XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GENE MÃ HÓA CHO ΚHẢ NĂNG TIẾT MEN CARBAPENEMASE Ở CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI VIỆN PASTEUR TP. HCM

• Tác giả: Đỗ Thị Ngọc Bích
• Người hướng dẫn: TS. Cao Hữu Nghĩa
• Trường học: Trường Đại Học Mở Tp.hcm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xác Định Một Số Gene Mã Hóa Cho Khả Năng Tiết Men Carbapenemase Ở Chủng Pseudomonas Aeruginosa Được Phân Lập Tại Viện Pasteur Tp. Hcm
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Lịch sử nghiên cứu Pseudomonas aeruginosa
• 1.2. Đặc điểm sinh vật học của P. aeruginosa
• 1.3. Cơ chế tác động của kháng sinh
• 1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.5. Nghiên cứu về P. aeruginosa
• 1.6. Nghiên cứu về 2 gene mục tiêu: blaVIM2 và blaNDM-1
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị, hóa chất và môi trường
• 2.2. Môi trường
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm trên môi trường chuyên biệt
• 2.3.2. Định danh vi khuẩn
• 2.3.3. Xác định khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp Kirby-Bauer
• 2.3.4. Qui trình thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ
• 2.3.5. Thử nghiệm khả năng sản xuất carbapenemase bằng Hodge test
• 2.3.6. Phương pháp PCR phát hiện gene mã hóa cho enzyme carbapenemase
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập các chủng P. aeruginosa từ các mẫu bệnh phẩm tại Viện Pasteur TP. HCM
• 3.2. Khảo sát khả năng tiết men carbapenemase ở các chủng P. aeruginosa được phân lập tại Viện Pasteur TP. HCM
• 3.3. Xác định một số gene mã hóa cho khả năng tiết men này ở các chủng P. aeruginosa được phân lập tại Viện Pasteur TP. HCM
• PHỤ LỤC
• A.1. Thành phần môi trường
• A.2. Kết quả kháng sinh đồ của bệnh nhân
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Gene Mã Hóa Carbapenemase ở P

Pseudomonas aeruginosa, hay trực khuẩn mủ xanh, là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, đặc biệt trong môi trường bệnh viện. Khả năng kháng kháng sinh của P. aeruginosa ngày càng gia tăng, đặc biệt là kháng với carbapenem, một loại kháng sinh được coi là vũ khí cuối cùng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra. Sự kháng thuốc này liên quan đến khả năng sản xuất carbapenemase, một loại enzyme có khả năng phá hủy carbapenem. Nghiên cứu gene mã hóa carbapenemase ở P. aeruginosa có vai trò quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế kháng thuốc và phát triển các biện pháp đối phó hiệu quả. Nghiên cứu tập trung vào các gene như blaNDM-1 và blaVIM2 trong việc mã hóa khả năng tiết men carbapenemase.

1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu và Phân Loại Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa được Schroeter phát hiện lần đầu năm 1872 và đặt tên là Bacterium aeruginosa. Năm 1882, Carle Gessard phân lập được vi khuẩn này từ mủ vết thương và ghi nhận đặc điểm sinh sắc tố xanh. Năm 1900, Miguila chuyển vi khuẩn sang giống Pseudomonas. Đến năm 1960, tên gọi Pseudomonas aeruginosa được thống nhất. Theo Bergey's (1974), giống Pseudomonas có 96 loài khác nhau, trong đó P. aeruginosa liên quan nhiều đến y học. P. aeruginosa thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gamaproteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadaceae và chi Pseudomonas.

1.2. Đặc Điểm Sinh Vật Học Của Trực Khuẩn Mủ Xanh

P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, thẳng hoặc hơi cong, có đơn mao ở một đầu giúp di động. Kích thước khoảng 0,6 x 2 µm. Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, bề mặt động thực vật. Trên cơ thể người, chúng thường có mặt trong đường tiêu hóa và các vùng ẩm ướt như da, niêm mạc. Vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trong môi trường hạn chế dinh dưỡng và chất khử trùng, thuốc mỡ, xà phòng. Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa thường xảy ra khi cơ thể suy giảm miễn dịch, mắc bệnh ác tính hoặc mạn tính, sử dụng corticoid, kháng sinh kéo dài. Vi khuẩn này thường được coi là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện.

II. Thách Thức Kháng Kháng Sinh Carbapenem ở P

Sự gia tăng kháng carbapenem ở vi khuẩn gram âm, đặc biệt là P. aeruginosa, là một thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng. Carbapenem được coi là một trong những lựa chọn kháng sinh cuối cùng để chống lại các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng P. aeruginosa có khả năng sản xuất enzym carbapenemase đã làm giảm hiệu quả của loại kháng sinh này. Điều này gây ra những khó khăn lớn trong việc điều trị nhiễm trùng và làm tăng nguy cơ tử vong ở bệnh nhân. Cần có các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả và phát triển các loại thuốc mới để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh này.

2.1. Cơ Chế Tác Động Của Kháng Sinh và Vai Trò Carbapenem

Kháng sinh ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh hóa ở cấp độ phân tử. Carbapenem là một phân lớp của lớp Penem thuộc nhóm kháng sinh β-lactams có phổ kháng khuẩn rộng nhất. Chúng thường được sử dụng như vũ khí cuối cùng đối với những bệnh nhân nhiễm khuẩn nặng hoặc các kháng sinh khác đã bị vô hiệu hóa hoặc không phù hợp. Carbapenem gồm các kháng sinh ertapenem, imipenem, meropenem và doripenem. Đây là những kháng sinh β-lactam có phổ kháng khuẩn rộng nhất hiện nay.

2.2. Cơ Chế Kháng Carbapenem Vai Trò Của Enzym Carbapenemase

Carbapenemase là enzyme thuộc nhóm β-lactamase, có khả năng thủy phân Penicillin, Cephalosporin phổ rộng và các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, bao gồm cả Carbapenem. Dựa vào cấu trúc, β-lactamase được chia làm 2 nhóm: nhóm có Serine (A, C, D) và nhóm có Zn (B, MBL). P. aeruginosa chủ yếu sản xuất các enzyme MBL: VIM, SIM, IPM, GIM, NDM-1. Việc sản xuất carbapenemase là nguyên nhân chính gây ra kháng carbapenem ở vi khuẩn.

III. Phương Pháp PCR Phát Hiện Gene Mã Hóa Carbapenemase Hiệu Quả

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật hiệu quả để phát hiện gene mã hóa carbapenemase trong các chủng P. aeruginosa. Kỹ thuật này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể, giúp xác định sự hiện diện của các gene kháng kháng sinh một cách nhanh chóng và chính xác. Việc sử dụng PCR trong nghiên cứu giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về sự lan truyền của các gene kháng kháng sinh và đưa ra các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn phù hợp.

3.1. Quy Trình Thực Hiện PCR và Thiết Kế Primer

Quy trình PCR bao gồm các bước: biến tính DNA, gắn mồi (primer), và kéo dài chuỗi. Việc thiết kế primer (đoạn mồi) đặc hiệu cho các gene mục tiêu như blaVIM2 và blaNDM-1 là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Trình tự primer, gene mục tiêu và chiều dài gene mục tiêu là những yếu tố cần được xác định rõ ràng trước khi thực hiện PCR.

3.2. Thành Phần Phản Ứng PCR và Chu Trình Nhiệt

Thành phần phản ứng PCR bao gồm: DNA mẫu, primer, enzyme polymerase, nucleotide, và dung dịch đệm. Chu trình nhiệt cho mỗi cặp primer cần được tối ưu hóa để đạt hiệu quả khuếch đại cao nhất. Thông thường, chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: biến tính, gắn mồi, và kéo dài, với nhiệt độ và thời gian được điều chỉnh phù hợp với từng cặp primer và gene mục tiêu.

IV. Nghiên Cứu Thực Nghiệm Xác Định Gene Mã Hóa Tại Viện Pasteur

Nghiên cứu tại Viện Pasteur TP.HCM đã phân lập các chủng P. aeruginosa từ mẫu bệnh phẩm. Khảo sát khả năng tiết men carbapenemase và xác định một số gene mã hóa khả năng tiết men này ở các chủng P. aeruginosa được phân lập. Đánh giá sự tồn tại của 2 gene mục tiêu blaNDM-1 và blaVIM2 trong việc mã hóa cho khả năng tiết men carbapenemase ở các chủng P. aeruginosa được phân lập. Việc xác định các gene kháng kháng sinh này giúp theo dõi sự lan truyền và tiến hóa của chúng.

4.1. Phân Lập và Định Danh Các Chủng Pseudomonas aeruginosa

Việc phân lập P. aeruginosa từ các mẫu bệnh phẩm được thực hiện trên môi trường chuyên biệt. Sau khi phân lập, vi khuẩn được định danh bằng các phương pháp sinh hóa và xét nghiệm đặc hiệu. Các chủng P. aeruginosa được xác định sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm kháng sinh đồ và xác định gene kháng kháng sinh.

4.2. Thử Nghiệm Khả Năng Tiết Men Carbapenemase Bằng Hodge Test

Thử nghiệm Hodge được sử dụng để khảo sát khả năng tiết men carbapenemase của các chủng P. aeruginosa. Kết quả thử nghiệm Hodge được so sánh với kết quả PCR để xác định mối tương quan giữa khả năng tiết men và sự hiện diện của các gene mã hóa carbapenemase.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Điều Trị Nhiễm Trùng P

Kết quả nghiên cứu về gene mã hóa carbapenemase ở P. aeruginosa có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị nhiễm trùng Pseudomonas aeruginosa. Việc xác định các gene kháng kháng sinh giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, tránh sử dụng các loại kháng sinh không hiệu quả. Phát triển các loại thuốc mới và các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn là cần thiết để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

5.1. Lựa Chọn Kháng Sinh Phù Hợp Dựa Trên Kết Quả Nghiên Cứu

Dựa trên kết quả nghiên cứu về gene kháng kháng sinh, bác sĩ có thể lựa chọn kháng sinh phù hợp để điều trị nhiễm trùng P. aeruginosa. Việc sử dụng kháng sinh đúng cách và hợp lý giúp giảm nguy cơ phát triển kháng kháng sinh và cải thiện hiệu quả điều trị.

5.2. Phát Triển Thuốc Mới và Biện Pháp Kiểm Soát Nhiễm Khuẩn

Việc phát triển các loại thuốc mới có khả năng ức chế enzyme carbapenemase hoặc tác động lên các cơ chế kháng thuốc khác là rất quan trọng. Đồng thời, cần tăng cường các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn để ngăn chặn sự lây lan của các chủng P. aeruginosa kháng kháng sinh.

VI. Kết Luận Tương Lai Nghiên Cứu Về Kháng Kháng Sinh

Nghiên cứu về kháng kháng sinh carbapenem ở P. aeruginosa là một lĩnh vực quan trọng và đầy thách thức. Việc hiểu rõ cơ chế kháng thuốc và sự lan truyền của các gene kháng kháng sinh là cần thiết để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các loại thuốc mới, các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả và các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Gene Kháng Kháng Sinh

Các hướng nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc xác định các gene kháng kháng sinh mới, nghiên cứu cơ chế điều hòa biểu hiện gene kháng kháng sinh, và phát triển các phương pháp can thiệp vào quá trình kháng thuốc.

6.2. Vai Trò Của Tin Sinh Học Trong Nghiên Cứu Gene Carbapenemase

Tin sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích trình tự gene carbapenemase, xác định các đột biến, và dự đoán cấu trúc và chức năng của enzyme. Ứng dụng tin sinh học giúp tăng tốc quá trình nghiên cứu và đưa ra các thông tin quan trọng để phát triển các loại thuốc mới.