CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về enzyme proteolytic 1. Sơ lược về enzyme Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000 dalton, do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua các màng bán thấm. Enzym là những chất xúc tác hữu cơ có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất do tế bào sống tổng hợp nên, xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định [1].
Nhiều enzyme chứa trong mô và cơ quan động, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật đều có thể tách ra khỏi tế bào hoặc tự chúng chuyển từ tế bào ra môi trường bên ngoài; các enzyme vẫn tồn tại tính chất và khả năng xúc tác của mình khi tách chiết ra ở dạng chế phẩm khô. Có ba nguồn nguyên liệu enzyme cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật [1]. Sơ lược về enzyme proteolytic 1. Định nghĩa enyme proteolytic Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L- acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton.
Và chúng thường tác động lên các liên kết ester đơn giản. Công thức cấu tạo protease 1. Phân loại enzyme proteolytic Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm: - Protease nội bào. - Protease ngoại bào.
Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất: - Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch. - Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch. Dựa vào pH hoạt động: - Protease acid tính. - Protease kiềm tính.
- Protease trung tính. Dựa vào nguồn thu nhận enzyme: - Protease động vật. - Protease thực vật. - Protease vi sinh vật.
Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme - Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin… - Thiol protease (SH): papain, bromeline… - Aspartic protease (COOH): pepsin, renin… 2 - Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+ hoặc Mg2+). Tình hình nghiên cứu protease trong nước Ở nước ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease. Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm, dược phẩm. Trần Thanh Trúc và cộng sự (2014), Nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon).
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông của thịt đầu tôm sú đến quá trình trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) và các điều kiện tối ưu trích ly enzyme protease. Kết quả khảo sát cho thấy, việc trữ đông nguyên liệu đến 8 tuần vẫn giúp duy trì ổn định hoạt tính enzyme protease có trong thịt đầu tôm. Dịch chiết protease kiềm thu được từ thịt đầu tôm sú có tổng hoạt tính cao nhất là 13,48 U/g chất khô nguyên liệu với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 4 (w/v); pH 9,0; nhiệt độ 50°C; thời gian trích ly 40 phút. Hà Thị Thụy Vy và các cộng sự (2016) Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm.
Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hiệu quả tinh sạch enzyme protease trong dịch trích ly từ 2 loại thịt đầu tôm (sú và thẻ chân trắng). Tỷ lệ giữa dịch trích protease thô và dung môi (ethanol, acetone, iso-propanol) được thay đổi từ 1: 1 đến 1: 6 (v/v), tương tựnồng độ ammonium sulfate trong dịch trích cũng dao động từ 35% đến 85%. Xác định thời gian kết tủa thích hợp từ tác nhân được lựa chọn cũng được khảo sát. Kết quả cho thấy, ethanol đạt hiệu quả kết tủa protease cao cho cả hai dịch trích.
Đối với dịch trích tôm sú, tỷ lệ mẫu: ethanol là 1: 4 (v/v) và thời gian kết tủa là 45 phút cho hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch đạt tương ứng 3,49 U/mg protein, 87,46% và 3,78 lần. Đối với tôm thẻ, tỷ lệ mẫu với ethanol là 1: 3 (v/v), thời gian kết tủa 30 phút cho giá trị lần lượt là 2,04 U/mg protein, 85,66% và 3,23 lần. Cả hai loại protease được xác định bằng điện di SDS-PAGE có trọng lượng phân tử là 35,8 ÷ 40,5 kDa. 3 Võ Văn Quốc Bảo và các cộng sự (2018), thu nhận và khảo sát một số tính chất của chế phẩm Ficin từ nhựa quả vả (Ficus auriculata L.) nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme này nhằm nâng cao giá trị sử dụng của quả vả tại Thừa Thiên Huế.
Quả vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng là 2,212 mg/g chất khô của nguyên liệu và 1,077 Hp/ml khi tỷ lệ giữa dịch nhựa quả vả/ethanol 96 % là 1/4 và nhiệt độ chiết là 3°C. Thời gian thu nhận enzyme này thích hợp nhất là 60 phút. Chế phẩm protease hoạt động thích hợp ở 45 °C, pH = 6, bền nhiệt từ 35°C đến 50°C trong 1 giờ. Tình hình nghiên cứu protease ngoài nước Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinh sạch.
Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein. Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosin. Wurtz (1879) chiết tách được papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách được bromelain… Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark).
Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên. 4 Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao.
Tổng quan về một số loại enzyme proteolytic thu nhận từ thực vật có sẵn trên thị trường Các enzym phân giải protein đã được tìm thấy ở cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Đại diện của các loài cây hai lá mầm là sung, đu đủ, bông sữa, euphorbia; cây một lá mầm là dứa và ngũ cốc [2]. Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách khuấy nhựa đu đủ một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đen sấy khô nghiền nhỏ. Bromelin thu từ thân dứa, sau khi hái quả, người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzyme trong dịch ép.
Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus. Một số thực vật như malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác cũng là nguồn enzyme có truyền thống được dùng trong công nghiệp rượu, bia, bánh kẹo. Malt chủ yếu có chứa amilaza hoạt động, còn các enzyme thủy phân khác hoạt động tương đối yếu [1]. Những loại enzyme trích ly từ những loại thực vật trên thuộc nhóm Cystein- protease vì trung tâm hoạt động của nó có chứa nhóm Sulfhydryl (-SH) của Cystein, nhóm này nằm gần vòng imidazol của Histidine và nhóm -COOH của axit Aspactic.
Sự tổ hợp của các nhóm chức này có mặt trong trung tâm hoạt động tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác của phân tử enzyme và có pH tối ưu vào khoảng 7 để phân giải một số loại protein như hemoglobin, casein, albumin trứng, v., và có khả năng làm đông tụ sữa; còn nhóm enzyme protease không chứa gốc Sulfhydryl (-SH) có pH tối ưu kiềm hơn và khả năng đông tụ sữa kém hơn. Cả hai nhóm proteinase thực vật đều có khả năng chịu nhiệt, thường duy trì hoạt động ở nhiệt độ từ 60℃ đến 70℃ [2]. Phân loại một số loại enzyme thực vật [32] Một số proteinase thực vật có một số ứng dụng công nghệ và y tế, quan trọng nhất về mặt thương mại là làm mềm thịt điển hình là papain và bromelin. Các ứng dụng công nghệ khác trong nền công nghiệp thuộc da, da giày và trong công nghiệp sản xuất bia.
Trong y tế, chúng được sử dụng để điều trị rối loạn tiêu hóa liên quan đến protein và điều trị vết thương bong tróc. Hầu hết các protease thực vật có thể tiêu hóa các loài giun sống ký sinh, chẳng hạn như giun đũa. Tổng quan về gừng Từ thế kỷ thứ 4 trước Công nguyên, gừng đã trở thành một phần của y học cổ truyền Trung Quốc [3]. Người Hy Lạp và La Mã cổ đại sử dụng gừng như một loại gia vị cũng như thuốc dùng để điều trị táo bón, cảm lạnh, viêm phế quản, đục thủy tinh thể, và trung hòa axit dạ dày.
Gừng có tên thường gọi ở một số quốc gia là: Ginger [tiếng anh], Jiang [tiếng Trung], Gingembre [tiếng Pháp], Ingwer [tiếng Đức], Zenzero [tiếng Ý], Shoga [tiếng Nhật], Gengibre [tiếng Bồ Đào Nha], Jengibre [tiếng Tây Ban Nha]. [4] Tên khoa học: Zingiber officinale Roscoe 6 Giới: Thực vật Ngành: Angiosperma Lớp: Monocotyledoneae Bộ: Scitaminaea Họ: Zingiberaceae Chi: Zingiber Loài: Officinale Đặc điểm vật lý: Loại thảo mộc sống lâu năm, có hình dáng mảnh mai, thân thẳng đứng và lá màu xanh lục trung bình hẹp xếp thành hai hàng trên mỗi thân. Cây gừng cao tới 1,5 m với những chiếc lá rộng khoảng 2 cm và dài 20 cm. Loại cây này mọc từ một thân ngầm dày, có mùi thơm (thân rễ), có bề mặt phân nhánh, không đồng đều.
Hoa gừng phát triển tạo thành một cành dày đặc cao tới 8 cm trên một thân khác với các lá [5]. Phân bố và sinh thái: Gừng là loài thực vật sống được chủ yếu ở các vùng nhiệt đới ấm, ẩm, râm mát của miền nam châu Á, nhưng hiện nay loại cây này được trồng phổ biến phụ vụ cho mục đích thương mại ở Jamaica, Tây Ấn, Haiti, Trung Quốc và Nigeria.