Tổng quan nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max) là cây trồng quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp Việt Nam và thế giới, cung cấp nguồn protein và nguyên liệu công nghiệp thiết yếu. Tuy nhiên, đậu tương rất nhạy cảm với các yếu tố bất lợi như hạn hán, mặn, nhiệt độ cao, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng. Theo ước tính, năng suất đậu tương có thể giảm từ 32-44% khi gặp hạn ở giai đoạn kết hạt. Do đó, việc nâng cao khả năng chống chịu các stress phi sinh học là mục tiêu cấp thiết trong nghiên cứu và phát triển giống đậu tương.

Luận văn tập trung nghiên cứu biến nạp gen GmDREB7A, một nhân tố phiên mã thuộc phân họ DREB có vai trò điều hòa biểu hiện gen đáp ứng stress phi sinh học, vào giống đậu tương ĐT12. Mục tiêu chính là thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7A, chuyển gen thành công vào mô lá mầm đậu tương, tạo cây chuyển gen T0 và chọn lọc in vitro. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 6/2021 đến tháng 4/2022 tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, với phạm vi tập trung vào giống đậu tương ĐT12, một giống có thời gian sinh trưởng từ 75-110 ngày, năng suất trung bình 14-23 tạ/ha.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc làm sáng tỏ chức năng gen GmDREB7A và thực tiễn trong phát triển giống đậu tương chịu hạn, mặn. Việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen Agrobacterium tumefaciens giúp tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chống chịu stress phi sinh học được cải thiện, góp phần nâng cao năng suất và ổn định sản xuất.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: (1) Lý thuyết về nhân tố phiên mã DREB (Dehydration Responsive Element Binding protein) thuộc họ AP2/ERF, có khả năng liên kết với trình tự cis trong promoter của các gen chức năng, kích hoạt biểu hiện gen đáp ứng stress phi sinh học như hạn, mặn, lạnh; (2) Mô hình chuyển gen thực vật qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng vector tái tổ hợp để đưa gen mục tiêu vào bộ gen cây chủ.

Ba khái niệm chuyên ngành quan trọng gồm:

  • Gen GmDREB7A: mã hóa protein nhân tố phiên mã DREB7A, gồm 624 nucleotide mã hóa 207 amino acid, có miền AP2 chứa 59 amino acid với 11 vị trí liên kết DNA.
  • Vector chuyển gen pZY_GmDREB7A: vector biểu hiện gen thực vật được thiết kế từ vector pZY102, chứa gen GmDREB7A dưới promoter CaMV35S và gen kháng phosphinothricin.
  • Chọn lọc in vitro: sử dụng thuốc diệt cỏ phosphinothricin (bastar) để chọn lọc các dòng mô chuyển gen trong môi trường nuôi cấy mô.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là giống đậu tương ĐT12, vector pBI121_GmDREB7A, vector pZY102 và chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens AGL1. Các cặp mồi PCR đặc hiệu được sử dụng để xác định sự có mặt của gen chuyển.

Phương pháp phân tích bao gồm:

  • Thiết kế vector pZY_GmDREB7A bằng cắt nối enzym HindIII và EcoRI, xác nhận bằng colony-PCR và giải trình tự nucleotide.
  • Biến nạp vector vào vi khuẩn E. coli DH5α để nhân dòng, sau đó chuyển vào A. tumefaciens AGL1.
  • Biến nạp gen vào mô lá mầm đậu tương ĐT12 qua phương pháp lây nhiễm A. tumefaciens, đồng nuôi cấy trong môi trường CCM đặc, chọn lọc chồi trên môi trường SIM có bổ sung phosphinothricin.
  • Tái sinh cây chuyển gen in vitro qua các giai đoạn tạo chồi, kéo dài chồi, tạo rễ và chuyển cây ra giá thể trong nhà lưới.
  • Xác định sự có mặt của gen GmDREB7A trong cây chuyển gen bằng PCR.

Cỡ mẫu gồm 300 mẫu mô lá mầm biến nạp, thực hiện 4 lần lặp với 2 lô đối chứng. Phân tích số liệu bằng thống kê mô tả, tỷ lệ thành công chuyển gen được tính toán.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Thiết kế vector pZY_GmDREB7A thành công: Đã thu được đoạn gen GmDREB7A kích thước 1,8 kb, ghép nối vào vector pZY102 (8,9 kb) tạo vector pZY_GmDREB7A. Colony-PCR và giải trình tự nucleotide xác nhận cấu trúc vector đúng thiết kế. Chủng A. tumefaciens mang vector pZY_GmDREB7A được tạo thành công, xác định gen chuyển bằng colony-PCR thu được sản phẩm 0,69 kb đúng kích thước.

  2. Hiệu quả biến nạp gen vào mô lá mầm đậu tương ĐT12: Trong 300 mẫu biến nạp, có 245 mẫu tạo đa chồi (81,7%), thu được 633 chồi (trung bình 2,58 chồi/mẫu). Sau chọn lọc trên môi trường SIM2 có phosphinothricin, còn 419 chồi sống sót (66,2%). Qua các giai đoạn kéo dài chồi, tạo rễ và chuyển cây ra giá thể, thu được 51 cây biến nạp (17%) và 7 cây sống sót trên giá thể (2,33%).

  3. Tỷ lệ thành công chuyển gen: Tỷ lệ cây chuyển gen sống sót trên giá thể đạt 2,33%, trong khi lô đối chứng không có mẫu tạo chồi trên môi trường có kháng sinh. Kết quả này cho thấy hiệu quả chọn lọc và biến nạp gen rõ rệt.

  4. Xác định gen chuyển bằng PCR: Các cây chuyển gen T0 được xác nhận có gen GmDREB7A bằng PCR, khẳng định thành công quá trình biến nạp và tái sinh cây chuyển gen.

Thảo luận kết quả

Kết quả thiết kế vector và chuyển gen cho thấy kỹ thuật chuyển gen qua A. tumefaciens là phương pháp hiệu quả để đưa gen GmDREB7A vào giống đậu tương ĐT12. Tỷ lệ tạo chồi và cây chuyển gen tương đối cao so với các nghiên cứu trước đây sử dụng kháng sinh kanamycin, cho thấy phosphinothricin là chất chọn lọc phù hợp, giảm độc tính và tăng hiệu quả chọn lọc.

So sánh với các nghiên cứu trước, tỷ lệ cây chuyển gen sống sót đạt khoảng 2-3% là phù hợp với mức độ thành công của kỹ thuật chuyển gen đậu tương hiện nay. Việc xác định gen chuyển bằng PCR giúp đảm bảo tính chính xác của kết quả.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện số lượng mẫu tạo chồi, chồi sống sót, cây tạo rễ và cây sống sót trên giá thể, giúp minh họa hiệu quả từng giai đoạn. Bảng tổng hợp kết quả chuyển gen và đối chứng cũng làm rõ sự khác biệt về hiệu quả biến nạp.

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng tiếp cận mới trong việc ứng dụng gen GmDREB7A để nâng cao khả năng chống chịu hạn, mặn cho đậu tương, góp phần phát triển giống cây trồng bền vững trong điều kiện biến đổi khí hậu.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tiếp tục phân tích chức năng gen GmDREB7A: Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như RT-PCR, qPCR để đánh giá biểu hiện gen trong các dòng chuyển gen T0, T1 nhằm làm rõ vai trò của GmDREB7A trong phản ứng stress phi sinh học.

  2. Phát triển các dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chịu hạn, mặn: Sử dụng các dòng cây chuyển gen đã tạo làm nguyên liệu chọn giống, tiến hành đánh giá tính trạng sinh trưởng, năng suất và khả năng chống chịu stress trong điều kiện thực địa.

  3. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen và chọn lọc: Nghiên cứu điều chỉnh nồng độ thuốc diệt cỏ phosphinothricin và thời gian chọn lọc để nâng cao tỷ lệ thành công và giảm thiểu tổn thương mô.

  4. Mở rộng nghiên cứu sang các giống đậu tương khác: Áp dụng kỹ thuật chuyển gen GmDREB7A vào các giống đậu tương phổ biến khác nhằm đa dạng hóa nguồn gen chống chịu và tăng cường khả năng thích nghi.

  5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật chuyển gen và nuôi cấy mô cho cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên tại các trung tâm nghiên cứu, góp phần phát triển công nghệ sinh học nông nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu di truyền học và công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu về chức năng gen, kỹ thuật chuyển gen và phát triển giống cây trồng chịu stress có thể ứng dụng kết quả và phương pháp trong luận văn.

  2. Chuyên gia chọn giống và phát triển cây trồng: Tham khảo quy trình tạo dòng chuyển gen và đánh giá hiệu quả để áp dụng trong chương trình chọn giống đậu tương chịu hạn, mặn.

  3. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học, nông nghiệp: Học tập kỹ thuật chuyển gen, nuôi cấy mô và phân tích gen, đồng thời hiểu rõ cơ sở lý thuyết và thực tiễn trong nghiên cứu gen chống chịu stress.

  4. Cơ quan quản lý và doanh nghiệp nông nghiệp: Đánh giá tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học trong phát triển giống cây trồng bền vững, hỗ trợ chính sách và đầu tư nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Gen GmDREB7A có vai trò gì trong cây đậu tương?
    Gen GmDREB7A mã hóa nhân tố phiên mã DREB7A, điều hòa biểu hiện các gen chức năng liên quan đến khả năng chống chịu stress phi sinh học như hạn và mặn, giúp cây thích nghi tốt hơn với điều kiện bất lợi.

  2. Tại sao chọn giống đậu tương ĐT12 cho nghiên cứu?
    ĐT12 là giống có thời gian sinh trưởng phù hợp, năng suất trung bình cao và khả năng chống chịu tương đối, thuận lợi cho nghiên cứu chuyển gen và ứng dụng trong sản xuất.

  3. Phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium có ưu điểm gì?
    Phương pháp này đơn giản, chi phí thấp, số bản sao gen chuyển thấp, ít gây đột biến và được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật, đặc biệt là đậu tương.

  4. Tại sao sử dụng phosphinothricin làm chất chọn lọc thay vì kháng sinh?
    Phosphinothricin ít độc hại hơn, hiệu quả chọn lọc cao, giúp loại bỏ mô không chuyển gen nhanh chóng, đồng thời phù hợp với quy trình tái sinh cây đậu tương.

  5. Làm thế nào xác định cây chuyển gen thành công?
    Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen GmDREB7A trong DNA tổng số của cây, kết hợp đánh giá khả năng sống sót trên môi trường có thuốc chọn lọc.

Kết luận

  • Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pZY_GmDREB7A chứa gen GmDREB7A và gen kháng phosphinothricin, tạo chủng A. tumefaciens mang vector này.
  • Biến nạp gen GmDREB7A vào mô lá mầm giống đậu tương ĐT12 qua A. tumefaciens đạt hiệu quả cao với 81,7% mẫu tạo đa chồi và 2,33% cây sống sót trên giá thể.
  • Các cây chuyển gen T0 được xác nhận có gen GmDREB7A bằng PCR, tạo nền tảng cho nghiên cứu chức năng gen và phát triển giống đậu tương chịu stress.
  • Kỹ thuật chọn lọc sử dụng phosphinothricin hiệu quả, phù hợp với quy trình tái sinh cây chuyển gen đậu tương.
  • Đề xuất tiếp tục phân tích chức năng gen, phát triển dòng chuyển gen và mở rộng ứng dụng trong chọn giống đậu tương chịu hạn, mặn.

Hành động tiếp theo: Tiến hành đánh giá biểu hiện gen và khả năng chống chịu stress của các dòng chuyển gen T1, đồng thời triển khai nghiên cứu ứng dụng trong điều kiện thực địa để phát triển giống đậu tương bền vững.