Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill, $2n=40$) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây trồng có giá trị kinh tế, dinh dưỡng và đóng vai trò cải thiện độ phì nhiêu của đất. Tuy nhiên, đậu tương là loài mẫn cảm với các yếu tố bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn và mặn. Hai yếu tố này có thể làm suy giảm năng suất từ 40% đến 90% và làm suy giảm chất lượng hạt. Dưới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng khô hạn kéo dài cùng hiện tượng xâm nhập mặn ngày càng gia tăng, việc chọn tạo các giống đậu tương có khả năng chống chịu là yêu cầu cấp thiết đối với sản xuất nông nghiệp.

Đặc tính chống chịu hạn và mặn ở thực vật là tính trạng số lượng do nhiều gen kiểm soát, bao gồm các gen chức năng trực tiếp và các gen điều hòa phiên mã. Phân họ nhân tố phiên mã DREB (Dehydration Responsive Element Binding) thuộc họ lớn AP2/ERF có khả năng liên kết dạng trans với trình tự cis (DRE/CRT) trên vùng promoter của các gen mục tiêu để kích hoạt chuỗi phản ứng chống chịu mà không phụ thuộc vào con đường tín hiệu ABA (Abscisic Acid). Trong hệ gen đậu tương, nhiều thành viên như GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5 đã được nghiên cứu chức năng. Ngược lại, gen GmDREB6 cùng một số thành viên khác trong phân họ DREB vẫn chưa được khảo sát đầy đủ về cấu trúc phát sinh chủng loại cũng như vai trò cụ thể trong cơ chế dung nạp mặn. Vì vậy, việc làm sáng tỏ đặc điểm phân họ gen DREB và phân tích biểu hiện của gen GmDREB6 trên cây mô hình và cây đậu tương chuyển gen là hướng tiếp cận cần thiết để giải quyết khoảng trống này.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Phân tích được đặc điểm của phân họ gen DREB trong hệ gen của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) bằng công cụ Tin sinh học.
  2. Biểu hiện được protein tái tổ hợp GmDREB6 và đánh giá được chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB6 trên cây chuyển gen (Nicotiana tabacum).
  3. Biến nạp được cấu trúc mang gen chuyển GmDREB6 vào đậu tương và tạo được cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 từ giống ĐT22.

Câu hỏi và nội dung nghiên cứu

Luận án triển khai 4 nội dung nghiên cứu chính nhằm trả lời các câu hỏi về cấu trúc, chức năng và khả năng ứng dụng của gen:

  1. Nghiên cứu đặc điểm của phân họ gen DREB ở cây đậu tương bằng Tin sinh học: Khai thác cơ sở dữ liệu NCBI để xác định số lượng, vị trí nhiễm sắc thể, số bản copy của các gen GmDREB, đồng thời thiết lập cây phát sinh chủng loại của phân họ và miền AP2.
  2. Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen GmDREB6 và phân tích biểu hiện trên cây thuốc lá: Thiết kế, tổng hợp nhân tạo trình tự mã hóa GmDREB6, tạo cấu trúc vector biểu hiện thực vật pBI121_GmDREB6 và chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình thông qua Agrobacterium tumefaciens.
  3. Nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen bằng Real-time qRT-PCR: Đánh giá sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 và hai gen đáp ứng stress hạ nguồn (NtP5CS liên quan tổng hợp proline và NtCLC liên quan kênh vận chuyển ion $Cl^-$) dưới điều kiện xử lý mặn ($NaCl$).
  4. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 vào cây đậu tương: Thực hiện lây nhiễm A. tumefaciens vào vùng vết thương mô lá mầm giống đậu tương ĐT22, tái sinh cây và kiểm tra sự hiện diện, mức độ phiên mã của gen GmDREB6 ở thế hệ T0 bằng PCR và RT-PCR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Trình tự gen thuộc phân họ DREB của đậu tương trên cơ sở dữ liệu quốc tế; gen GmDREB6 nhân tạo; cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đóng vai trò sinh vật mô hình; giống đậu tương thuần ĐT22; chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α và Agrobacterium tumefaciens LBA4404; vector nhân dòng và vector biểu hiện thực vật (pBI121).
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học (Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên) phối hợp với Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
  • Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ vào tháng 10 năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu về cơ chế phân tử chống chịu hạn, mặn và vai trò của nhân tố phiên mã DREB:

  • Cơ chế chống chịu mặn và stress phi sinh học: Khi chịu stress mặn, thực vật bị tác động kép bởi hạn sinh lý (mất nước tế bào do áp suất thẩm thấu tăng) và ngộ độc ion tích tụ ($Na^+$, $Cl^-$). Cây phản ứng bằng cách tích lũy các chất thẩm thấu bảo vệ như proline nhờ các enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) và pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR) (Kaya và cs., 2007; Yamada và cs., 2005), đồng thời vận chuyển $Cl^-$ vào không bào thông qua kênh Chloride Channel (CLC) (Li và cs., 2006; Zifarelli và Pusch, 2007).
  • Phát hiện và phân loại DREB ở thực vật: Phân họ DREB thuộc họ AP2/ERF được chia thành 6 phân nhóm từ A-1 đến A-6 (Sakuma và cs., 2002). Miền liên kết DNA AP2 gồm 59-60 amino acid liên kết đặc hiệu với trình tự lõi DRE/CRT (A/GCCGAC) trên promoter của các gen cảm ứng hạn, mặn, nhiệt độ thấp (Dubouzet và cs., 2003; Liu và cs., 1998).
  • Nghiên cứu biểu hiện quá mức gen DREB: Nhiều nghiên cứu đã chuyển gen DREB nhằm cải thiện tính chống chịu trên cây mô hình và cây trồng:
    • Arabidopsis và lúa chuyển gen OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1F làm tăng khả năng chống chịu hạn, mặn, lạnh (Dubouzet và cs., 2003; Wang và cs., 2008; Ito và cs., 2006).
    • Cây chuyển gen AtDREB1A ở thuốc lá, lúa mì, đậu phộng, khoai tây giúp tăng cường khả năng chịu hạn và mặn (Kasuga và cs., 1999; Pellegrineschi và cs., 2004; Bhatnagar-Mathur và cs., 2007; Behnam và cs., 2007).
    • Gen PgDREB2A từ kê ngọc trai chuyển vào thuốc lá làm tăng khả năng dung nạp ion và áp suất thẩm thấu cao (Agarwal và cs., 2007).
    • Gen AhDREB1 từ lạc chuyển vào lúa mì và thuốc lá làm tăng tỷ lệ sống khi xử lý mặn (Shen và cs., 2003).
  • Nghiên cứu họ gen DREB trên cây đậu tương:
    • Kidokoro và cs. (2015) xác định 14 yếu tố phiên mã kiểu DREB1 ở đậu tương.
    • Chen và cs. (2007) và Wang và cs. (2006) phân lập GmDREB2 kích thước 480 bp (mã hóa 159 amino acid) thuộc phân nhóm A-5, chứng minh gen này tăng cường tích lũy proline và khả năng chịu hạn, mặn trên cây chuyển gen.
    • Nhóm nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu và cộng sự tại Việt Nam đã công bố cấu trúc các gen GmDREB1 (2010), GmDREB5 (2011), GmDREB2 (2015), và phân lập đoạn cDNA của GmDREB6 (Lò Thị Mai Thu và cs., 2018) từ giống đậu tương DT2008 dài 693 bp mã hóa 230 amino acid.

Bảng tổng hợp một số nghiên cứu biểu hiện quá mức gen DREB ở thực vật

Dưới đây là dữ liệu tổng hợp từ Bảng 1.1 trong luận án về các nghiên cứu biểu hiện quá mức gen DREB đối với các loại stress:

Gen DREB Cây chuyển gen Phản ứng với / Chịu stress Tài liệu tham khảo
AtDREB1A Arabidopsis Hạn hán Liu và cs. [74]
AtDREB1A Thuốc lá Lạnh và hạn hán Kasuga và cs. [60]
AtDREB1A Lúa mì Hạn hán Pellegrineschi và cs. [99]
AtDREB1A Lúa (Rice) Hạn hán và mặn Oh và cs. [95]
AtDREB1A Khoai tây Mặn Behnam và cs. [21]
AtDREB1A Đậu phộng Hạn hán Bhatnagar-Mathur và cs. [23]
AtCBF1 Cà chua Khô hạn và lạnh Hsieh và cs. [52]
OsDREB1A Arabidopsis Hạn hán, mặn và lạnh Dubouzet và cs. [39]
OsDREB1F Lúa, Arabidopsis Hạn hán, mặn và lạnh Wang và cs. [133]
PgDREB2A Thuốc lá Hyperionic và hyperosmotic Agarwal và cs. [15]
AhDREB1 Lúa mì Hạn hán và mặn Shen và cs. [120]
GhDREB1 Thuốc lá Hạn hán, mặn và lạnh Shan và cs. [118]
PpDBF1 Thuốc lá Hạn hán và mặn Liu và cs. [73]
HvDREB1 Arabidopsis Hạn hán Xu và cs. [137]

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù vai trò của một số gen DREB ở đậu tương đã được ghi nhận, bức tranh toàn diện về các thành viên trong phân họ DREB trên toàn hệ gen Glycine max vẫn cần được phân loại và hệ thống hóa rõ ràng. Đặc biệt, chức năng điều hòa của gen GmDREB6 đối với các con đường sinh tổng hợp chất bảo vệ thẩm thấu (gen P5CS) và cân bằng ion (gen CLC) dưới áp lực stress mặn chưa được kiểm chứng thực nghiệm. Đồng thời, việc ứng dụng GmDREB6 để tạo dòng đậu tương chuyển gen trên nền giống nội địa ĐT22 chưa được thực hiện. Luận án được triển khai nhằm giải quyết trực tiếp các thiếu hụt này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết điều hòa biểu hiện gen ở thực vật bậc cao: các nhân tố phiên mã liên kết đặc hiệu với promoter của nhiều gen chức năng hạ nguồn để kích hoạt phản ứng sinh học thích nghi với môi trường. Khung phân tích gồm 3 bước:

  1. Khảo sát in silico đặc điểm phân họ gen GmDREB (vị trí nhiễm sắc thể, miền chức năng AP2, tiến hóa phát sinh).
  2. Kiểm chứng chức năng sinh học in vivo của GmDREB6 thông qua cây thuốc lá chuyển gen bằng cách đo lường mức độ phiên mã của chính gen chuyển và các gen chỉ thị đáp ứng mặn (NtP5CS, NtCLC).
  3. Biến nạp gen vào giống đậu tương mục tiêu ĐT22 qua Agrobacterium tumefaciens và kiểm tra sự tích hợp phân tử ở thế hệ T0.

Phương pháp nghiên cứu cụ thể

Luận án kết hợp các phương pháp tin sinh học và sinh học phân tử thực nghiệm:

  • Phương pháp Tin sinh học:

    • Khai thác dữ liệu trình tự nucleotide và amino acid của phân họ DREB ở đậu tương từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
    • So sánh, căn chỉnh trình tự bằng công cụ BLAST và ClustalW.
    • Xây dựng cây phát sinh chủng loại của phân họ gen GmDREB và miền AP2 bằng phần mềm MEGA X, sử dụng phương pháp Maximum Likelihood (ML) kết hợp mô hình ma trận JTT (Jones-Taylor-Thornton), đánh giá độ tin cậy bằng kiểm định bootstrap với 1000 lần lặp.

  • Phương pháp kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử:

    • Thiết kế và nhân dòng gen: Trình tự gen GmDREB6 được tối ưu và tổng hợp nhân tạo, sau đó đưa vào vector trung gian pUC18/pPU18. Cắt và nối gen GmDREB6 vào vùng cắt đa vị (MCS) của vector biểu hiện pBI121 thay thế cho gen chỉ thị GUS bằng cặp enzyme cắt giới hạn SacI và XbaI, đặt dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S và kết thúc phiên mã bởi nos-terminator.
    • Biến nạp vi khuẩn: Chuyển vector tái tổ hợp pBI121_GmDREB6 vào tế bào khả biến E. coli DH5α và A. tumefaciens LBA4404 bằng phương pháp sốc nhiệt hoặc biến nạp xung điện; kiểm tra khuẩn lạc bằng Colony-PCR.
    • Chuyển gen vào mô lá thuốc lá: Biến nạp đĩa lá thuốc lá in vitro qua A. tumefaciens, chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường MS bổ sung kháng sinh Kanamycin và Cefotaxime, tái sinh chồi và ra rễ.
    • Phân tích phân tử trên thuốc lá T0: Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR kiểm tra gen chuyển GmDREB6, lai Southern blot để xác định sự hợp nhất của gen vào hệ gen vật chủ, tách chiết RNA tổng số và thực hiện RT-PCR kiểm tra sự phiên mã.
    • Xử lý mặn và Real-time qRT-PCR: Cây thuốc lá chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen (WT) được xử lý mặn bằng dung dịch $NaCl$ trong điều kiện in vitro. Mức độ biểu hiện của các gen GmDREB6, NtP5CS, và NtCLC được phân tích định lượng bằng phản ứng Real-time qRT-PCR với chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green, sử dụng gen Actin làm gen tham chiếu nội chuẩn.
    • Chuyển gen vào cây đậu tương ĐT22: Hạt đậu tương ĐT22 được khử trùng và cho nảy mầm trên môi trường nảy mầm (GM). Cắt bỏ trụ dưới lá mầm tạo tổn thương tại điểm sinh trưởng, tiến hành lây nhiễm với dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang cấu trúc pBI121_GmDREB6. Nuôi cấy mô trên các môi trường: đồng nuôi cấy (CCM), cảm ứng tạo đa chồi (SIM), kéo dài chồi (SEM) và tạo rễ (RM) có bổ sung chất chọn lọc Kanamycin.
    • Phân tích phân tử cây đậu tương T0: Tách chiết DNA/RNA từ lá cây đậu tương tái sinh, phân tích PCR nhân bản cấu trúc chuyển gen và phân tích RT-PCR kiểm tra sự biểu hiện của mRNA gen GmDREB6.

  • Phương pháp xử lý dữ liệu:

    • Xử lý số liệu chu kỳ ngưỡng ($Ct$) từ Real-time qRT-PCR theo phương pháp so sánh $2^{-\Delta\Delta Ct}$.
    • Phân tích thống kê và kiểm định sai khác bằng ANOVA với mức ý nghĩa $P < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp hệ thống cơ sở lý luận và các dữ liệu đã công bố về cây đậu tương, cơ chế chịu hạn mặn, nhân tố phiên mã DREB và kỹ thuật chuyển gen:

  1. Cây đậu tương và đặc tính chịu hạn, mặn: Trình bày đặc điểm hình thái học, phân loại học (Glycine max thuộc phân chi Soja, $2n=40$), các giai đoạn sinh trưởng, vai trò của nốt sần rễ (Rhizobium japonicum). Phân tích chi tiết tác động của stress hạn và stress mặn lên sinh lý thực vật: sự đóng khí khổng, mất cân bằng ion ($Na^+/K^+$), phá hủy màng tế bào bởi các gốc oxy hóa tự do (ROS), và vai trò của các chất thẩm thấu (proline, glycine betaine) cùng các protein vận chuyển ion ($CLC$, $NHX$).
  2. Nhân tố phiên mã DREB ở thực vật và cây đậu tương: Mô tả cấu trúc miền AP2 (59-60 amino acid) có cấu trúc không gian dạng tấm $\beta$ và đoạn xoắn $\alpha$, liên kết đặc hiệu với hộp DRE (A/GCCGAC). Hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu biểu hiện các nhóm DREB1 và DREB2 dưới tác động của stress nhiệt độ, hạn, mặn và hormone ABA. Nêu rõ các phát hiện về gen GmDREB1 (NST 9 và 14), GmDREB2 (NST 6), và GmDREB6 (NST 5/15) ở đậu tương.
  3. Kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện tính chống chịu của đậu tương: Điểm lại các hệ thống chuyển gen thông qua A. tumefaciens, các loại vector biểu hiện thực vật và thành công bước đầu trong việc chuyển các gen chức năng và gen điều hòa vào đậu tương nhằm tăng khả năng dung nạp các điều kiện bất lợi.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục vật liệu, thiết bị, quy trình hóa chất và các công thức môi trường nuôi cấy mô:

  • Vật liệu sinh học: Cây thuốc lá (N. tabacum), giống đậu tương thuần ĐT22; chủng E. coli DH5α, A. tumefaciens LBA4404; plasmid pUC18 và pBI121.
  • Hệ thống môi trường nuôi cấy:
    • Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB lỏng và LB thạch bổ sung Kanamycin, Rifampicin.
    • Môi trường tái sinh cây thuốc lá: Môi trường MS có bổ sung phytohormone BAP, NAA và chất chọn lọc.
    • Hệ thống môi trường biến nạp đậu tương ĐT22: Môi trường nảy mầm (GM), môi trường đồng nuôi cấy (CCM bổ sung Acetosyringone - AS), môi trường cảm ứng chồi (SIM bổ sung BAP), môi trường kéo dài chồi (SEM) và môi trường ra rễ (RM bổ sung IBA).
  • Quy trình phân tích phân tử: Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR, RT-PCR, Real-time qRT-PCR đối với các gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC và gen nội chuẩn Actin. Các thông số chu nhiệt, thành phần phản ứng enzyme Taq DNA polymerase và quy trình Real-time qRT-PCR được chuẩn hóa chi tiết.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua 4 phần nội dung chính:

1. Đặc điểm và sự phát sinh của phân họ gen DREB ở cây đậu tương

Bằng công cụ tin sinh học, luận án đã xác định được 18 gen thuộc phân họ DREB trong hệ gen cây đậu tương (Glycine max), phân bố rải rác trên 17 nhiễm sắc thể khác nhau:

  • Gen GmDREB6 có số lượng bản copy cao nhất trong hệ gen với 8 bản copy. Các gen GmDREB còn lại có số bản copy dao động từ 1 đến 4 bản copy.
  • Phân tích cấu trúc miền AP2 cho thấy miền này có chiều dài phổ biến 59-60 amino acid. Tất cả 18 protein GmDREB đều chứa motif bảo thủ: PTPEMAARAYDVAALALKGPSARLNFPEL.
  • Miền AP2 chứa 11 vị trí amino acid liên kết trực tiếp với vùng promoter của các gen chức năng, có trình tự đồng thuận phổ biến là RGRRWKERRWT.
  • Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự nucleotide và amino acid miền AP2 bằng thuật toán Maximum Likelihood (MEGA X) thể hiện rõ quan hệ tiến hóa và sự phân nhóm chức năng của các thành viên GmDREB.

2. Thiết kế vector chuyển gen GmDREB6 và biểu hiện trên cây thuốc lá

  • Trình tự gen GmDREB6 nhân tạo được tạo dòng thành công vào vector biểu hiện thực vật pBI121 thông qua hai vị trí cắt SacI và XbaI, tạo nên cấu trúc pBI121_GmDREB6 dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S.
  • Biến nạp cấu trúc vào mô lá cây thuốc lá mô hình thông qua A. tumefaciens LBA4404. Phân tích Colony-PCR, PCR trên cây thế hệ T0 đã khuếch đại phân đoạn gen đích. Phân tích Southern blot xác nhận sự tích hợp ổn định của gen chuyển vào hệ gen cây thuốc lá, và RT-PCR xác nhận gen chuyển được phiên mã thành mRNA.

3. Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng Real-time qRT-PCR

Thực nghiệm xử lý mặn ($NaCl$) trên các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 và cây đối chứng không chuyển gen (WT) cho thấy:

  • Cây chuyển gen có khả năng sinh trưởng, giữ màu xanh và phát triển rễ tốt hơn cây WT trong điều kiện stress mặn sau 3 tuần nuôi cấy.
  • Định lượng Real-time qRT-PCR chứng minh mức độ biểu hiện vượt trội của gen chuyển và các gen hạ nguồn đáp ứng stress mặn:
Chỉ số / Gen phân tích Đối tượng cây Mức độ phiên mã so với đối chứng không xử lý mặn / WT ($P < 0,05$)
Gen GmDREB6 Các dòng thuốc lá chuyển gen Tăng 2,40 đến 3,22 lần so với điều kiện không xử lý mặn
Gen NtP5CS Các dòng thuốc lá chuyển gen Tăng 1,24 đến 3,60 lần so với cây đối chứng WT
Gen NtCLC Các dòng thuốc lá chuyển gen Tăng 3,65 đến 4,54 lần so với cây đối chứng WT

Sự gia tăng phiên mã của NtP5CS (thúc đẩy tích lũy proline duy trì áp suất thẩm thấu) và NtCLC (kênh vận chuyển ion $Cl^-$ vào không bào) chứng minh thực nghiệm rằng nhân tố phiên mã GmDREB6 kích hoạt các con đường sinh lý giúp bảo vệ tế bào thực vật trước áp lực mặn.

4. Biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 vào giống đậu tương ĐT22

  • Luận án đã thiết lập quy trình biến nạp thông qua A. tumefaciens lây nhiễm vùng tổn thương mô lá mầm hạt đậu tương ĐT22 nảy mầm in vitro.
  • Qua các giai đoạn đồng nuôi cấy, cảm ứng tạo đa chồi, kéo dài chồi và tạo rễ trên môi trường chọn lọc Kanamycin, các cây đậu tương chuyển gen T0 đã được tái sinh hoàn chỉnh.
  • Kết quả kiểm tra phân tử:
    • Phân tích PCR xác định được 8 cây đậu tương T0 dương tính, mang cấu trúc chuyển gen GmDREB6.
    • Phân tích RT-PCR xác định được 5 cây đậu tương T0 có sự phiên mã rõ ràng của gen chuyển GmDREB6.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về lý luận và cơ sở dữ liệu:
    • Xác định được toàn diện 18 gen GmDREB thuộc phân họ DREB trong hệ gen cây đậu tương (Glycine max) nằm trên 17 nhiễm sắc thể; phát hiện gen GmDREB6 có 8 bản copy trong hệ gen, trong khi các gen còn lại có từ 1-4 bản copy.
    • Làm rõ cấu trúc miền AP2 bảo thủ gồm 59-60 amino acid, xác định motif đặc trưng PTPEMAARAYDVAALALKGPSARLNFPEL có mặt ở tất cả các protein DREB của đậu tương, cùng 11 vị trí liên kết promoter mang trình tự đồng thuận RGRRWKERRWT.
  2. Về thực nghiệm và chức năng sinh học:
    • Đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng sự biểu hiện của gen GmDREB6 từ đậu tương làm tăng cường mức độ phiên mã của hai gen chức năng quan trọng là NtP5CS (tăng 1,24 - 3,60 lần) và NtCLC (tăng 3,65 - 4,54 lần) ở cây mô hình chuyển gen khi chịu stress mặn ($P < 0,05$). Kết quả này khẳng định vai trò của GmDREB6 trong việc kích hoạt đồng thời con đường điều hòa thẩm thấu và cơ chế vận chuyển ion chống chịu mặn.
  3. Về công nghệ và tạo dòng chuyển gen:
    • Thiết kế thành công vector chuyển gen thực vật pBI121_GmDREB6 mang gen GmDREB6 dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S.
    • Biến nạp thành công cấu trúc mang gen GmDREB6 vào giống đậu tương thuần ĐT22 của Việt Nam qua A. tumefaciens, thu được 8 dòng cây T0 dương tính với PCR và 5 dòng cây T0 khẳng định có sự phiên mã của gen chuyển qua RT-PCR.

Kiến nghị và đề xuất

  • Tiếp tục theo dõi, đánh giá sự di truyền và mức độ biểu hiện của gen chuyển GmDREB6 ở các thế hệ sau (T1, T2) của các dòng đậu tương ĐT22 chuyển gen.
  • Khảo sát khả năng chống chịu mặn và các chỉ tiêu nông sinh học, năng suất của các dòng đậu tương chuyển gen trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng có xử lý mặn thực tế.
  • Ứng dụng vector pBI121_GmDREB6 để chuyển gen vào các giống đậu tương khác hoặc các đối tượng cây trồng mẫn cảm với mặn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các đánh giá chức năng của gen GmDREB6 đối với hệ thống gen hạ nguồn (P5CS, CLC) mới chỉ được thực hiện chi tiết trên đối tượng cây mô hình thuốc lá (Nicotiana tabacum), chưa hoàn tất định lượng mức độ biểu hiện gen hạ nguồn tương ứng trên cây đậu tương.
  • Kết quả trên cây đậu tương ĐT22 mới dừng lại ở thế hệ T0 (xác nhận sự có mặt và phiên mã của gen chuyển ở 8 cây PCR dương tính và 5 cây RT-PCR dương tính), chưa có số liệu đánh giá kiểu hình chịu mặn định lượng ở các thế hệ phân ly tiếp theo.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Nhân giống các dòng đậu tương chuyển gen T0 để thu hạt thế hệ T1, T2; phân tích Southern blot xác định số vị trí tích hợp gen và phân tích Western blot đánh giá mức độ biểu hiện protein GmDREB6 ở đậu tương.
  • Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý (hàm lượng proline tích lũy, hàm lượng chlorophyll, tỷ lệ rò rỉ chất điện giải, nồng độ tích tụ ion $Na^+/K^+$) ở cây đậu tương chuyển gen khi xử lý các dải nồng độ muối $NaCl$ khác nhau.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Di truyền học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học: Luận án cung cấp quy trình phương pháp luận chuẩn xác từ phân tích tin sinh học hệ gen (MEGA X, mô hình JTT, Maximum Likelihood), kỹ thuật tạo dòng trên vector pBI121, đến các bước đánh giá biểu hiện gen bằng Real-time qRT-PCR chuẩn hóa.
  • Đối với giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Tài liệu là nguồn tham khảo chi tiết về hệ thống phân họ nhân tố phiên mã DREB/AP2 ở thực vật họ Đậu, mối liên hệ giữa con đường truyền tín hiệu không phụ thuộc ABA với các gen tổng hợp proline (P5CS) và kênh vận chuyển ion (CLC).
  • Đối với các nhà chọn tạo giống cây trồng: Các thông số kỹ thuật về môi trường nuôi cấy mô (GM, CCM, SIM, SEM, RM) và quy trình lây nhiễm A. tumefaciens trên mô lá mầm giống đậu tương ĐT22 là quy trình thực nghiệm có thể áp dụng trực tiếp trong công tác tạo giống đậu tương chuyển gen kháng stress phi sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Phân họ gen DREB ở cây đậu tương có bao nhiêu thành viên và phân bố như thế nào trong hệ gen?

Theo kết quả phân tích tin sinh học của luận án, phân họ gen DREB ở cây đậu tương (Glycine max) gồm 18 gen phân bố trên 17 nhiễm sắc thể. Trong đó, gen GmDREB6 có số lượng bản copy lớn nhất (8 bản copy), các gen còn lại có từ 1 đến 4 bản copy.

2. Miền AP2 của các protein GmDREB ở đậu tương có đặc điểm cấu trúc bảo thủ nào?

Miền AP2 của 18 protein GmDREB có chiều dài phổ biến từ 59 đến 60 amino acid. Tất cả các protein đều chứa đoạn motif bảo thủ hoàn toàn là PTPEMAARAYDVAALALKGPSARLNFPEL và chứa 11 vị trí amino acid liên kết trực tiếp với promoter của gen mục tiêu mang trình tự đồng thuận là RGRRWKERRWT.

3. Biểu hiện của gen GmDREB6 ảnh hưởng như thế nào đến các gen NtP5CS và NtCLC ở cây thuốc lá chuyển gen dưới stress mặn?

Dưới điều kiện stress mặn ($NaCl$), mức phiên mã của gen chuyển GmDREB6 ở các dòng thuốc lá chuyển gen tăng từ 2,40 đến 3,22 lần so với điều kiện không xử lý mặn. Đồng thời, sự biểu hiện của gen này kích hoạt làm tăng mức phiên mã của gen NtP5CS lên 1,24 đến 3,60 lần và gen NtCLC lên 3,65 đến 4,54 lần so với cây đối chứng không chuyển gen WT ($P < 0,05$).

4. Kết quả chuyển gen GmDREB6 vào giống đậu tương ĐT22 ở thế hệ T0 đạt được cụ thể những gì?

Thông qua phương pháp lây nhiễm A. tumefaciens vào vùng mô lá mầm hạt nảy mầm, luận án đã tái sinh và thu được 8 cây đậu tương chuyển gen T0 dương tính với phản ứng PCR (mang cấu trúc gen chuyển) và 5 cây T0 dương tính với phản ứng RT-PCR (xác nhận gen chuyển GmDREB6 được phiên mã).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Phutthakone Vaciaxa đã xác định toàn diện đặc điểm phân họ gồm 18 gen GmDREB trên 17 nhiễm sắc thể của cây đậu tương, làm rõ các motif bảo thủ và 11 vị trí liên kết DNA của miền AP2. Nghiên cứu đã chứng minh bằng thực nghiệm trên cây mô hình thuốc lá rằng sự biểu hiện của gen GmDREB6 kích hoạt làm tăng mức độ phiên mã của các gen tham gia tổng hợp proline (NtP5CS) và kênh vận chuyển ion (NtCLC) dưới điều kiện stress mặn. Đồng thời, đề tài đã thiết kế thành công vector biểu hiện thực vật pBI121_GmDREB6 và tạo được các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 từ giống ĐT22 có sự tích hợp và phiên mã ổn định của gen đích, đóng góp dữ liệu khoa học và vật liệu phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng chịu bất lợi phi sinh học.