài đậu này được sản xuất chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, Nhật Bản là nước nhập khẩu chính, các nhà xuất khẩu chính là Thái Lan, Myanmar và Trung Quốc. Madagascar cũng là một trong những nước xuất khẩu chính đậu Nho nhe.

Xuất khẩu trung bình hàng năm từ năm 1998-2000 ước tính là 1100 triệu tấn [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cây đậu Nho nhe (ảnh chụp của tác giả tại vườn thí nghiệm Khoa Sinh học, 6/2018) 1. Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe Đậu Nho nhe là một loại đậu ít được biết đến và chưa được sử dụng đúng cách.

Tuy nhiên, gần đây loại đậu này đã gây được sự chú ý nhờ giá trị tiềm năng về mặt dinh dưỡng của nó. Chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu Nho nhe cao hơn so với nhiều loại đậu khác thuộc họ Vigna.