Tổng quan luận án

Biến đổi khí hậu toàn cầu và hiện tượng nước biển dâng đang gây ra tình trạng xâm nhập mặn nghiêm trọng tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) – vựa lúa và trung tâm xuất khẩu gạo chủ lực của Việt Nam. Cuối năm 2015 đến cuối năm 2016, ranh mặn 4 g/L đã xâm nhập sâu vào nội đồng, ảnh hưởng trực tiếp đến 10 trên 13 tỉnh thành ĐBSCL; trong đó có gần 139.000 ha lúa bị thiệt hại trên 70% năng suất và hơn 43.000 ha thiệt hại từ 30% đến 70% năng suất. Theo các dự báo khí văn và thủy lợi, trong vòng 30 năm tới, diện tích đất canh tác chịu nồng độ mặn trên 4‰ tại ĐBSCL có thể lên đến 1,2 triệu ha (chiếm khoảng 41% diện tích toàn vùng). Song song với áp lực suy giảm diện tích đất lúa do nhiễm mặn, thị hiếu tiêu thụ gạo hiện nay đòi hỏi chất lượng cơm ngày càng cao, đặc biệt là cơm mềm dẻo (hàm lượng amylose thấp, ≤ 20%) và giá trị dinh dưỡng được cải thiện thông qua hàm lượng vi chất sắt cao, nhằm hỗ trợ phòng chống tình trạng thiếu máu do thiếu sắt ở các nhóm dân cư nông thôn.

Khoảng trống nghiên cứu thực tế tại ĐBSCL cho thấy:

  • Các giống lúa mùa địa phương có khả năng chống chịu mặn tốt như Tép Hành, Một Bụi Đỏ thường có nhược điểm cảm quang, thời gian sinh trưởng dài, năng suất thấp và phẩm chất cơm cứng (hàm lượng amylose cao).
  • Các giống lúa cao sản hiện hành có năng suất cao nhưng khả năng chống chịu mặn chỉ ở mức trung bình hoặc kém.
  • Một số giống lúa đã được công nhận có hàm lượng sắt cao như OM6976 lại có hàm lượng amylose cao, cơm khô cứng; trong khi giống OM5451 có hàm lượng amylose thấp (khoảng 18%) nhưng mức độ chịu mặn chưa đáp ứng được các vùng đất nhiễm mặn gay gắt.
  • Cho đến thời điểm đề tài thực hiện, chưa có công trình nào chọn tạo thành công giống lúa hội tụ đồng thời ba đặc tính: chống chịu mặn tốt, hàm lượng vi chất sắt cao (gạo lức > 14 mg/kg, gạo trắng ≥ 6 mg/kg) và hàm lượng amylose thấp (≤ 20%).

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

  • Nghiên cứu, chọn tạo được các dòng/giống lúa có khả năng thích nghi và sinh trưởng tốt tại vùng sinh thái nhiễm mặn, tích hợp đồng thời hàm lượng sắt trong gạo cao (sắt trong gạo lức > 14 mg/kg, sắt trong gạo trắng ≥ 6 mg/kg) và hàm lượng amylose trong hạt gạo thấp (≤ 20%) thông qua phương pháp lai hồi giao kết hợp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS).

Các nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Đánh giá vật liệu di truyền ban đầu từ tập đoàn giống lúa của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Lúa ĐBSCL nhằm chọn lọc các cá thể bố mẹ phù hợp.
  2. Thực hiện lai tạo và lai hồi giao giữa giống cho gen chịu mặn (Pokkali) với các giống nhận gen có phẩm chất tốt (OM231, OM238, OM5451, OM121).
  3. Tuyển chọn quần thể lai hồi giao qua các thế hệ từ F1 đến BC3F5 bằng phương pháp thanh lọc mặn nhân tạo kết hợp kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen chịu mặn Saltol bằng chỉ thị phân tử SSR.
  4. Khảo nghiệm các dòng lai ưu tú thế hệ BC3F4 (vụ Hè Thu 2017) tại vùng sinh thái mặn và vùng phù sa ngọt đối chứng.
  5. Khảo nghiệm các dòng lai ưu tú thế hệ BC3F5 (vụ Đông Xuân 2017-2018), đánh giá tính ổn định di truyền, năng suất, phẩm chất xay chà và các chỉ tiêu hóa sinh hạt gạo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Nguồn gen cho tính chịu mặn là giống lúa mùa địa phương Pokkali (Ấn Độ); nguồn gen nhận là 36 dòng/giống lúa cao sản triển vọng thuộc Ngân hàng gen của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Lúa ĐBSCL, từ đó chọn ra 4 giống lúa mẹ làm vật liệu lai (OM231, OM238, OM5451, OM121).
  • Phạm vi không gian: Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm (tách chiết DNA, phản ứng PCR, phân tích hóa sinh sắt, amylose, độ trở hồ, độ bền gel), nhà lưới và ruộng thí nghiệm được bố trí tại Viện Lúa ĐBSCL (thành phố Cần Thơ); khảo nghiệm sinh thái thực địa được triển khai tại các vùng đất nhiễm mặn ven biển thuộc huyện Kiên Lương/An Biên (tỉnh Kiên Giang) và huyện Trần Đề (tỉnh Sóc Trăng).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài thực hiện trong giai đoạn từ năm 2014 đến năm 2018, trải qua các vụ gieo trồng liên tục để tạo các thế hệ từ F1, BC1F1, BC2F1, BC3F1 đến BC3F5.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến ba trục nội dung chính: tính chống chịu mặn, sự tích lũy vi chất sắt và đặc tính hóa tinh bột amylose trong hạt gạo.

Về tính chống chịu mặn và chỉ thị phân tử:

  • Mặn tác động tiêu cực lên cây lúa ở nhiều giai đoạn sinh trưởng khác nhau, đặc biệt là giai đoạn mạ non và giai đoạn thụ phấn - thụ tinh (Lauchli và Grattan, 2007; Hoai et al.; Castillo et al.). Độc chất ion Na+ gây cản trở hấp thu dinh dưỡng và quang hợp (Ngô Đình Thức, 2006). Khi độ dẫn điện (EC) đạt 4 dS/m, năng suất lúa có thể giảm 10-15%, và khi vượt quá 10 dS/m, năng suất giảm trên 50% (Dobermann và Thomas, 2000).
  • Hệ số di truyền của tính trạng chịu mặn tương đối thấp (khoảng 19,18%) và chịu tác động lớn từ môi trường (Tuberosa và Salvi, 2007). Các nghiên cứu di truyền định lượng đã xác định được đoạn QTL Saltol trên nhiễm sắc thể số 1, chịu trách nhiệm cho khoảng 40% đến 65% khả năng dung nạp mặn của giống lúa Pokkali (Phạm Trung Nghĩa và ctv.; Thomson et al., 2010).
  • Các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với đoạn Saltol đã được nhiều tác giả công bố: nhóm chỉ thị RM1287, RM3412, RM8094, RM493, RM10745, RM10694 (Mohammadi et al., 2010; Luu et al., 2012, 2013; Waziri et al., 2016; Singh et al., 2018). Ở trong nước, các tác giả như Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2004, 2011), Lê Xuân Thái và Trần Nhân Dũng (2013), Đồng Thị Kim Cúc (2014) đã ứng dụng các chỉ thị SSR như RM206, RM223, RM315 để nhận diện các dòng lúa chịu mặn.

Về tích lũy vi chất sắt trong hạt gạo:

  • Tình trạng thiếu sắt ảnh hưởng đến hơn 2 tỷ người trên toàn cầu (WHO, 2008; SCN, 2010; Wirth et al., 2009). Cung cấp sắt qua nguồn lương thực chính là lúa gạo được đánh giá là giải pháp sinh học bền vững. Haas và Jere (2011) chứng minh việc sử dụng giống lúa IR68144 giàu sắt giúp tăng 20% lượng sắt hấp thu ở cơ thể người.
  • Trong nước, chương trình chọn giống lúa giàu sắt tại Viện Lúa ĐBSCL (Trần Thị Cúc Hòa và Bùi Bá Bổng, 2005; Trần Thị Cúc Hòa và ctv., 2004, 2010) đã xác định các giống lúa có hàm lượng sắt từ 14 - 15 mg/kg như Khang Dân, Ngọc Nữ, OM2490, OM2406, OM5199-1, OM5451 và OM6976. Các nghiên cứu này chỉ rõ quá trình xay chà làm mất khoảng 2/3 lượng sắt từ gạo lức sang gạo trắng.

Về hàm lượng amylose và phẩm chất hạt:

  • Hàm lượng amylose là yếu tố cốt lõi chi phối độ dẻo mềm của cơm, được phân loại thành các nhóm: nếp (waxy, 1-2%), amylose rất thấp, amylose thấp (10-20%), amylose trung bình (20-25%) và amylose cao (> 25%) (IRRI, 1996; Kumar và Khush; Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).
  • Tính trạng này được quy định chính bởi locus Waxy (Wx) trên nhiễm sắc thể số 6, mã hóa enzyme granule-bound starch synthase I (GBSS I) (Cheng et al., 2014; Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004, 2011). Các nghiên cứu của Wan et al. (2007), Chen et al. (2008), Hồ Văn Được và ctv. (2017) đã sử dụng chỉ thị phân tử RM190 và chỉ thị Wx-In1 để xác định các cá thể mang alen quy định hàm lượng amylose thấp.

Khoảng trống được luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù các nghiên cứu đơn lẻ về tính chịu mặn, hàm lượng sắt hoặc hàm lượng amylose đã được công bố nhiều, nhưng việc kết hợp cả ba tính trạng mục tiêu trên cùng một nền di truyền cao sản thích nghi với ĐBSCL vẫn chưa được thực hiện thành công. Pokkali là nguồn gen chịu mặn kinh điển nhưng có kiểu hình hoang dại (cao cây > 150 cm, trổ muộn, hạt đỏ, tỷ lệ lép cao, amylose rất cao). Luận án định vị nghiên cứu của mình vào việc khai thác nguồn gen Saltol từ Pokkali, hồi giao 3 lần vào các dòng mẹ cao sản (OM231, OM238, OM5451) nhằm triệt tiêu các tính trạng nông học bất lợi của giống bố, đồng thời bảo tồn hàm lượng sắt cao và mức amylose thấp (≤ 20%).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Lý thuyết dung nạp mặn thực vật: Dựa trên cơ chế kiểm soát cân bằng ion $Na^+/K^+$ ở mô thực vật, ngăn chặn sự dịch chuyển quá mức của $Na^+$ lên chồi và lá non thông qua hệ thống gen kiểm soát vận chuyển ion định vị tại vùng QTL Saltol trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1.
  • Lý thuyết di truyền chọn giống hồi giao (Backcrossing): Quần thể được lai trở lại với dòng mẹ nhận gen (Recurrent parent) qua nhiều thế hệ nhằm phục hồi nền di truyền cao sản (tỷ lệ lý thuyết đạt 93,75% ở thế hệ BC3), kết hợp thanh lọc áp lực để giữ lại đoạn gen mục tiêu từ dòng cho gen (Donor parent).
  • Cơ sở di truyền phẩm chất hạt: Sự biểu hiện của gen Waxy kiểm soát tỷ lệ amylose/amylopectin; chỉ tiêu nhiệt trở hồ (GT) và độ bền thể gel (GC) hỗ trợ đánh giá độ mềm dẻo của tinh bột sau nấu.
  • Mô hình phân tích tương tác kiểu gen và môi trường (GxE): Áp dụng phương pháp hồi quy tuyến tính của Finlay và Wilkinson (1963) kết hợp mô hình của Eberhart và Russell (1966) nhằm đánh giá độ thích ứng ($\beta_i$) và tính ổn định ($S^2_{di}$ hoặc $\delta_{ij}$) của các dòng lúa qua các điểm sinh thái khác nhau: $$Y_{ij} = \mu_i + \beta_i I_j + \delta_{ij}$$ Trong đó $Y_{ij}$ là năng suất trung bình của kiểu gen $i$ tại môi trường $j$; $\mu_i$ là trung bình kiểu gen $i$; $\beta_i$ là hệ số hồi quy; $I_j$ là chỉ số môi trường; $\delta_{ij}$ là sai lệch khỏi đường hồi quy.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp lai tạo và tạo dòng:

    • Tiến hành lai cặp giữa giống bố Pokkali và 4 giống mẹ (OM231, OM238, OM5451, OM121) để thu nhận hạt F1.
    • Lai hồi giao ba lần liên tiếp (BC1F1, BC2F1, BC3F1) với cây mẹ làm dòng nhận gen.
    • Tự thụ phấn từ thế hệ BC3F1 qua BC3F2, BC3F3, BC3F4 đến BC3F5 nhằm cố định dòng thuần.

  • Phương pháp thanh lọc mặn kiểu hình:

    • Bố trí thí nghiệm thanh lọc mặn ở giai đoạn mạ trong khay nhựa chứa môi trường dung dịch dinh dưỡng Yoshida theo quy chuẩn quốc tế của IRRI (1997).
    • Nồng độ mặn thử nghiệm: Xử lý ở mức EC = 8 dS/m (tương đương 4‰ NaCl).
    • Đánh giá mức độ tổn thương của mạ sau 16 ngày theo thang điểm SES (Standard Evaluation System) của IRRI từ cấp 1 (chống chịu tốt, cây phát triển bình thường) đến cấp 9 (nhiễm nặng, cây chết hoàn toàn).

  • Kỹ thuật sinh học phân tử (chọn giống nhờ chỉ thị phân tử - MAS):

    • Tách chiết DNA tổng số từ mô lá non theo phương pháp CTAB cải tiến.
    • Sử dụng các chỉ thị microsatellite (SSR) liên kết vùng Saltol: RM140, RM310, RM1287, RM3412b, RM7075, RM490, RM10694. Trong đó, hai chỉ thị cốt lõi được sử dụng xuyên suốt qua các thế hệ con lai là RM1287 và RM10694.
    • Sử dụng chỉ thị phân tử Wx-In1 để khuếch đại đoạn gen quy định hàm lượng amylose.
    • Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt chuẩn hóa; sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose nồng độ 2,5% với đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide và ghi nhận hình ảnh dưới hệ thống đọc gel UV.

  • Phương pháp phân tích hóa sinh phẩm chất hạt:

    • Đo hàm lượng sắt (Fe) trong mẫu gạo lức và gạo trắng theo phương pháp so màu đo quang phổ hấp thu nguyên tử sau khi vô cơ hóa mẫu bằng hỗn hợp acid chuyên dụng; đối chiếu với đường chuẩn sắt dựng sẵn (nồng độ tính bằng mg/kg).
    • Phân tích hàm lượng amylose (AC) bằng phương pháp so màu Iod theo quy trình của IRRI (1996) và Juliano (1971), đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 620 nm; phân cấp thành các mức amylose thấp, trung bình và cao.
    • Đánh giá nhiệt độ trở hồ (GT): Phản ứng hóa kiềm trong dung dịch KOH 1,7% sau 24 giờ ở nhiệt độ 30°C, chấm điểm theo thang phân cấp từ 1 đến 7 của IRRI (1996).
    • Đánh giá độ bền thể gel (GC): Đun sôi bột gạo trong KOH 0,2 N, làm nguội ống nghiệm nằm ngang sau 60 phút và đo độ dịch chuyển của khối gel (mm) theo thang phân loại của IRRI (gel mềm > 60 mm, gel trung bình 41-60 mm, gel cứng ≤ 40 mm).

  • Phương pháp khảo nghiệm đồng ruộng và phân tích nông học:

    • Bố trí thí nghiệm đồng ruộng theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD), có lặp lại.
    • Thu thập các chỉ tiêu nông sinh học: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số chồi hữu hiệu/bụi, chiều dài bông, tỷ lệ lép, khối lượng 1000 hạt, năng suất thực tế (tấn/ha).
    • Phân tích phẩm chất cơ học và xay xát: tỷ lệ gạo lức, tỷ lệ gạo trắng, tỷ lệ gạo nguyên, độ bạc bụng và kích thước hạt theo thang chuẩn IRRI (1996).

  • Nguồn tư liệu và xử lý số liệu:

    • Số liệu thu thập từ các vụ mùa Hè Thu 2017 và Đông Xuân 2017-2018 tại Viện Lúa ĐBSCL, Kiên Giang và Sóc Trăng.
    • Số liệu mặn thực địa được giám sát thông qua đo độ mặn mẫu nước mặt và mẫu đất tầng canh tác.
    • Dữ liệu được tính toán và phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm thống kê sinh học chuyên dụng; tính toán chỉ số thích nghi, chỉ số ổn định và vẽ giản đồ biplot để đánh giá tương tác GxE.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này thiết lập cơ sở lý luận, tính cấp thiết của đề tài trong bối cảnh ĐBSCL chịu ảnh hưởng nặng nề bởi thiên tai xâm nhập mặn (đặc biệt là đợt hạn mặn lịch sử 2015-2016). Chương 1 xác định rõ cấu trúc 5 nội dung nghiên cứu tương ứng với quy trình tạo dòng: từ đánh giá bộ mẫu khởi đầu, lai tạo hồi giao đến BC3F1, thanh lọc mặn kết hợp SSR qua các thế hệ tự thụ, và khảo nghiệm đồng ruộng tại hai vùng sinh thái mặn điển hình (Kiên Giang và Sóc Trăng) cùng vùng đối chứng Cần Thơ. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn được khẳng định thông qua việc tạo ra vật liệu lai mới kết hợp chọn giống truyền thống với công nghệ sinh học phân tử nhằm giải quyết đồng thời ba chỉ tiêu chịu mặn, sắt cao và amylose thấp.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học về tình hình xâm nhập mặn ở ĐBSCL; cơ chế sinh lý và triệu chứng gây hại của ion muối lên các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa; cơ sở di truyền tính chịu mặn và vị trí đoạn QTL Saltol trên nhiễm sắc thể số 1; nguyên lý hoạt động của chỉ thị phân tử SSR; nhu cầu sinh học của vi chất sắt và tình trạng suy dinh dưỡng do thiếu máu; đặc điểm cấu trúc phân tử của tinh bột (amylose và amylopectin) cùng các tiêu chuẩn đánh giá phẩm chất cơm (nhiệt độ trở hồ, độ bền thể gel); tổng kết các thành tựu chọn giống lúa giàu sắt, kháng mặn và cải tiến amylose trong và ngoài nước.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết toàn bộ thiết kế thực nghiệm:

  • Địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu tại Viện Lúa ĐBSCL, Kiên Giang và Sóc Trăng từ 2014 đến 2018.
  • Danh mục và trình tự các cặp mồi SSR sử dụng để tầm soát đoạn gen Saltol (Bảng 3.1: RM140, RM310, RM1287, RM3412b, RM7075, RM490, RM10694) và mồi Wx-In1 tầm soát gen Waxy.
  • Quy trình thanh lọc mặn giai đoạn mạ trong khay ở độ mặn 4‰ (8 dS/m) theo tiêu chuẩn IRRI (1997).
  • Quy trình dựng đường chuẩn phân tích hàm lượng sắt (Bảng 3.4 và 3.5) và đường chuẩn phân tích hàm lượng amylose (Bảng 3.6 và 3.7).
  • Thang phân loại các chỉ tiêu phẩm chất: độ bền gel (Bảng 3.8), nhiệt trở hồ (Bảng 3.9), cấp bạc bụng (Bảng 3.14), dạng hạt và kích thước hạt (Bảng 3.15, 3.16), tỷ lệ xay xát (Bảng 3.18, 3.19, 3.20).
  • Phương pháp phân tích tương tác kiểu gen và môi trường (GxE) theo mô hình của Finlay - Wilkinson (1963) và Eberhart - Russell (1966).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Đánh giá vật liệu bố mẹ ban đầu

Khảo sát 36 dòng/giống lúa triển vọng của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Lúa ĐBSCL về tính chịu mặn (4‰), hàm lượng sắt và amylose:

  • Khả năng chịu mặn: Đa số các giống cao sản đều nhiễm mặn ở cấp 7 đến cấp 9; chỉ có giống đối chứng kháng Pokkali đạt cấp 1-3.
  • Hàm lượng sắt: Dao động từ 7,50 đến 16,80 mg/kg trong gạo lức và từ 2,10 đến 6,85 mg/kg trong gạo trắng.
  • Hàm lượng amylose: Dao động từ 15,20% đến 27,40%.
  • Kết quả chọn lọc 4 giống mẹ nhận gen: OM231, OM238, OM5451 và OM121. Đây là các giống có hàm lượng sắt cao, amylose thấp (17,50 - 19,80%), thời gian sinh trưởng ngắn (95 - 105 ngày), nhưng đều nhiễm mặn. Pokkali được chọn làm giống bố cho gen chịu mặn.
  • Kiểm tra mồi SSR trên bố mẹ: Các mồi RM1287, RM10694, RM3412b, RM7075 thể hiện tính đa hình rõ rệt giữa giống cho Pokkali và các giống mẹ nhận gen.

Quá trình lai hồi giao và chọn tạo quần thể

  • Lai tạo thế hệ F1: Thu được hạt lai F1 trên cả 4 tổ hợp lai. Sử dụng mồi SSR RM1287 và RM10694 để xác nhận cá thể lai thật (dị hợp tử mang băng của cả bố và mẹ).
  • Quá trình hồi giao từ BC1F1 đến BC3F1:
    • Tổ hợp OM121/Pokkali//OM121: Cá thể con lai bị nhiễm bệnh vàng lá nặng, sinh trưởng kém nên tác giả quyết định loại bỏ hoàn toàn tổ hợp này từ thế hệ BC1F1.
    • Ba tổ hợp còn lại (OM231/Pokkali//OM231, OM238/Pokkali//OM238, OM5451/Pokkali//OM5451) được tiếp tục lai hồi giao đến BC3F1. Tại mỗi thế hệ, cây lai được kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen chịu mặn bằng chỉ thị RM1287 và RM10694 trước khi tiến hành thụ phấn ngược với cây mẹ.

Chọn lọc qua các thế hệ tự thụ BC3F2 và BC3F3

  • Giai đoạn BC3F2: Thanh lọc mặn ở nồng độ 4‰ kết hợp kiểm tra SSR:
    • Tổ hợp OM231/Pokkali: Chọn được 14 dòng chịu mặn (cấp 3-5), mang gen Saltol, có kiểu hình nông học tốt.
    • Tổ hợp OM238/Pokkali: Chọn được 15 dòng đạt yêu cầu về kiểu hình và mang gen chịu mặn.
    • Tổ hợp OM5451/Pokkali: Chọn được 18 dòng đạt tiêu chuẩn.
  • Giai đoạn BC3F3: Tiếp tục sàng lọc qua thử mặn và phân tích phẩm chất sinh hóa (sắt, amylose, độ bền gel, nhiệt trở hồ):
    • Tổ hợp OM231/Pokkali: Tuyển chọn được 6 dòng ưu tú.
    • Tổ hợp OM238/Pokkali: Tuyển chọn được 5 dòng ưu tú.
    • Tổ hợp OM5451/Pokkali: Tuyển chọn được 6 dòng ưu tú.

Khảo nghiệm thế hệ BC3F4 (vụ Hè Thu 2017)

  • Đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn mạ (4‰): Các dòng con lai thể hiện mức chống chịu từ cấp 3 đến cấp 5, tương đương hoặc chỉ sau giống đối chứng kháng Pokkali, vượt trội so với các giống mẹ (cấp 7-9).
  • Kiểm tra kiểu gen: Điện di PCR với RM1287 và RM10694 khẳng định các dòng giữ được đoạn gen Saltol; chỉ thị Wx-In1 xác nhận sự hiện diện của alen quy định amylose thấp.
  • Khảo nghiệm năng suất tại 3 điểm (Cần Thơ, Kiên Giang, Sóc Trăng): Tuyển chọn được 6 dòng lai ưu tú thuộc cả 3 tổ hợp có năng suất thực tế đạt từ 4,20 đến 5,80 tấn/ha tại vùng đất mặn.
  • Phẩm chất hạt thế hệ BC3F4: Hàm lượng sắt trong gạo lức đạt 14,13 - 16,19 mg/kg; sắt trong gạo trắng đạt 4,55 - 6,65 mg/kg; hàm lượng amylose đạt từ 18,12% đến 19,95%.

Khảo nghiệm thế hệ BC3F5 (vụ Đông Xuân 2017-2018) và các dòng triển vọng

  • Khảo nghiệm tại các điểm nhiễm mặn thực địa cho thấy các dòng lai sinh trưởng ổn định, chịu được độ mặn tự nhiên trong nước và đất tại Kiên Giang và Sóc Trăng.
  • Phân tích tương tác kiểu gen và môi trường (GxE): Giản đồ biplot và các chỉ số ổn định ($\beta_i \approx 1$, $S^2_{di}$ nhỏ) xác định được các dòng có khả năng thích nghi rộng và duy trì năng suất cao ở cả vùng sinh thái phù sa ngọt lẫn vùng ven biển nhiễm mặn.
  • Tuyển chọn được 3 dòng lúa ưu tú nhất đạt trọn vẹn các tiêu chí của mục tiêu nghiên cứu:
    1. Dòng BC3F5-5-1-1 (nguồn gốc tổ hợp lai OM231/Pokkali//OM231).
    2. Dòng BC3F5-22-1-1 (nguồn gốc tổ hợp lai OM238/Pokkali//OM238).
    3. Dòng BC3F5-22-1-3 (nguồn gốc tổ hợp lai OM238/Pokkali//OM238).

Bảng tổng hợp đặc tính nông học, năng suất và phẩm chất của 3 dòng lúa BC3F5 ưu tú nhất vụ Đông Xuân 2017-2018 (đối chiếu bố mẹ):

Chỉ tiêu theo dõi Pokkali (Bố) OM231 (Mẹ) OM238 (Mẹ) Dòng BC3F5-5-1-1 Dòng BC3F5-22-1-1 Dòng BC3F5-22-1-3
Tổ hợp lai gốc - - - OM231/Pokkali OM238/Pokkali OM238/Pokkali
Cấp chịu mặn (4‰) Cấp 1-3 Cấp 9 Cấp 7-9 Cấp 3 Cấp 3 Cấp 3-5
Mang gen chịu mặn (Saltol) Có Không Không Có Có Có
Chiều cao cây (cm) > 150 95 - 100 98 - 102 98,5 100,2 97,8
Thời gian sinh trưởng (ngày) > 140 95 - 100 98 - 102 96 98 97
Năng suất vụ ĐX (tấn/ha) 2,5 - 3,0 5,5 - 6,5 5,8 - 7,0 6,85 7,15 6,92
Fe trong gạo lức (mg/kg) 9,80 15,20 15,60 16,15 15,85 14,70
Fe trong gạo trắng (mg/kg) 2,35 5,80 5,90 6,09 6,02 5,39
Hàm lượng amylose (%) 26,50 18,50 19,20 17,90 19,90 18,66
Kiểu gen Waxy (Wx-In1) Alen cao Alen thấp Alen thấp Alen thấp Alen thấp Alen thấp
Độ bền thể gel (mm) 35 (Cứng) 72 (Mềm) 68 (Mềm) 70 (Mềm) 66 (Mềm) 74 (Mềm)
Nhiệt độ trở hồ (cấp) Cấp 3 Cấp 4-5 Cấp 4-5 Cấp 4-5 Cấp 4 Cấp 4-5
Độ bạc bụng (cấp) Cấp 9 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1 Cấp 1
Dạng hạt gạo Bầu tròn Thon dài Thon dài Thon dài Thon dài Thon dài

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Chương 5 đúc kết các phát hiện cốt lõi: Quy trình lai hồi giao 3 lần kết hợp thanh lọc kiểu hình và kiểu gen bằng hai chỉ thị SSR RM1287 và RM10694 đã chuyển thành công đoạn gen Saltol từ Pokkali vào các dòng cao sản. Đã chọn lọc được 3 dòng thuần triển vọng ở thế hệ BC3F5 đáp ứng hoàn toàn mục tiêu đặt ra: chịu mặn cấp 3 ở nồng độ 4‰ giai đoạn mạ; hàm lượng sắt trong gạo lức đạt 14,70 - 16,15 mg/kg, gạo trắng đạt 5,39 - 6,09 mg/kg; hàm lượng amylose đạt 17,90 - 19,90% (cơm mềm dẻo, gel mềm, ít bạc bụng); thời gian sinh trưởng ngắn (96-98 ngày) và năng suất đạt 6,85 - 7,15 tấn/ha trong vụ Đông Xuân. Tác giả kiến nghị đưa các dòng này vào mạng lưới khảo nghiệm diện rộng quốc gia (VCU, DUS).

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn

  • Đề tài đã mạnh dạn khai thác nguồn gen từ giống lúa mùa địa phương Pokkali làm bố để chuyển nạp đặc tính chịu mặn. Mặc dù Pokkali mang nhiều đặc tính nông học xấu (thân cao dễ đổ ngã > 150 cm, chu kỳ sinh trưởng dài, phẩm chất hạt kém, hạt gạo đỏ, bạc bụng nhiều, amylose cao và năng suất thấp), quy trình lai hồi giao ba lần (đến thế hệ BC3) đã loại bỏ thành công hầu hết các liên kết di truyền bất lợi này, đồng thời thu hồi gần như toàn vẹn nền kiểu hình cao sản của các dòng mẹ.
  • Xây dựng và chứng minh tính hiệu quả của quy trình phối hợp giữa phương pháp chọn giống truyền thống (thanh lọc mặn nhân tạo giai đoạn mạ trong khay dinh dưỡng, khảo nghiệm đồng ruộng tại các vùng sinh thái thực tế) với phương pháp hiện đại bằng công nghệ sinh học (sàng lọc kiểu gen bằng chỉ thị phân tử SSR kẹp đoạn gen Saltol gồm RM1287 và RM10694, kết hợp chỉ thị Wx-In1 tầm soát gen quy định amylose). Quy trình này giúp phát hiện chính xác các cá thể mang gen mong muốn ngay từ các thế hệ sớm, giảm thiểu chi phí và rút ngắn thời gian tạo dòng thuần xuống còn 4-5 năm thay vì 8-12 năm như phương pháp truyền thống.
  • Đã chọn tạo thành công 3 dòng lúa thuần ưu tú ở thế hệ BC3F5 gồm: BC3F5-5-1-1 (tổ hợp OM231/Pokkali), BC3F5-22-1-1 và BC3F5-22-1-3 (tổ hợp OM238/Pokkali). Các dòng này mang đoạn gen chịu mặn Saltol, chịu được nồng độ mặn 4‰ (cấp 3-5), có thời gian sinh trưởng ngắn (96-98 ngày), dạng hạt thon dài, tỷ lệ bạc bụng thấp (cấp 1), cơm mềm dẻo (amylose 17,90 - 19,90%, gel mềm 66-74 mm), năng suất cao (6,85 - 7,15 tấn/ha vụ Đông Xuân) và đặc biệt tích lũy hàm lượng vi chất sắt cao trong gạo lức (14,70 - 16,15 mg/kg) cũng như gạo trắng (5,39 - 6,09 mg/kg).

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

  • Tiếp tục đưa 3 dòng lúa triển vọng (BC3F5-5-1-1, BC3F5-22-1-1 và BC3F5-22-1-3) tham gia vào hệ thống khảo nghiệm diện rộng quốc gia về giá trị canh tác và sử dụng (VCU) cũng như khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định (DUS) tại nhiều vùng sinh thái đất mặn khác nhau ở ĐBSCL để sớm công nhận giống lúa mới.
  • Đề xuất tiếp tục lưu trữ, duy trì và sử dụng các dòng lai này làm nguồn vật liệu di truyền quý giá phục vụ cho các chương trình lai tạo, chọn giống lúa chất lượng cao kết hợp chống chịu stress phi sinh học tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Trong số 4 tổ hợp lai ban đầu, tổ hợp OM121/Pokkali//OM121 đã sớm bị nhiễm bệnh vàng lá và suy giảm tiềm năng nông học, buộc phải loại bỏ hoàn toàn ngay từ thế hệ BC1F1, làm giảm bớt sự đa dạng của nền vật liệu di truyền tiếp nhận.
  • Khảo nghiệm đồng ruộng thực địa của các dòng lai thế hệ BC3F4 và BC3F5 mới chỉ được thực hiện tại hai tỉnh ven biển chịu mặn là Kiên Giang (huyện Kiên Lương/An Biên) và Sóc Trăng (huyện Trần Đề) trong hai mùa vụ liên tiếp (Hè Thu 2017 và Đông Xuân 2017-2018), cùng một điểm đối chứng phù sa ngọt tại Viện Lúa ĐBSCL (Cần Thơ). Quy mô này chưa bao quát hết toàn bộ các tiểu vùng sinh thái nhiễm mặn đa dạng khác của ĐBSCL như bán đảo Cà Mau, Bến Tre hay Trà Vinh.
  • Việc kiểm tra khả năng chịu mặn chủ yếu tập trung sâu vào giai đoạn mạ non trong khay dinh dưỡng (EC = 8 dS/m); các đánh giá chịu mặn ở giai đoạn sinh sản (trổ bông, thụ phấn) tại ruộng thực địa chịu sự phụ thuộc lớn vào diễn biến thời tiết và dao động thủy triều tự nhiên từng năm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Đẩy mạnh khảo nghiệm sản xuất thử diện rộng tại nhiều tiểu vùng sinh thái đất phèn mặn khác nhau ở ĐBSCL để đánh giá khả năng chống chịu sâu bệnh chính (rầy nâu, đạo ôn, cháy bìa lá) trong điều kiện canh tác của nông dân.
  • Nghiên cứu sâu hơn về tương tác giữa chế độ phân bón (đặc biệt là phân bón lá chứa kẽm, sắt, đạm) và tính chất thổ nhưỡng với hàm lượng sắt tích lũy trong nội nhũ của các dòng lúa mới nhằm tối ưu hóa quy trình canh tác giúp tối đa hóa lượng sắt trong gạo trắng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn đối với nhiều đối tượng chuyên môn:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Di truyền và Chọn giống Cây trồng, Nông học: Luận án cung cấp một quy trình thực nghiệm chuẩn mực về chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) kết hợp lai hồi giao (MABC) trên cây lúa.
  • Các nhà khoa học, chuyên gia chọn tạo giống tại các Viện, Trường nghiên cứu nông nghiệp: Phần phương pháp nghiên cứu (Chương 3) và kết quả phân tích chỉ thị SSR (Chương 4) mang lại dữ liệu thực nghiệm giá trị về bộ mồi SSR kiểm soát đoạn QTL Saltol (đặc biệt là hai cặp mồi RM1287 và RM10694) và mồi Wx-In1 trong tầm soát gen Waxy.
  • Các cơ quan quản lý nông nghiệp, khuyến nông và hoạch định chính sách tại các tỉnh ĐBSCL: Cung cấp nguồn vật liệu giống lúa cụ thể có khả năng thích ứng với biến đổi khí hậu và xâm nhập mặn, vừa đảm bảo giá trị thương mại xuất khẩu nhờ phẩm chất cơm dẻo mềm, vừa có giá trị dinh dưỡng cao hỗ trợ sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lại chọn giống lúa Pokkali làm dòng bố cho gen mặn dù giống này có rất nhiều nhược điểm hình thái?

Giống Pokkali là nguồn gen chịu mặn kinh điển đã được quốc tế chứng minh mang đoạn QTL Saltol trên nhiễm sắc thể số 1, kiểm soát tới 40-65% tính chịu mặn ở giai đoạn mạ thông qua cơ chế duy trì tỷ lệ $Na^+/K^+$ tối ưu. Mặc dù Pokkali có nhiều đặc tính hoang dại bất lợi (thân cao > 150 cm dễ đổ ngã, chu kỳ sinh trưởng dài, phẩm chất hạt kém, hạt đỏ, amylose cao và năng suất thấp), tác giả đã khắc phục bằng phương pháp lai hồi giao ba lần (đến thế hệ BC3) với các dòng mẹ cao sản. Quá trình này giúp giữ lại đoạn gen chịu mặn Saltol của Pokkali nhưng thu hồi hầu như toàn bộ các đặc tính nông sinh học ưu việt của dòng mẹ (thấp cây, chín sớm, gạo trong, amylose thấp).

2. Vì sao tổ hợp lai OM121/Pokkali//OM121 lại bị loại bỏ trong quá trình chọn lọc?

Trong quá trình theo dõi, đánh giá và chọn lọc quần thể lai, tổ hợp lai hồi giao OM121/Pokkali//OM121 đã biểu hiện tính nhiễm nặng đối với bệnh vàng lá ngay từ thế hệ BC1F1. Ngoài ra, con lai của tổ hợp này thể hiện tiềm năng nông học kém và khả năng sinh trưởng không đạt yêu cầu. Để tập trung nguồn lực nghiên cứu vào các dòng có triển vọng cao hơn, tác giả đã quyết định loại bỏ hoàn toàn tổ hợp lai này từ thế hệ BC1F1.

3. Những chỉ thị phân tử SSR nào đóng vai trò then chốt trong việc tầm soát gen chịu mặn và gen phẩm chất trong luận án?

Trong số 7 cặp mồi SSR khảo sát trên vùng Saltol (nhiễm sắc thể số 1), hai chỉ thị phân tử RM1287 và RM10694 thể hiện độ đa hình rõ rệt nhất giữa giống bố Pokkali và các giống mẹ nhận gen, do đó được tác giả lựa chọn làm chỉ thị cốt lõi để giám định kiểu gen xuyên suốt từ thế hệ F1, các thế hệ hồi giao BC1-3F1 đến các dòng tự thụ BC3F2 - BC3F5. Đối với tính trạng hàm lượng amylose, tác giả sử dụng chỉ thị phân tử Wx-In1 để phát hiện alen quy định hàm lượng amylose thấp trên gen Waxy (nhiễm sắc thể số 6).

4. Kết quả khảo nghiệm ở thế hệ BC3F5 đã chọn lọc được những dòng lúa ưu tú nào và các chỉ số cụ thể ra sao?

Thế hệ BC3F5 đã chọn được 3 dòng lúa thuần ưu tú nhất đạt trọn vẹn các mục tiêu:

  • Dòng BC3F5-5-1-1 (tổ hợp OM231/Pokkali): Chịu mặn cấp 3 ở nồng độ 4‰; Fe gạo lức đạt 16,15 mg/kg; Fe gạo trắng đạt 6,09 mg/kg; amylose đạt 17,90%; năng suất vụ Đông Xuân đạt 6,85 tấn/ha.
  • Dòng BC3F5-22-1-1 (tổ hợp OM238/Pokkali): Chịu mặn cấp 3; Fe gạo lức đạt 15,85 mg/kg; Fe gạo trắng đạt 6,02 mg/kg; amylose đạt 19,90%; năng suất vụ Đông Xuân đạt 7,15 tấn/ha.
  • Dòng BC3F5-22-1-3 (tổ hợp OM238/Pokkali): Chịu mặn cấp 3-5; Fe gạo lức đạt 14,70 mg/kg; Fe gạo trắng đạt 5,39 mg/kg; amylose đạt 18,66%; năng suất vụ Đông Xuân đạt 6,92 tấn/ha. Cả 3 dòng đều có thời gian sinh trưởng ngắn (96-98 ngày), chiều cao cây lý tưởng (97,8 - 100,2 cm), hạt gạo thon dài và độ bền gel mềm (66-74 mm).

5. Thí nghiệm thanh lọc mặn nhân tạo và khảo nghiệm đồng ruộng được thực hiện ở những ngưỡng nồng độ nào?

Thí nghiệm thanh lọc mặn nhân tạo giai đoạn mạ được thực hiện trong khay chứa dung dịch dinh dưỡng Yoshida ở nồng độ mặn cố định là EC = 8 dS/m (tương đương 4‰ NaCl), đánh giá mức độ tổn thương sau 16 ngày theo tiêu chuẩn SES của IRRI (1997). Khảo nghiệm đồng ruộng thực địa được thực hiện tại 3 điểm: ruộng giống Viện Lúa ĐBSCL (Cần Thơ, đối chứng nước ngọt), ruộng đất nhiễm mặn tại huyện Kiên Lương/An Biên (tỉnh Kiên Giang) và ruộng đất nhiễm mặn tại huyện Trần Đề (tỉnh Sóc Trăng) qua hai mùa vụ Hè Thu 2017 và Đông Xuân 2017-2018 với độ mặn tự nhiên của nước và đất được quan trắc định kỳ.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Mỹ Duyên đã thực hiện thành công việc tích hợp ba tính trạng mục tiêu phức tạp gồm tính chịu mặn, hàm lượng sắt cao và hàm lượng amylose thấp trên cây lúa thông qua việc kết hợp phương pháp lai hồi giao truyền thống với công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử SSR. Bằng việc sử dụng nguồn gen chịu mặn Pokkali lai hồi giao ba lần với các giống lúa cao sản OM231, OM238 và OM5451, tác giả đã sàng lọc và tuyển chọn được 3 dòng lúa thuần ưu tú ở thế hệ BC3F5 (BC3F5-5-1-1, BC3F5-22-1-1 và BC3F5-22-1-3). Các dòng lúa này mang đoạn gen Saltol, chịu được nồng độ mặn 4‰ ở giai đoạn mạ, có năng suất cao từ 6,85 đến 7,15 tấn/ha, thời gian sinh trưởng ngắn (96-98 ngày), phẩm chất hạt thon dài ít bạc bụng, cơm mềm dẻo (amylose ≤ 19,90%) và tích lũy hàm lượng sắt vượt trội (gạo lức đạt 14,70 - 16,15 mg/kg, gạo trắng đạt 5,39 - 6,09 mg/kg). Công trình cung cấp nguồn vật liệu di truyền và quy trình chọn giống có giá trị cao, đóng góp thiết thực cho định hướng phát triển nông nghiệp thích ứng biến đổi khí hậu tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long.