MỞ ĐẦU. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ. Nguồn gốc và phân loại của cây chè. Đặc điểm sinh học chung của cây chè.
Thành phần hóa học của chè. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. Tình hình sản xuất chè trên thế giới. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới. Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam. CATECHINS VÀ LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ.
Catechins và công dụng của Catechins. Cơ chế sinh tổng hợp catechins ở chè. 19 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
Hóa chất, thiết bị. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp thu mẫu lá chè. Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ lá chè.
Điện di RNA tổng số. Tổng hợp cDNA. Nhân gen CsLAR1 bằng kỹ thuật RT –PCR. Tách dòng gen CsLAR1.
Xác định và phân tích trình tự. Tạo vector biểu hiện gen CsLAR1. Biểu hiện gen CsLAR1. 31 CHƯƠNG III.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. KHUẾCH ĐẠI GEN CsLAR1 TỪ MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU. TẠO DÒNG GEN, XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE. Tạo dòng gen CsLAR1.
Xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1. BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CsLAR1 TỪ CHÈ TRUNG DU XANH TRONG VI KHUẨN E. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E. Biểu hiện gen CsLAR1.
43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 46 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh C Catechin Catechin cDNA DNA bổ sung Complementary DNA CsLAR Gen LAR của chè Camellia sinensis LAR DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide Đtg Đồng tác giả et al. Axit etylene diamin tetraaxetic Ethylene Diamine Tetraacetic EDTA Acid EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide EtOH Etanol Ethanol EGCG Epigallocatechin-3-O-gallate Epigallocatechin-3-O-gallate EC Epicatechin Epicatechin ECG Epicatechin-3-O-gallate Epicatechin-3-O-gallate EGC Epigallocatechin Epigallocatechin GC Gallocatechin Gallocatechin Chất cảm ứng biểu hiện gen Isopropyl- -D-thiogalactoside IPTG IPTG Kb Kilô bazơ Kilo base LAR Leucoanthocyanidin reductase Leucoanthocyanidin reductase LB Môi trường LB Luria Bertani mRNA ARN thông tin Mesenger Axit Ribonucleic Trung tâm Thông tin Công National Center for NCBI nghệ Sinh học Quốc gia Biotechnology Information NAD Nicotinamid adenine Nicotinamid adenine vii dinucleotide dinucleotide Nicotinamid adenine Nicotinamid adenine NADP dinucleotide phosphate dinucleotide phosphate ORF Khung đọc mở Open reading frame PA Proanthocyanidin Proanthocyanidin PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Primer R Mồi ngược Primer reverse Primer F Mồi xuôi Primer forward RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngược Reverse Transciptase SSR Chất chỉ thị phân tử Simple sequence repeats TAE TAE Tris Acetate EDTA Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus UTR Vùng không dịch mã Untranslated region viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.
Mầm chè cắt dọc. Sơ đồ đợt sinh trưởng. Các loại lá trên cành chè. Sơ đồ tổng hợp catechins ở chè.
Sơ đồ vector tách dòng pJET 1. Sơ đồ vector biểu hiện pET32a(+). Hình ảnh điện di kết quả PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ chè Trung Du xanh. Kết quả điện di sản phẩm tách dòng gen CsLAR1 từ mẫu chè Trung du xanh trong vector pJET1.
Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong plasmid pJET 1. Kết quả so sánh trình tự gen CsLAR1 phân lập từ mẫu chè Trung du xanh với một số trình tự trên Genbank. So sánh trình tự amino acid suy diễn của CsLAR1 từ giống chè Trung Du xanh với các trình tự đã công bố. Kết quả kiểm tra plasmid.
Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid gắn gen CsLAR1 vào vector pET32a(+). Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_CsLAR1 bằng BamHI và XhoI và PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ plamid. Kết quả điện di sản phẩm protein tổng số từ chủng Rosetta tạo CsLAR1 tái tổ hợp. 44 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.
Thành phần hóa học của chè tươi. Thành phần độ ẩm thay đổi theo tháng trong năm. Diễn biến diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè chính trên thế giới năm 2016. Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong những năm gần đây.
Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA. Trình tự các đoạn mồi sử dụng nhân gen CsLAR1.
Thành phần phản ứng PCR nhân gen CsLAR1. Thành phần phản ứng tạo đầu bằng sản phẩm PCR. Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen CsLAR1 và vector pJET 1. Thành phần phản ứng cắt plasmid.
Sự sai khác một số trình tự nucleotide gen CsLAR1 của chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank. Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa LAR ở giống chè Trung du xanh với trình tự đã công bố trên Genbank. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Chè (Camellia sinensis (L) O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu, được trồng khá phổ biến trên thế giới.
Chè là nước uống thông dụng và được mọi người ưa thích không chỉ bởi hương vị độc đáo của nó, mà còn do nước chè rất có lợi cho sức khỏe. Nước chè có tác dụng giải khát, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ bắp và hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc và chân tay, ngăn chặn sự phát triển và tiến triển của bệnh Alzheimer [22]. Hơn nữa, uống chè còn kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì; chống viêm; chống sâu răng, hôi miệng và ung thư vòm họng; phòng ngừa ung thư [18], [36]; phòng ngừa bệnh tăng huyết áp [41]; tiểu đường [20] và ngăn ngừa cholesteron tăng cao [17]. Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím [21].
Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè. Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, cải thiện đời sống nhân dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn [11]. Theo đánh giá của Unal (2011) có khoảng 2,5 triệu tấn chè khô được sản xuất mỗi năm, trong đó chè đen chiếm khoảng 78%, chè xanh chiếm 20% và chè Olong chiếm 2% [26]. Thành phần hóa học, đặc biệt hàm lượng polyphenol, chất hòa tan sẽ quyết định đến chất lượng sản phẩm chè [3].
Trong đó, catechins chiếm khoảng 30% thành phần polyphenol ở chè. Catechins được chia thành 2 nhóm: catechins được epimer hóa còn gọi là epicatechin (EGCG, ECG, EGC và EC) và catechins không được epimer hóa (GC và C) [27], [30]. Hiện nay, hoạt tính sinh học và cơ chế tổng hợp 2 polyphenol nói chung và catechins nói riêng ở mức độ phân tử được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu [16], [33], [35]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, leucoanthocyanidin reductase (LAR) là một enzyme đóng một vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp C và GC ở cây chè [29].
Ở nước ta, nhìn chung việc nghiên cứu về thành phần sinh hóa chè, hàm lượng polyphenol, thành phần catechins còn ít được quan tâm, cập nhật. Trong khi các thành phần này thay đổi rất lớn theo giống và chất lượng nguyên liệu. Bên cạnh đó, sự hiểu biết ở mức độ phân tử của các gen mã hóa enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp polyphenol nói riêng, catechins nói chung hầu như chưa được nghiên cứu cấu trúc và chức năng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã leucoanthocyanidin reductase ở cây chè”.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ cây chè trồng tại Thái Nguyên. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU + Khuếch đại gen CsLAR1 mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ cây chè. + Tạo dòng, xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1 thu được. + Thiết kế vector biểu hiện và tạo leucoanthocyanidin reductase tái tổ hợp.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ 1. Nguồn gốc và phân loại của cây chè Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O. Kumtze và thuộc hệ thống phân loại như sau: Ngành: Hạt kín (Angiospermae) Lớp: Song tử diệp (Dicotyledonae) Bộ: Chè (Theaseae) Họ: Chè (Theaceae) Chi: Chè (Camelia hoặc Thea) Loài: Camellia sinensis Cây chè là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao, được trồng ở hơn 58 quốc gia.
Ngày nay, ở Việt Nam hầu hết các tỉnh có điều kiện thuận lợi đều trồng chè, song ba vùng trồng nhiều nhất là [33]: • Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái) chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc. • Vùng trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên). Đây là vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy sản xuất lớn. • Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ yếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô long.
Những công trình nghiên cứu của Đjêmukhatze (1961 - 1976) về phức catechins của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechins giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè và trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc cây chè. Đjêmukhatze kết luận rằng: những cây chè mọc hoang 4 dại, tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin và (-) - epicatechin galat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp (-) epigalo catechin và các galat của nó để tạo thành (+) galocatechin. Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin và (-) - epicatechin galat (chiếm 70% tổng số các loại catechins. Điều này có nghĩa là sự trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình hiđroxin hóa và galin hóa.
Từ những biến đổi sinh hóa này của lá các cây chè mọc hoang dại và cây chè được trồng trọt chăm sóc, cho phép đi tới một kết luận mới “Nguồn gốc của cây chè chính là ở Việt Nam” [45].