Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh) là vi khuẩn Gram âm hiếu khí, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những tác nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện cơ hội nguy hiểm. Chủng vi khuẩn này thường xuyên gây nhiễm trùng da, vết thương, bỏng, nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết và viêm màng não trên những bệnh nhân suy giảm miễn dịch hoặc điều trị xâm lấn dài ngày. Trong thực hành lâm sàng, nhóm kháng sinh carbapenem (bao gồm imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem) thuộc phân lớp penem của họ $\beta$-lactam được xem là phòng tuyến cuối cùng hữu hiệu để điều trị các ca nhiễm trùng nặng do trực khuẩn Gram âm đa kháng. Tuy nhiên, sự gia tăng nhanh chóng của các chủng P. aeruginosa có khả năng sản xuất carbapenemase—nhóm enzyme có khả năng thủy phân hoàn toàn vòng $\beta$-lactam của carbapenem—đã dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh trầm trọng, làm vô hiệu hóa hiệu lực điều trị của nhóm thuốc này trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam.
Trước yêu cầu cấp thiết về việc giám sát dịch tễ học phân tử và tối ưu hóa phác đồ điều trị, đề tài "Xác định một số gene mã hóa cho khả năng tiết men carbapenemase ở chủng Pseudomonas aeruginosa được phân lập tại Viện Pasteur TP. HCM" được thực hiện nhằm đánh giá thực trạng đề kháng và sự hiện diện của hai gene sinh men metallo-$\beta$-lactamase (MBL) tiêu biểu là blaVIM2 và blaNDM-1.
Nhiệm vụ nghiên cứu được văn bản xác định cụ thể theo 3 mục tiêu:
- Phân lập các chủng P. aeruginosa từ các mẫu bệnh phẩm tại Viện Pasteur TP.HCM.
- Khảo sát khả năng tiết men carbapenemase ở các chủng P. aeruginosa được phân lập tại Viện Pasteur TP.HCM bằng thử nghiệm hình thái kiểu hình.
- Xác định một số gene mã hóa cho khả năng tiết men này (blaVIM2 và blaNDM-1) ở các chủng P. aeruginosa được phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn P. aeruginosa phân lập từ 442 mẫu xét nghiệm lâm sàng (bao gồm máu, đàm, mủ, nước tiểu) của bệnh nhân.
- Không gian thực hiện: Phòng Vi sinh Bệnh phẩm, Khoa LAM, Viện Pasteur TP.HCM.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 03/2016 đến tháng 05/2016.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm vi sinh vật học kết hợp sinh học phân tử, được xây dựng dựa trên cơ sở phân loại enzyme $\beta$-lactamase và cơ chế tác động của kháng sinh:
Khung lý thuyết và cơ sở khoa học
- Cơ chế tác động và phân loại men đề kháng: Kháng sinh họ $\beta$-lactam tác động bằng cách ức chế các protein gắn penicillin (PBP - Penicillin Binding Protein), ngăn cản quá trình tổng hợp mạng lưới peptidoglycan ở vách tế bào vi khuẩn. Để chống lại, vi khuẩn tiết enzyme carbapenemase thuộc nhóm $\beta$-lactamase. Theo cấu trúc vị trí hoạt động, men được chia làm hai nhóm lớn: nhóm phụ thuộc Serine (Ambler lớp A gồm KPC, SME, GES; lớp C gồm AmpC; lớp D gồm OXA) và nhóm phụ thuộc ion kim loại $\text{Zn}^{2+}$ (Ambler lớp B, tức Metallo-$\beta$-lactamase - MBL). P. aeruginosa chủ yếu sinh men MBL bao gồm VIM, IMP, SIM, GIM, SPM và NDM-1.
- Gene mục tiêu khảo sát:
- Gene blaVIM2: Mã hóa cho enzyme VIM-2 (Verona integron-encoded metallo-$\beta$-lactamase), thuộc nhóm MBL lần đầu phát hiện tại Pháp năm 1996 trên P. aeruginosa.
- Gene blaNDM-1: Mã hóa cho New Delhi metallo-$\beta$-lactamase-1, phát hiện lần đầu năm 2008 ở chủng Klebsiella pneumoniae, có khả năng ly giải hầu hết $\beta$-lactam (ngoại trừ aztreonam) và chỉ tương đồng 32,4% trình tự amino acid với VIM-1 và VIM-2.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Thu thập và phân lập mẫu bệnh phẩm: Quy trình thu thập và xử lý bệnh phẩm tuân thủ tiêu chuẩn ISO 15189:2012 của Viện Pasteur TP.HCM:
- Mẫu máu: Cấy trực tiếp vào chai cấy máu 2 pha BHI (Brain Heart Infusion) có 5% máu cừu và 0,025% SPS; ủ $37^\circ\text{C}$ trong 24 giờ; cấy chuyển sang thạch Columbia (CO) và Chocolate Agar (CA).
- Mẫu đàm: Xử lý pha loãng với nước muối sinh lý 1:1, cấy thạch nghiêng SAB-Cho (phân lập nấm), cấy định tính ba chiều trên CO, cấy định lượng hình sao trên CA và nhuộm Gram.
- Mẫu mủ: Tăng sinh trong canh thang BHI, cấy kiểm chứng trên CO, CA và SAB-Cho.
- Mẫu nước tiểu: Cấy định lượng hình sao bằng khuyên cấy $10,\mu\text{l}$ trên thạch BCP (Bromocresol Purple Agar), ly tâm soi tươi cặn lắng.
- Định danh vi khuẩn: Kết hợp soi tươi, nhuộm Gram, khảo sát tính chất sinh hóa sơ bộ (hiếu khí tuyệt đối, oxidase (+), catalase (+), Simmons Citrate (+), mannitol (+), indol (-), $\text{H}_2\text{S}$ (-), ADH (+), LDC (-), ODC (-), không lên men glucose/lactose, sinh sắc tố pyocyanin/pyoverdin) và định danh khẳng định bằng bộ kit API 20NE hoặc máy tự động VITEK 2.
- Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh (Kirby-Bauer): Thực hiện theo chuẩn Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI 2014) trên môi trường Mueller-Hinton (MH) với 14 loại đĩa kháng sinh của hãng Bio-Rad, mầm cấy đạt độ đục McFarland 0.5 ($10^8,\text{CFU/ml}$).
- Thử nghiệm phát hiện kiểu hình sinh carbapenemase (Hodge test cải tiến): So sánh thử nghiệm Hodge truyền thống và Hodge cải tiến (bổ sung $10,\mu\text{l},\text{ZnSO}_4$ $0{,}5\text{M}$ lên đĩa meropenem $10,\mu\text{g}$ hoặc ertapenem $10,\mu\text{g}$). Sử dụng chủng chỉ định Escherichia coli ATCC 25922; chủng chứng dương K. pneumoniae ATCC BAA 1705; chủng chứng âm K. pneumoniae ATCC BAA 1706. Sự tăng sinh hình nan quạt tại vùng giao thoa xác nhận kết quả dương tính.
- Phương pháp sinh học phân tử (PCR): Tách chiết DNA bằng phương pháp sốc nhiệt ($100^\circ\text{C}$ trong 10 phút trên máy Thermo-Shaker TS100 với dung dịch đệm Tris-HCl $10,\text{mM}$, pH = 8). Phản ứng PCR thực hiện với thể tích $25,\mu\text{l}$ sử dụng kit TopTaq Master Mix 2X. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 0,5X ở hiệu điện thế 100V trong 40 phút, nhuộm Ethidium Bromide và ghi nhận hình ảnh bằng hệ thống GelDoc-It 320 Imager.
| Thông số kỹ thuật PCR | Gene blaVIM2 | Gene blaNDM-1 |
|---|---|---|
| Trình tự mồi Forward | 5'-GATGGTGTTTGGTCGCATA-3' | 5'-CGCAACACAGCCTGACTTT-3' |
| Trình tự mồi Reverse | 5'-CGAATGCGCAGCACCAG-3' | 5'-TCGATCCCAACGGTGATATT-3' |
| Kích thước sản phẩm | 390 bp | 127 bp |
| Tiền biến tính | $94^\circ\text{C}$ trong 10 phút | $95^\circ\text{C}$ trong 10 phút |
| Biến tính | $94^\circ\text{C}$ trong 50 giây | $95^\circ\text{C}$ trong 15 giây |
| Bắt cặp mồi | $51^\circ\text{C}$ trong 40 giây | $57^\circ\text{C}$ trong 40 giây |
| Kéo dài | $72^\circ\text{C}$ trong 50 giây | $72^\circ\text{C}$ trong 50 giây |
| Kéo dài kết thúc | $72^\circ\text{C}$ trong 5 phút | $72^\circ\text{C}$ trong 5 phút |
| Số chu kỳ | 36 chu kỳ | 40 chu kỳ |
| Mẫu chứng dương | Mẫu số 405 (Hoàng Doãn Cảnh, 2014) | Mẫu số 793 (Hoàng Doãn Cảnh, 2014) |
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1. Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu từ khi Schroeter phát hiện vi khuẩn năm 1872, Carle Gessard phân lập từ mủ vết thương năm 1882, cho đến khi danh pháp Pseudomonas aeruginosa được thống nhất vào năm 1960. Tác giả trình bày chi tiết các đặc điểm hình thái trực khuẩn Gram âm kích thước $0{,}6 \times 2,\mu\text{m}$, chuyển động nhờ đơn mao, khả năng sinh 4 loại sắc tố (pyocyanin, pyoverdin, pyorubrin, pyomelanin) và cấu trúc lỗ porin màng ngoài hạn chế tính thấm giúp vi khuẩn có sức đề kháng tự nhiên cao.
Về mặt hóa dược và sinh học phân tử, chương phân tích cấu trúc 4 loại kháng sinh carbapenem (ertapenem, imipenem, meropenem, doripenem), cơ chế ức chế vách peptidoglycan qua PBP và sơ đồ phân loại enzyme carbapenemase (nhóm Serine và nhóm MBL phụ thuộc $\text{Zn}^{2+}$). Đồng thời, tác giả tổng hợp tình hình dịch tễ đề kháng trên thế giới (dữ liệu CDC Hoa Kỳ 2013 với hơn 6.700 ca nhiễm đa kháng và 440 ca tử vong; nghiên cứu tại Iran với 94,7% kháng imipenem) và tại Việt Nam (Lê Bảo Huy năm 2005 ghi nhận 66,7% kháng imipenem; Bùi Nghĩa Thịnh năm 2010 ghi nhận 50% kháng imipenem). Tổng quan cũng điểm lại các mốc nghiên cứu phát hiện gene blaVIM2 (Franco MR ghi nhận 19% năm 2006; Mahnaz Sarhangi ghi nhận 21,95% năm 2013) và gene blaNDM-1 (Kumarasamy phân tích 180 chủng vi khuẩn đường ruột; Mariappan Shanthi phát hiện 6,56% trên P. aeruginosa năm 2014).
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị (máy Real-time PCR Stratagene Mx3005P, máy ủ lắc TS100, tủ an toàn sinh học cấp 2 ESCO và EHRET, máy đọc gel GelDoc-It 320, máy định danh VITEK 2), hệ thống môi trường nuôi cấy chuyên biệt và hóa chất đạt chuẩn nghiên cứu sinh học phân tử.
Nội dung trọng tâm của chương là chuẩn hóa các quy trình thao tác:
- Quy trình phân lập vi khuẩn từ từng loại bệnh phẩm (máu, đàm, mủ, nước tiểu) đảm bảo chuẩn ISO 15189:2012.
- Quy trình định danh sinh hóa sơ bộ và khẳng định qua kit API 20NE.
- Quy trình thử nghiệm kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy Kirby-Bauer đo đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn CLSI 2014 đối với 14 loại kháng sinh.
- Quy trình kỹ thuật thử nghiệm Hodge truyền thống song song với thử nghiệm Hodge cải tiến có bổ sung $10,\mu\text{l},\text{ZnSO}_4$ $0{,}5\text{M}$ nhằm tối ưu hóa điều kiện phản ứng của enzyme nhóm MBL.
- Quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp biến tính nhiệt ở $100^\circ\text{C}$ và thiết lập công thức phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại phân đoạn 390 bp của gene blaVIM2 và phân đoạn 127 bp của gene blaNDM-1.
Chương 3. Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ 442 mẫu bệnh phẩm lâm sàng và đối chiếu với các công bố khoa học trong và ngoài nước:
1. Kết quả phân lập và đặc điểm dịch tễ
Từ 442 mẫu bệnh phẩm, phát hiện 91 mẫu dương tính với trực khuẩn Gram âm (tỷ lệ 20,58%). Trong 91 mẫu trực khuẩn Gram âm này, P. aeruginosa chiếm 30 mẫu (tỷ lệ 32,97%), đứng thứ hai sau nhóm trực khuẩn Gram âm có lên men (E. coli, Klebsiella spp. chiếm 47,25% với 43 mẫu) và cao hơn Acinetobacter spp. (19,78% với 18 mẫu).
- Phân bố theo giới tính: Bệnh nhân nam chiếm ưu thế rõ rệt với 23/30 ca (76,67%), bệnh nhân nữ chiếm 7/30 ca (23,33%). Tác giả thảo luận tỷ lệ này tương đồng với nghiên cứu của Prashanth và cộng sự (nam chiếm 71,8%).
- Phân bố theo nhóm tuổi: Tỷ lệ nhiễm tăng dần theo độ tuổi; nhóm người cao tuổi từ 60 tuổi trở lên chiếm tỷ lệ cao nhất với 11 ca (36,66%), tiếp theo là nhóm 50–59 tuổi với 6 ca (20,00%), hai nhóm 20–29 tuổi và 40–49 tuổi đều ghi nhận 5 ca (16,67%), nhóm 30–39 tuổi có 2 ca (6,67%) và dưới 20 tuổi chỉ có 1 ca (3,33%).
- Phân bố theo loại bệnh phẩm: P. aeruginosa hiện diện nhiều nhất trong mẫu đàm với 18/30 mẫu (60,00%), kế đến là mủ với 8/30 mẫu (26,66%), nước tiểu có 2/30 mẫu (6,67%) và máu có 2/30 mẫu (6,67%). Điều này chứng minh đường hô hấp là cửa ngõ xâm nhiễm quan trọng nhất của vi khuẩn.
| Nhóm tuổi | Tần số ($n=30$) | Tỷ lệ (%) | Loại bệnh phẩm | Tần số ($n=30$) | Tỷ lệ (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| $< 20$ tuổi | 1 | 3,33 | Đàm | 18 | 60,00 |
| $20 - 29$ tuổi | 5 | 16,67 | Mủ | 8 | 26,66 |
| $30 - 39$ tuổi | 2 | 6,67 | Nước tiểu | 2 | 6,67 |
| $40 - 49$ tuổi | 5 | 16,67 | Máu | 2 | 6,67 |
| $50 - 59$ tuổi | 6 | 20,00 | |||
| $\ge 60$ tuổi | 11 | 36,66 |
2. Kết quả kháng sinh đồ
Khảo sát tính nhạy cảm với 14 loại kháng sinh cho thấy mức độ kháng thuốc trung bình của các chủng là 50,24%, phản ánh tính chất đa kháng nghiêm trọng. Có 10/14 loại kháng sinh bị kháng ở mức từ 50% trở lên.
| STT | Tên kháng sinh | Ký hiệu | Kháng (R) % | Trung gian (I) % | Nhạy (S) % |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Sulfamides | SSS | 86,67 | - | 13,33 |
| 2 | Ticarcillin/clavulanic acid | TIM | 66,67 | 23,33 | 10,00 |
| 3 | Cefsulodine | CFS | 63,33 | - | 36,67 |
| 4 | Cefoperazone | CFP | 60,00 | 10,00 | 30,00 |
| 5 | Imipenem | IPM | 56,67 | 6,67 | 36,67 |
| 6 | Ciprofloxacin | CIP | 53,33 | 3,33 | 43,34 |
| 7 | Gentamicin | CN | 53,33 | - | 46,67 |
| 8 | Tobramycin | TM | 53,33 | 3,33 | 43,33 |
| 9 | Piperacillin | PRL | 50,00 | - | 50,00 |
| 10 | Fosfomycin | FOS | 50,00 | - | 50,00 |
| 11 | Cefepime | FEP | 46,67 | 13,33 | 40,00 |
| 12 | Aztreonam | ATM | 33,33 | 40,00 | 26,67 |
| 13 | Amikacin | AK | 26,67 | - | 73,33 |
| 14 | Colistin | CT | 3,33 | - | 96,67 |
Đáng lưu ý, tỷ lệ kháng imipenem (IPM) lên tới 56,67%. Kháng sinh duy trì được độ nhạy cảm cao nhất là Colistin (96,67% nhạy, tỷ lệ kháng 3,33%) và Amikacin (73,33% nhạy, kháng 26,67%). Sự xuất hiện của 3,33% chủng kháng Colistin là chỉ dấu cảnh báo nghiêm trọng do Colistin là kháng sinh cứu cánh cuối cùng.
3. Kết quả thử nghiệm Hodge test
Trên 30 chủng khảo sát kiểu hình sinh enzyme carbapenemase:
- Hodge test truyền thống: Ghi nhận 5/30 chủng dương tính (tỷ lệ 16,67%).
- Hodge test cải tiến (bổ sung $10,\mu\text{l},\text{ZnSO}_4$ $0{,}5\text{M}$): Phát hiện thêm 3 chủng dương tính (trong đó có 1 chủng trùng với kết quả test truyền thống), nâng tổng số ca dương tính lên 7/30 chủng (tỷ lệ 23,33%).
- Tác giả biện luận rằng việc bổ sung muối kẽm đã kích thích hoạt tính enzyme nhóm MBL (vốn phụ thuộc ion $\text{Zn}^{2+}$ tại tâm hoạt động), làm vòng ức chế rõ ràng, hình nan quạt dễ quan sát hơn và tăng độ nhạy phát hiện so với phương pháp cổ điển. Ngoài ra, tỷ lệ sinh men (23,33%) thấp hơn nhiều so với tỷ lệ kháng imipenem (56,67%), chứng minh P. aeruginosa còn kháng carbapenem qua các cơ chế khác như bơm đẩy chủ động hoặc đột biến mất kênh porin OprD.
4. Kết quả PCR phát hiện gene blaVIM2 và blaNDM-1
Kỹ thuật PCR khảo sát trên 24 chủng vi khuẩn cho thấy:
- Gene blaVIM2 (kích thước 390 bp): Có 2/24 chủng mang gene, chiếm tỷ lệ 8,33% (mẫu số 65 và 183).
- Gene blaNDM-1 (kích thước 127 bp): Có 15/24 chủng mang gene, chiếm tỷ lệ 62,5% (các mẫu số 65, 149, 223, 225, 557, 619, 697, 795, 807, 836, 847, 850, 851, 918 và 96).
| Tên gene mục tiêu | Số chủng khảo sát | Số chủng mang gene | Tỷ lệ (%) | Kích thước phân đoạn |
|---|---|---|---|---|
| blaVIM2 | 24 | 2 | 8,33 | 390 bp |
| blaNDM-1 | 24 | 15 | 62,50 | 127 bp |
5. Biện luận đối chiếu giữa Hodge test và PCR
Đối chiếu kiểu hình và kiểu gene trên tập mẫu thử nghiệm mang lại các phát hiện sinh học quan trọng:
- Trong 7 chủng dương tính với Hodge test, có 6 chủng (số 65, 697, 836, 847, 851, 918) mang gene kháng thuốc đã khảo sát; trong đó đặc biệt có mẫu số 65 mang đồng thời cả hai gene blaVIM2 và blaNDM-1.
- Có 1 chủng dương tính với Hodge test (chủng số 157) nhưng âm tính với cả hai phản ứng PCR. Tác giả nhận định khả năng chủng này mang các gene sinh carbapenemase khác ngoài phạm vi nghiên cứu (như blaIMP, blaSIM, blaSPM, blaGIM, blaOXA hoặc blaKPC).
- Ngược lại, có 10 chủng (số 149, 183, 223, 225, 557, 619, 795, 807, 850, 96) có kết quả Hodge test âm tính nhưng PCR lại dương tính với 1 trong 2 gene mục tiêu. Hiện tượng này được lý giải là vi khuẩn mới chỉ mang gen ở mức độ kiểu gene tiềm ẩn (gen câm hoặc mức độ biểu hiện phiên mã/dịch mã quá thấp), chưa biểu hiện thành kiểu hình sinh enzyme hoàn chỉnh trong điều kiện thử nghiệm in vitro.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Xác lập tỷ lệ phân lập P. aeruginosa chiếm 32,97% (30/91) các trường hợp nhiễm trực khuẩn Gram âm từ 442 mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại Viện Pasteur TP.HCM; trong đó tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 76,67%, nhóm tuổi $\ge 60$ chiếm 36,66% và nguồn bệnh phẩm từ đàm chiếm đa số (60,00%).
- Đánh giá phổ nhạy cảm với 14 loại kháng sinh: Ghi nhận tỷ lệ kháng imipenem ở mức cao (56,67%), tỷ lệ kháng cao nhất là Sulfamides (86,67%), trong khi Colistin (kháng 3,33%, nhạy 96,67%) và Amikacin (kháng 26,67%, nhạy 73,33%) là hai kháng sinh còn hiệu lực ức chế tốt nhất.
- Đánh giá khả năng sinh carbapenemase qua Hodge test đạt 23,33% khi bổ sung $\text{ZnSO}_4$ (so với 16,67% ở test truyền thống).
- Xác định tỷ lệ hiện diện của hai gene mục tiêu bằng kỹ thuật PCR trên 24 chủng: gene blaVIM2 chiếm 8,33% (2/24) và gene blaNDM-1 chiếm tỷ lệ cao vượt trội 62,5% (15/24). Phát hiện 1 chủng lâm sàng mang đồng thời cả 2 gene.
Giải pháp và kiến nghị của tác giả
- Thận trọng trong sử dụng Colistin: Việc phát hiện 3,33% chủng đã kháng Colistin là cảnh báo trực tiếp đối với các bác sĩ lâm sàng, cần thận trọng trong chỉ định và bảo tồn Colistin như loại thuốc dự phòng cuối cùng.
- Cải tiến quy trình xét nghiệm: Đề xuất các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng áp dụng phương pháp Hodge test cải tiến có bổ sung $10,\mu\text{l},\text{ZnSO}_4$ $0{,}5\text{M}$ để tăng độ nhạy trong phát hiện vi khuẩn sinh men MBL, phục vụ định hướng điều trị sớm và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.
- Kết hợp kỹ thuật phân tử: Cần kết hợp định kỳ phương pháp PCR song hành với kháng sinh đồ truyền thống nhằm phát hiện các chủng mang gene kháng thuốc tiềm ẩn (PCR dương tính nhưng kiểu hình chưa biểu hiện) nhằm ngăn ngừa nguy cơ bùng phát dịch nội viện.
Đóng góp so với các nghiên cứu trước
- Tác giả chỉ ra tỷ lệ mang gene blaNDM-1 trong nghiên cứu này (62,5%) cao hơn rất nhiều so với các công bố trước đó của Mariappan Shanthi năm 2014 (6,56%) và Hoàng Doãn Cảnh năm 2014 (3,8%), chứng minh sự lan truyền và tích lũy mạnh mẽ của gene blaNDM-1 trong các chủng P. aeruginosa tại khu vực phía Nam.
- Tỷ lệ mang gene blaVIM2 (8,33%) tương đồng với các dữ liệu quốc tế như Mahnaz Sarhangi và cộng sự (12,2%), Matthew J. Ellington và cộng sự (13,3%), Ryoo và cộng sự (8,6%), khẳng định sự lưu hành ổn định của phân nhóm MBL này.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Quy mô mẫu nghiên cứu còn nhỏ (thu nhận được 30 chủng P. aeruginosa từ 442 mẫu bệnh phẩm trong thời gian 3 tháng; chỉ có 24 chủng được đưa vào khảo sát PCR).
- Phạm vi khảo sát kiểu gene mới dừng lại ở 2 gene mục tiêu (blaVIM2 và blaNDM-1), chưa bao quát hết các biến thể gene sinh carbapenemase khác thuộc nhóm MBL (blaIMP, blaSIM, blaSPM, blaGIM) hoặc nhóm Serine (blaKPC, blaOXA).
- Đề tài chưa đi sâu phân tích các cơ chế đề kháng carbapenem phi enzyme (như cơ chế đột biến mất kênh porin dẫn thuốc OprD hoặc cơ chế bơm tống thuốc chủ động MexAB-OPRM) để giải thích triệt để khoảng chênh lệch giữa tỷ lệ kháng imipenem (56,67%) và tỷ lệ sinh men carbapenemase kiểu hình (23,33%).
Hướng nghiên cứu tiếp
- Mở rộng số lượng mẫu bệnh phẩm thu thập tại nhiều cơ sở y tế trên địa bàn để có cái nhìn tổng thể hơn về dịch tễ học phân tử.
- Thiết kế thêm các cặp mồi PCR đặc hiệu cho các gene carbapenemase khác nhằm xác định bản chất di truyền ở chủng có kiểu hình Hodge test dương tính nhưng âm tính với blaVIM2 và blaNDM-1 (như mẫu số 157).
- Tiến hành giải trình tự chuỗi DNA (sequencing) các sản phẩm PCR và nghiên cứu mức độ biểu hiện biểu sinh (expression) để làm rõ nguyên nhân 10 chủng mang gene nhưng không biểu hiện hoạt tính trên thử nghiệm Hodge test.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Kỹ thuật xét nghiệm y học; các kỹ thuật viên phòng xét nghiệm vi sinh bệnh viện; bác sĩ lâm sàng chuyên ngành truyền nhiễm và kiểm soát nhiễm khuẩn.
- Phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
- Quy trình thực nghiệm nuôi cấy, phân lập bệnh phẩm chuyên biệt theo hệ thống quản lý chất lượng ISO 15189:2012 (Chương 2, Mục 2.2.1 và 2.2.2).
- Kỹ thuật thực hiện và biện luận thử nghiệm Hodge test cải tiến có bổ sung $\text{ZnSO}_4$ để sàng lọc enzyme Metallo-$\beta$-lactamase (Chương 2, Mục 2.2.5).
- Trình tự mồi mồi đặc hiệu, điều kiện chu trình luân nhiệt và thành phần phản ứng PCR để khuếch đại chính xác gene blaVIM2 (390 bp) và blaNDM-1 (127 bp) (Chương 2, Bảng 2.2, 2.3 và 2.4).
- Bộ dữ liệu đối chiếu tỷ lệ đề kháng kháng sinh và tỷ lệ mang gene của P. aeruginosa tại Viện Pasteur TP.HCM năm 2016 so với các nghiên cứu trong và ngoài nước (Chương 3, Bảng 3.4, 3.6 và 3.7).
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao thử nghiệm Hodge test cải tiến lại bổ sung ZnSO4 và hiệu quả mang lại ra sao?
Bản chất của carbapenemase sinh ra bởi P. aeruginosa phần lớn thuộc nhóm B (Metallo-$\beta$-lactamase - MBL), là các enzyme có vị trí hoạt động phụ thuộc bắt buộc vào cofactor ion kim loại $\text{Zn}^{2+}$. Thử nghiệm Hodge truyền thống đôi khi cho kết quả âm tính giả do môi trường nuôi cấy không đủ nồng độ kẽm tự do cho enzyme hoạt động. Việc bổ sung $10,\mu\text{l},\text{ZnSO}_4$ $0{,}5\text{M}$ trực tiếp lên đĩa kháng sinh meropenem hoặc ertapenem giúp phục hồi và tối ưu hóa hoạt tính thủy phân của enzyme MBL, làm vòng ức chế của vi khuẩn chỉ định (E. coli ATCC 25922) bị co hẹp rõ rệt và tạo hình nan quạt sắc nét. Trong đề tài, kỹ thuật bổ sung $\text{ZnSO}_4$ đã phát hiện thêm 3 chủng dương tính, nâng tỷ lệ phát hiện kiểu hình từ 16,67% lên 23,33%.
2. Vì sao tỷ lệ kháng imipenem (56,67%) lại cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ chủng sinh men carbapenemase (23,33%)?
Sự chênh lệch giữa tỷ lệ kháng thuốc trên kháng sinh đồ và tỷ lệ sinh men carbapenemase là do ở vi khuẩn P. aeruginosa, khả năng đề kháng với carbapenem được chi phối bởi nhiều cơ chế đồng thời:
- Thủy phân kháng sinh bằng enzyme (carbapenemase thuộc nhóm MBL hoặc Serine).
- Đột biến làm mất hoặc suy giảm chức năng của protein kênh màng ngoài OprD (porin chuyên biệt cho phép carbapenem đi qua màng ngoài vào khoang chu chất).
- Tăng cường hoạt động của các hệ thống bơm đẩy tích cực (bơm efflux đa kháng) tống thuốc ra ngoài tế bào. Do đó, các chủng đề kháng imipenem nhưng âm tính với thử nghiệm Hodge test đã đề kháng thông qua các cơ chế màng và bơm đẩy chứ không chỉ phụ thuộc vào việc tiết enzyme.
3. Tỷ lệ phát hiện của hai gene mục tiêu blaVIM2 và blaNDM-1 bằng kỹ thuật PCR là bao nhiêu?
Trên tổng số 24 chủng P. aeruginosa được khảo sát bằng phản ứng PCR:
- Gene blaVIM2: Được phát hiện ở 2 chủng (mẫu số 65 và 183), chiếm tỷ lệ 8,33%, kích thước đoạn khuếch đại là 390 bp.
- Gene blaNDM-1: Được phát hiện ở 15 chủng (gồm các mẫu số 65, 149, 223, 225, 557, 619, 697, 795, 807, 836, 847, 850, 851, 918 và 96), chiếm tỷ lệ 62,5%, kích thước đoạn khuếch đại là 127 bp. Đáng chú ý, có 1 chủng (mẫu số 65) mang đồng thời cả hai gene nói trên.
4. Tác giả giải thích hiện tượng kết quả Hodge test không tương đồng với kết quả PCR như thế nào?
Sự không tương đồng diễn ra theo hai chiều:
- Hodge test (+) nhưng PCR (-): Ghi nhận ở mẫu số 157. Nguyên nhân là chủng này tiết men carbapenemase được mã hóa bởi một gene khác ngoài hai gene khảo sát (ví dụ các gene MBL khác như blaIMP, blaSIM, blaSPM, blaGIM hoặc nhóm enzyme Serine-carbapenemase như blaOXA, blaKPC).
- Hodge test (-) nhưng PCR (+): Ghi nhận ở 10 mẫu (số 149, 183, 223, 225, 557, 619, 795, 807, 850, 96). Nguyên nhân là các chủng vi khuẩn này mới chỉ mang cấu trúc di truyền ở mức kiểu gene (gen câm hoặc mức độ phiên mã protein thấp dưới ngưỡng phát hiện kiểu hình), chưa biểu hiện thành enzyme có hoạt tính chức năng hoàn chỉnh để thể hiện kiểu hình trên đĩa thạch.
5. Loại bệnh phẩm nào có tỷ lệ phân lập P. aeruginosa cao nhất và mức độ nhạy cảm kháng sinh nào là khả quan nhất?
Trong 4 loại bệnh phẩm thu thập, mẫu đàm có tỷ lệ phân lập P. aeruginosa cao nhất với 18/30 mẫu (chiếm 60,00%), kế tiếp là mẫu mủ với 8/30 mẫu (chiếm 26,66%), nước tiểu và máu mỗi loại ghi nhận 2/30 mẫu (6,67%). Về tính nhạy cảm kháng sinh, Colistin là kháng sinh có hiệu lực ức chế cao nhất với 96,67% chủng nhạy cảm (tỷ lệ kháng chỉ 3,33%), theo sau là Amikacin với 73,33% chủng nhạy cảm (kháng 26,67%).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đỗ Thị Ngọc Bích đã xác định thực trạng phân lập và đặc điểm dịch tễ đề kháng kháng sinh của 30 chủng Pseudomonas aeruginosa từ 442 mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại Viện Pasteur TP.HCM giai đoạn tháng 03–05/2016. Nghiên cứu khẳng định mức độ đa kháng cao của vi khuẩn với tỷ lệ kháng imipenem lên tới 56,67% và minh chứng hiệu quả của việc bổ sung $\text{ZnSO}_4$ trong cải tiến thử nghiệm kiểu hình Hodge test. Bằng kỹ thuật PCR, đề tài đã phát hiện sự lưu hành của gene blaVIM2 (8,33%) và đặc biệt ghi nhận tỷ lệ mang gene blaNDM-1 ở mức cao vượt trội (62,5%), cung cấp dữ liệu sinh học phân tử có giá trị thực tiễn cho công tác giám sát dịch tễ và phác đồ điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện.