Đặt vấn đề Đậu tƣơng [Glycine max (L.) Merill] là cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới. Hạt đậu tƣơng có thể đƣợc dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con ngƣời và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp. Đậu tƣơng là loại cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế và là loại cây trồng cải tạo đất. Đậu tƣơng rất nhạy cảm với các yếu tố bất lợi và thuộc nhóm cây chống chịu kém.
Đặc tính chống chịu các yếu tố phi sinh học của cây đậu tƣơng do nhiều gen quy định và sản ph m của mỗi gen có thể liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây hoặc có vai trò điều hòa các gen chức năng. Một số gen của đậu tƣơng đã đƣợc mô tả là có phản ứng với các stress phi sinh học ở mức phiên mã, trong đó có nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB (Dehydration responsive element binding protein). Các nhân tố phiên mã DREB thuộc họ AP2/ ERF (APETALA2 / Ethylene-Responsive) của thực vật, có khả năng kích hoạt quá trình phiên mã của các gen phản ứng stress phi sinh học nhƣ hạn, muối, lạnh, nóng…khi có tín hiệu từ môi trƣờng. Các protein DREB chứa miền AP2 phổ biến có khoảng 58-59 amino acid và gồm một số amino acid liên quan đến yếu tố phản ứng khử nƣớc DRE (dehydration responsive element) hoặc hộp GCC.
Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng các stress phi sinh học. Nhân tố phiên mã DREB- yếu tố có tác động trans liên kết với trình tự cis của promoter và kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress. DREB là nhân tố phiên mã hứa hẹn nhiều ứng dụng trong việc cải thiện tính kháng phi sinh học của thực vật. Đến nay, một số gen GmDREB (Glycine max DREB) đã đƣợc xác định có trong hệ gen đậu tƣơng, nhƣ GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, 1 GmDREB5, GmDREB6.
Một số gen GmDREB đã đƣợc tách dòng phân tử, phân tích biểu hiện và các sản ph m dịch mã của các gen GmDREB này đƣợc khẳng định có chức năng chịu hạn và chịu mặn, trong khi đó chức năng một số gen GmDREB khác còn chƣa đƣợc đề cập đến. Vì vậy, lựa chọn gen GmDREB7A và cách tiếp cận làm sáng tỏ chức năng của nó đối với tính kháng các stress phi sinh học là vấn đề đặt ra cho nghiên cứu này. Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu đƣợc ứng dụng ngày càng rộng và nhiều gen mới trong hệ gen của cây đậu tƣơng đã đƣợc giải mã chức năng. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biến nạp gen GmDREB7A vào giống đậu tương ĐT12”.
Nghiên cứu này nhằm tạo nguyên liệu cho phân tích di truyền phân tử phục vụ phát hiện chức năng của gen GmDREB7A của cây đậu tƣơng và tạo các dòng đậu tƣơng chuyển gen có khả năng chống chịu các stress phi sinh học đƣợc cải thiện. Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp và tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen GmDREB7A ở giai đoạn chọn lọc in vitro và ở thế hệ T0 trong điều kiện nhà lƣới. Nội dung nghiên cứu 3. Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB7A.
Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB7A vào đậu tƣơng qua nách lá mầm nhờ Agrobacterium. Chọn lọc in vitro và tạo các cây đậu tƣơng chuyển gen T0. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả nghiên cứu biến nạp gen GmDREB7A vào giống đậu tƣơng ĐT12 có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu chức năng gen 2 và nâng cao khả năng chống chịu các stress của cây đậu tƣơng bằng kỹ thuật chuyển gen. Dựa trên những thông tin về gen DREB7 (RNA) giả định trên GenBank, gen GmDREB7A đã đƣợc thiết kế và tổng hợp phục vụ thiết kế vector biểu hiện gen.
Vector biểu hiện gen pZY-GmDREB7A đƣợc biến nạp vào mô lá mầm đậu tƣơng, tái sinh tạo cây đậu tƣơng in vitro trong môi trƣờng chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ basta. Về thực tiễn, cấu trúc vector chuyển gen pZY-GmDREB7A đã đƣợc thiết kế thành công và có thể sử dụng biến nạp di truyền vào đậu tƣơng trong mục đích tăng cƣờng khả năng chịu hạn của cây chuyển gen. Đồng thời, những kết quả bƣớc đầu tạo các cây chuyển gen GmDREB7A T0 phục vụ cho nghiên cứu chức năng gen và tạo dòng đậu tƣơng chuyển gen có khả năng chống chịu các stress phi sinh học. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
CÂY ĐẬU TƢƠNG Đặc điểm sinh học, giá trị kinh tế và dinh dƣỡng của cây đậu tƣơng Đậu tƣơng có tên khoa học Glycine max (L. Đậu tƣơng thuộc loại cây hai lá mầm, thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt, bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tƣơng thuộc loại rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ bên, xung quanh có nhiều nốt sần dài khoảng 1cm, đƣờng kính 5-6 mm và chứa vi khu n Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm từ nitơ của không khí. Thân cây tròn, mang từ 8 - 14 đốt, trên thân có nhiều lông nhỏ, có 1 - 2 cành hoặc không có cành, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân.
Cây đậu tƣơng có 3 loại lá chính: Lá mầm, cặp lá đơn, lá kép có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét. Đậu tƣơng là loại cây tự thụ phấn, hoa đƣợc phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân, hoa lƣỡng tính và có màu tím hay trắng. Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tùy 3 thuộc vào giống và thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hƣởng phối hợp của ánh sang và nhiệt độ. Hoa đậu tƣơng nhỏ, mọc thành từng chùm, mỗi chùm thƣờng có 3 – 5 hoa.
Quả đậu tƣơng là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thƣờng có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen. Hạt đậu tƣơng có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt; vỏ hạt thƣờng nhẵn và đa dạng về màu sắc khi chín nhƣ vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen [2]. Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn thu hạt và thuộc nhóm cây hàng năm. Dựa vào thời sinh trƣởng của đậu tƣơng có thể chia làm 3 nhóm: nhóm ngắn ngày thời gian sinh trƣởng từ 75-80 ngày, nhóm trung ngày thời gian sinh trƣởng 85-95 ngày, nhóm dài ngày thời gian sinh trƣởng từ 100 -120 ngày.
Nhu cầu nƣớc của cây đậu tƣơng không đồng đều qua các giai đoạn, độ m của đất trung bình là 50- 60 %, giai đoạn ra hoa, hình thành quả khoảng 70 % - 80 %. Vì vậy, đậu tƣơng đƣợc xếp vào nhóm cây trồng có nhu cầu cao về 4 nƣớc và trong các loài cây họ đậu, đậu tƣơng đƣợc xem là cây trồng chịu hạn nhạy cảm nhất [9]. Tổng sản ph m quang hợp của cây sẽ giảm nếu bị thiếu nƣớc. Thiếu nƣớc trầm trọng sẽ ảnh hƣởng tới sự hình thành diệp lục dị hình, giảm sự vận chuyển điện tử trong quang phosphoryl hoá, ảnh hƣởng hoạt tính các enzyme khác tham gia vào quá trình đồng hoá carbon.
Từ đó dẫn tới giảm hiệu quả quang hợp và sự tích luỹ chất khô của cây. Trong giai đoạn sinh trƣởng sinh thực, cây rất nhạy cảm với tình trạng thiếu nƣớc. Theo Manavalan và cs (2009), năng suất của đậu tƣơng giảm từ 32 – 44 % nếu gặp hạn ở giai đoạn kết hạt. Do vậy, thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã đƣợc chứng minh là những thời kì bị ảnh hƣởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nƣớc.
Khả năng cố định đạm ở các loài cây họ đậu thƣờng rất nhạy cảm đối với tình trạng nƣớc ở trong đất. Theo Huang và cs (1975), hoạt động cố định đạm giảm khi thế nƣớc giảm và ngừng lại khi trọng lƣợng nốt sần giảm dƣới 80 % so với khi đủ nƣớc. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nƣớc cũng ảnh hƣởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cƣờng tính kháng đối với khả năng khuếch tán O2. Tình trạng thiếu nƣớc ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy urea ở lá của cây đậu tƣơng và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần.
Các nhân tố sinh thái cũng ảnh hƣởng không nhỏ đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây đậu tƣơng. Đất trồng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ, tơi xốp, sẫm màu, thoáng, thoát nƣớc, pH từ 6,5 -7,2. Thời kỳ mọc nhiệt độ thích hợp nhất là 18 - 22 , phạm vi nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho thời kỳ mọc là 10 và 40. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng cành lá là 20 - 23 , thấp nhất là 15 , cao nhất là 37.
Nhiệt độ dƣới 10 ngăn cản sự phân hoá hoa, dƣới 18 đã có khả năng làm cho quả không đậu. Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ ra hoa là 22 - 25. Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ hình thành quả và hạt là 21 - 23 , thấp nhất là 16 cao nhất là 35. Thời kỳ chín nhiệt độ thích hợp nhất là 19 - 20.
Nhiệt độ 25 - 27 hoạt động của vi khu n nốt sần tốt nhất [9]. 5 Về giá trị kinh tế, sản ph m đậu tƣơng đƣợc lƣu hành trên thế giới chủ yếu dƣới 3 dạng: hạt, dầu và bột. Đậu tƣơng là loại cây lấy dầu giữ vai trò quan trọng hàng đầu trên thế giới. Dầu đậu tƣơng đƣợc sử dụng làm thực ph m nhƣ dầu rán, salat.
Trong công nghiệp, dầu đậu tƣơng còn đƣợc sử dụng làm xi, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, cao su nhân tạo, len nhân tạo…Bên cạnh dầu đậu tƣơng thì bột đậu tƣơng cũng là sản ph m tham gia trong nhiều mặt hàng hóa khác nhau. Bột đậu tƣơng là thành phần quan trọng trong kh u phần thức ăn. Hạt đậu tƣơng có thể chế biến thành nhiều loại thực ph m khác nhau nhƣ các loại thức ăn nhƣ đậu phụ, tƣơng và sữa đậu nành [2] Về giá trị dinh dưỡng, đậu tƣơng là cây thực ph m có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng. Đây là loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dƣỡng và giá trị cai tạo đất.
Đậu tƣơng giàu hàm lƣợng chất đạm protein đƣợc trồng để làm thức ăn cho ngƣời và gia súc. Trong hạt đậu tƣơng có các thành phần dinh dƣỡng cao nhƣ protein (30-40 %), lipid (12-25 %), glucid (10-15 %): có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose.