Nghiên Cứu Điều Kiện Lên Men và Phương Pháp Tách Chiết Chất Kháng Nấm Gây Bệnh Thực Vật Từ Vi Khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

• Tác giả: Nguyễn Phương Liên
• Người hướng dẫn: TS. Trịnh Thành Trung
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Điều Kiện Lên Men và Phương Pháp Tách Chiết Chất Kháng Nấm Từ Bacillus amyloliquefaciens
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Vi khuẩn Bacillus
• 1.2. Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus
• 1.3. Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus
• 1.4. Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại
• 1.5. Phương pháp phân lập và phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus
• 1.6. Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus
• 1.7. Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương
• 1.8. Lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương
• 1.9. Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương
• 1.10. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus
• 1.11. Mục đích nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Môi trường nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
• 2.6. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 2.7. Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan
• 2.8. Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
• 2.9. Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen
• 2.10. Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 2.11. Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn
• 2.12. Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn
• 2.13. Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn
• 2.14. Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Lựa chọn chủng B. plantarum và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng nghiên cứu
• 3.2. plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam
• 3.3. Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn
• 3.4. Enzyme ngoại bào
• 3.5. Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
• 3.6. Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B.
• 3.7. Phân tích dấu vân tay rep-PCR
• 3.8. Phân tích trình tự đa gen
• 3.9. Tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất sinh học của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn từ chủng B.
• 3.10. So sánh hiệu quả tách chiết chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
• 3.11. Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn
• 3.12. Xác định các tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn
• 3.13. Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
• 3.14. Thử nghiệm nẩy mầm hạt
• 3.15. Thử nghiệm khả năng sinh trưởng của cây
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chất Kháng Nấm Từ Bacillus 55

Chi Bacillus là một nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào tử và phân bố rộng rãi. Trong số đó, Bacillus amyloliquefaciens nổi bật với khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng khuẩn, mang lại nhiều lợi ích cho nông nghiệp. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của Bacillus amyloliquefaciens trong việc kiểm soát sinh học nấm bệnh hại cây trồng, mở ra hướng đi mới cho nền nông nghiệp xanh và bền vững. Các chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn, được tổng hợp nhờ enzyme NRPS. Các chất này có cấu trúc hóa học và đặc tính sinh học đa dạng, hứa hẹn nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y dược. Nghiên cứu về điều kiện lên men và phương pháp tách chiết các chất kháng nấm này là rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả sản xuất và ứng dụng.

1.1. Giới thiệu về Bacillus amyloliquefaciens và ứng dụng 45

Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, nổi tiếng với khả năng sinh ra các chất kháng nấm và kháng khuẩn. Vi khuẩn này có khả năng sống trong nhiều môi trường khác nhau và có thể được phân lập từ đất, nước và thực vật. Các chủng Bacillus amyloliquefaciens đã được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp như một biện pháp kiểm soát sinh học đối với các bệnh do nấm gây ra. Một số chủng còn có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật và cải thiện khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu chất kháng nấm 48

Nghiên cứu về chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho thuốc trừ nấm hóa học. Việc sử dụng quá nhiều thuốc trừ nấm hóa học có thể gây ra các vấn đề về ô nhiễm môi trường, kháng thuốc ở nấm bệnh và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Các chất kháng nấm sinh học từ Bacillus amyloliquefaciens có thể là một giải pháp an toàn và hiệu quả hơn để kiểm soát các bệnh do nấm gây ra trong nông nghiệp.

II. Thách Thức Trong Lên Men và Tách Chiết Kháng Nấm 58

Mặc dù Bacillus amyloliquefaciens có tiềm năng lớn trong việc sản xuất chất kháng nấm, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong quá trình lên men và tách chiết. Các yếu tố như môi trường lên men, nhiệt độ lên men, pH lên men và thời gian lên men có thể ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất chất kháng nấm. Ngoài ra, quá trình tách chiết và tinh sạch chất kháng nấm cũng đòi hỏi các phương pháp hiệu quả để đảm bảo thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao và hoạt tính mạnh. Việc tối ưu hóa các điều kiện lên men và phương pháp tách chiết là rất quan trọng để giảm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả ứng dụng.

2.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến hiệu suất 52

Các điều kiện lên men như thành phần môi trường lên men, nhiệt độ, pH và thời gian có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của Bacillus amyloliquefaciens và khả năng sản xuất chất kháng nấm. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung các nguồn carbon và nitrogen phù hợp vào môi trường lên men có thể làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất chất kháng nấm. Ngoài ra, việc kiểm soát nhiệt độ và pH trong quá trình lên men cũng rất quan trọng để duy trì hoạt tính của enzyme và ngăn ngừa sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn.

2.2. Khó khăn trong tách chiết và tinh sạch chất kháng nấm 58

Quá trình tách chiết và tinh sạch chất kháng nấm từ dịch lên men của Bacillus amyloliquefaciens có thể gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp của thành phần dịch lên men. Các chất kháng nấm thường có nồng độ thấp và lẫn với nhiều tạp chất khác, đòi hỏi các phương pháp tách chiết và tinh sạch hiệu quả. Các phương pháp thường được sử dụng bao gồm chiết xuất bằng dung môi, kết tủa, sắc ký và siêu lọc. Tuy nhiên, việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của chất kháng nấm và yêu cầu về độ tinh khiết của sản phẩm.

III. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Điều Kiện Lên Men Kháng Nấm 59

Để giải quyết các thách thức trên, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng để tối ưu hóa điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens. Các phương pháp này bao gồm sử dụng các thiết kế thí nghiệm (DOE) để xác định các yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu suất lên men, áp dụng các kỹ thuật lên men tiên tiến như lên men mẻ (batch fermentation), lên men liên tục (continuous fermentation) và lên men fed-batch, cũng như cải tiến các phương pháp tách chiết và tinh sạch như sử dụng các dung môi mới, sắc ký ái lực và công nghệ màng.

3.1. Thiết kế thí nghiệm DOE trong tối ưu hóa lên men 55

Thiết kế thí nghiệm (Design of Experiments - DOE) là một phương pháp thống kê được sử dụng để xác định các yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến một quá trình và tối ưu hóa các điều kiện để đạt được hiệu suất mong muốn. Trong lên men Bacillus amyloliquefaciens, DOE có thể được sử dụng để xác định các yếu tố như nồng độ nguồn carbon, nồng độ nguồn nitrogen, nhiệt độ, pH và thời gian có ảnh hưởng lớn nhất đến sản xuất chất kháng nấm. Bằng cách sử dụng DOE, các nhà nghiên cứu có thể giảm số lượng thí nghiệm cần thiết và xác định các điều kiện lên men tối ưu một cách hiệu quả.

3.2. Kỹ thuật lên men tiên tiến để tăng hiệu suất 50

Các kỹ thuật lên men tiên tiến như lên men mẻ (batch fermentation), lên men liên tục (continuous fermentation) và lên men fed-batch có thể được sử dụng để tăng hiệu suất sản xuất chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens. Lên men fed-batch là một kỹ thuật trong đó các chất dinh dưỡng được bổ sung vào môi trường lên men trong suốt quá trình lên men, giúp duy trì sự sinh trưởng của vi khuẩn và sản xuất chất kháng nấm ở mức cao. Lên men liên tục là một kỹ thuật trong đó môi trường lên men tươi được liên tục bổ sung vào và dịch lên men đã sử dụng được liên tục loại bỏ, giúp duy trì điều kiện ổn định và tăng năng suất.

IV. Phương Pháp Tách Chiết và Tinh Sạch Chất Kháng Nấm 57

Các phương pháp tách chiết và tinh sạch đóng vai trò quan trọng trong việc thu được chất kháng nấm có độ tinh khiết cao và hoạt tính mạnh. Các phương pháp phổ biến bao gồm chiết xuất bằng dung môi, kết tủa, sắc ký và công nghệ màng. Chiết xuất bằng dung môi là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để tách chiết chất kháng nấm từ dịch lên men. Sắc ký là một phương pháp mạnh mẽ để tinh sạch chất kháng nấm dựa trên các đặc tính vật lý và hóa học của chúng. Công nghệ màng như siêu lọc và thẩm thấu ngược có thể được sử dụng để loại bỏ các tạp chất và cô đặc chất kháng nấm.

4.1. Chiết xuất bằng dung môi Ưu điểm và hạn chế 53

Chiết xuất bằng dung môi là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để tách chiết chất kháng nấm từ dịch lên men. Dung môi được lựa chọn phải có khả năng hòa tan chất kháng nấm và không hòa tan các tạp chất khác. Các dung môi thường được sử dụng bao gồm ethyl acetate, butanol và methanol. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện và chi phí thấp. Tuy nhiên, phương pháp này có thể không hiệu quả đối với các chất kháng nấm có độ phân cực cao hoặc thấp, và có thể gây ô nhiễm dung môi.

4.2. Ứng dụng sắc ký trong tinh sạch chất kháng nấm 55

Sắc ký là một phương pháp mạnh mẽ để tinh sạch chất kháng nấm dựa trên các đặc tính vật lý và hóa học của chúng. Có nhiều loại sắc ký khác nhau, bao gồm sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). HPLC là một phương pháp sắc ký được sử dụng rộng rãi để phân tích và tinh sạch các hợp chất hữu cơ, bao gồm cả chất kháng nấm. Ưu điểm của sắc ký là có thể đạt được độ tinh khiết cao và phân tích định lượng chất kháng nấm. Tuy nhiên, phương pháp này có thể tốn kém và đòi hỏi thiết bị chuyên dụng.

V. Ứng Dụng Chất Kháng Nấm Từ Bacillus Tiềm Năng 52

Các chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, y học và công nghiệp. Trong nông nghiệp, chúng có thể được sử dụng để kiểm soát sinh học các bệnh do nấm gây ra trên cây trồng, giảm sự phụ thuộc vào thuốc trừ nấm hóa học. Trong y học, chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới chống lại các bệnh nhiễm nấm ở người. Trong công nghiệp, chúng có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự phát triển của nấm mốc.

5.1. Kiểm soát sinh học nấm bệnh cây trồng bằng kháng nấm 58

Các chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens có thể được sử dụng để kiểm soát sinh học các bệnh do nấm gây ra trên cây trồng. Chúng có thể ức chế sự phát triển của nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm phá vỡ màng tế bào nấm, ức chế tổng hợp chitin và cạnh tranh dinh dưỡng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sử dụng Bacillus amyloliquefaciens có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh và tăng năng suất cây trồng. Một số chế phẩm sinh học chứa Bacillus amyloliquefaciens đã được thương mại hóa và sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp.

5.2. Tiềm năng phát triển thuốc chống nấm cho người 51

Các chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens cũng có tiềm năng phát triển các loại thuốc mới chống lại các bệnh nhiễm nấm ở người. Các bệnh nhiễm nấm đang trở thành một vấn đề sức khỏe ngày càng nghiêm trọng do sự gia tăng của các chủng nấm kháng thuốc. Các chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens có thể có cơ chế tác động khác với các thuốc chống nấm hiện tại, giúp vượt qua tình trạng kháng thuốc. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chúng trên người.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Chất Kháng Nấm Tương Lai 59

Nghiên cứu về điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens đã đạt được nhiều tiến bộ đáng kể. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề cần được giải quyết để tối ưu hóa hiệu quả sản xuất và ứng dụng. Các hướng nghiên cứu tương lai bao gồm tìm kiếm các chủng Bacillus amyloliquefaciens mới có khả năng sản xuất chất kháng nấm với hoạt tính cao hơn, phát triển các phương pháp lên men và tách chiết hiệu quả hơn, và đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chất kháng nấm trong các ứng dụng khác nhau.

6.1. Tìm kiếm chủng Bacillus mới và tối ưu hóa di truyền 54

Việc tìm kiếm các chủng Bacillus amyloliquefaciens mới có khả năng sản xuất chất kháng nấm với hoạt tính cao hơn là một hướng nghiên cứu quan trọng. Các chủng mới có thể được phân lập từ các môi trường tự nhiên khác nhau hoặc được tạo ra bằng các kỹ thuật đột biến và chọn lọc. Ngoài ra, các kỹ thuật kỹ thuật di truyền có thể được sử dụng để cải thiện khả năng sản xuất chất kháng nấm của các chủng hiện có.

6.2. Nghiên cứu cơ chế tác động và độc tính của kháng nấm 52

Nghiên cứu cơ chế tác động và độc tính của chất kháng nấm từ Bacillus amyloliquefaciens là rất quan trọng để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của chúng trong các ứng dụng khác nhau. Cần có các nghiên cứu để xác định cách thức chất kháng nấm ức chế sự phát triển của nấm bệnh và đánh giá tác động của chúng đối với môi trường và sức khỏe con người. Các nghiên cứu này sẽ giúp xác định các ứng dụng phù hợp và các biện pháp phòng ngừa cần thiết.

Tổng quan nghiên cứu

Vi khuẩn Bacillus là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong sinh quyển, có khả năng sinh nội bào tử giúp tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trong số gần 300 loài Bacillus, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum (B. plantarum) nổi bật với khả năng sinh các chất kháng nấm, kháng khuẩn, enzyme ngoại bào và chất kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần tăng cường miễn dịch cho cây trồng. Tại Việt Nam, các chủng B. plantarum được phân lập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau, thể hiện tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp xanh và bền vững.

Luận văn tập trung nghiên cứu các đặc tính sinh học có lợi cho cây trồng của các chủng B. plantarum phân lập từ bốn vườn quốc gia và vùng đất canh tác lân cận, bao gồm Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo trong giai đoạn 2012-2013. Mục tiêu chính là đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, khả năng sinh enzyme ngoại bào, phân giải phosphate khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng IAA, đa dạng di truyền, cũng như tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học của các chất kháng sinh từ chủng B. plantarum CP 1604. Nghiên cứu còn thử nghiệm tính an toàn của các chất này trên hạt và cây trồng.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản, đồng thời thúc đẩy sản xuất nông nghiệp bền vững tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết phân loại vi khuẩn Bacillus: Dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA, cùng các gen đa gen như gyrA, rpoB, purH, polC, groEL để xác định và phân loại chính xác các chủng vi khuẩn.

• Mô hình sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome (NRPS): Giải thích cơ chế tổng hợp các lipopeptide kháng sinh như iturin, fengycin, surfactin, polymyxin từ các enzyme NRPS, giúp hiểu rõ cấu trúc và hoạt tính sinh học của các chất kháng nấm, kháng khuẩn.

• Khái niệm enzyme ngoại bào và chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA): Enzyme thủy phân ngoại bào (lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase, chitinase) đóng vai trò phân hủy chất hữu cơ, hỗ trợ hấp thu dinh dưỡng; IAA là hormone thực vật kích thích sinh trưởng, phát triển rễ và cây trồng.

• Phương pháp phân tích đa dạng di truyền rep-PCR và giải trình tự đa gen: Đánh giá sự đa dạng kiểu gen và mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các chủng vi khuẩn.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 441 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ 79 mẫu đất tại 4 vườn quốc gia và vùng đất canh tác lân cận ở Việt Nam. 15 chủng B. plantarum được lựa chọn dựa trên trình tự gen 16S rRNA có độ tương đồng ≥ 99,93% với chủng chuẩn FZB42.

• Phương pháp phân tích:

  • Xác định hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán thạch trên các chủng nấm gây bệnh thực vật (Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici) và vi khuẩn Xanthomonas oryzae.

  • Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào qua khuếch tán thạch trên các cơ chất đặc hiệu.

  • Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan bằng phương pháp xanh molybdenum và sinh IAA bằng phản ứng tạo màu với thuốc thử Salkowski.

  • Phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật rep-PCR sử dụng mồi ERIC và GTG5, phân tích dữ liệu bằng phần mềm NTSYSpc 2.

  • Giải trình tự đa gen 6 gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL, 16S rRNA) và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Neighbor joining trên phần mềm MEGA 5.

  • Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy chủng CP 1604 bằng 4 phương pháp: dung môi hữu cơ, hấp phụ hạt amberlite-XAD7, đông khô dịch nuôi cấy với ethanol, tủa ở pH thấp.

  • Tinh sạch chất kháng sinh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột Zorbax Eclipse XDB-C18.

  • Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng sinh: độ bền nhiệt, pH, và khả năng chịu phân giải bởi các enzyme thủy phân (trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase, proteinase K).

  • Thử nghiệm tính an toàn trên hạt thóc, lạc, ngô và cây non bằng phương pháp ngâm hạt và phun dịch chiết ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn từ tháng 11/2012 đến 10/2013; các thử nghiệm sinh học, phân tích di truyền và tách chiết chất kháng sinh thực hiện trong năm 2014-2015; thử nghiệm tính an toàn và hoàn thiện luận văn năm 2016.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đa dạng và hoạt tính sinh học của các chủng B. plantarum

   • 15 chủng B. plantarum phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau có độ tương đồng gen 16S rRNA ≥ 99,93% với chủng chuẩn FZB42.
   • Các chủng đều sinh chất kháng nấm với kích thước vòng ức chế trung bình từ 4,2 đến 10,6 mm đối với Fusarium capsici và các loại nấm khác.
   • Hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae đạt vòng ức chế trung bình 20,8 mm.
   • Tất cả chủng đều sinh enzyme ngoại bào lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase với kích thước vòng phân giải từ 6 đến 25 mm.
   • Khả năng phân giải phosphate khó tan Ca3(PO4)2 dao động từ 19,64 đến 74,21 µg/ml; một số chủng như CDH 0101 và SP 1901 sinh IAA với hàm lượng lần lượt 3,28 và 1,98 µg/ml.

2. Đa dạng di truyền

   • Kỹ thuật rep-PCR với mồi ERIC và GTG5 phân loại 15 chủng thành 8 và 13 kiểu gen khác nhau, thể hiện đa dạng di truyền cao.
   • Phân tích đa gen 6 gen cho thấy chủng CP 1604 và SP 1901 thuộc hai nhóm B. velezensis khác biệt, xác nhận tính đa dạng kiểu gen.

3. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh từ chủng CP 1604

   • Chất kháng nấm và kháng khuẩn được tách chiết hiệu quả nhất bằng dung môi 1-butanol và 2-pentanol, cũng như phương pháp hấp phụ hạt amberlite-XAD7.
   • HPLC phân tách thành hai phân đoạn hoạt tính riêng biệt: chất kháng nấm có khối lượng phân tử 1042 Da, chất kháng khuẩn 402 Da.
   • Chất kháng nấm duy trì hoạt tính tốt ở nhiệt độ 60-100°C trong 2 giờ, trong khi chất kháng khuẩn giảm hoạt tính rõ rệt ở 100°C.
   • Cả hai chất đều bền với pH kiềm (8-9) và không bị phân giải bởi các enzyme thủy phân thử nghiệm.

4. Tính an toàn của chất kháng sinh

   • Chất kháng nấm và kháng khuẩn không ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ nảy mầm và kích thước hạt thóc, lạc, ngô khi ngâm trong dung dịch pha loãng MIC.
   • Phun dịch chiết lên cây non không gây biến đổi màu sắc lá hay ức chế sinh trưởng sau 5-7 ngày.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy các chủng B. plantarum phân lập tại Việt Nam sở hữu phổ hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn rộng, phù hợp với các báo cáo quốc tế về khả năng sản sinh lipopeptide và polyketide có hoạt tính sinh học cao. Hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng phân giải phosphate khó tan cùng với sinh IAA góp phần thúc đẩy sự phát triển của cây trồng, đồng thời hỗ trợ quá trình phân hủy chất hữu cơ trong đất.

Đa dạng di truyền cao được xác nhận qua rep-PCR và phân tích đa gen cho thấy các chủng có nguồn gốc sinh thái khác nhau có thể mang các đặc tính sinh học khác biệt, tạo điều kiện lựa chọn chủng phù hợp cho từng mục đích ứng dụng cụ thể.

Việc tách chiết và tinh sạch thành công hai loại chất kháng sinh riêng biệt với đặc tính bền nhiệt, bền pH và chịu enzyme thủy phân cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học ổn định và an toàn. Tính an toàn được chứng minh trên hạt và cây trồng là cơ sở quan trọng để phát triển các sản phẩm sinh học thân thiện môi trường.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ vòng ức chế kháng nấm, kháng khuẩn, biểu đồ kích thước vòng enzyme ngoại bào, bảng so sánh hàm lượng phosphate và IAA, sơ đồ cây phát sinh chủng loại và sắc ký đồ HPLC minh họa sự phân tách các chất kháng sinh.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển chế phẩm sinh học từ chủng B. plantarum CP 1604

   • Tập trung sản xuất quy mô pilot chế phẩm chứa chất kháng nấm và kháng khuẩn tinh sạch.
   • Mục tiêu giảm tỷ lệ bệnh hại cây trồng ít nhất 30% trong vòng 1 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học phối hợp doanh nghiệp nông nghiệp.

2. Ứng dụng các chủng B. plantarum có khả năng sinh enzyme ngoại bào và phân giải phosphate trong sản xuất phân bón hữu cơ sinh học

   • Thử nghiệm phối trộn các chủng có hoạt tính cao vào phân compost để tăng hiệu quả phân giải hữu cơ và cải tạo đất.
   • Mục tiêu nâng cao năng suất cây trồng 10-15% trong 2 vụ mùa.
   • Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu nông nghiệp và hợp tác xã nông dân.

3. Mở rộng khảo sát đa dạng vi khuẩn Bacillus tại các vùng sinh thái khác của Việt Nam

   • Thu thập và phân lập thêm các chủng mới để bổ sung nguồn gen đa dạng, tăng khả năng lựa chọn chủng ưu việt.
   • Mục tiêu hoàn thành trong 3 năm tới.
   • Chủ thể thực hiện: Các trường đại học và viện nghiên cứu.

4. Nghiên cứu sâu về cơ chế tác động và tương tác giữa B. plantarum và cây trồng

   • Áp dụng công nghệ giải mã genome và phân tích transcriptome để hiểu rõ cơ chế sinh học phân tử.
   • Mục tiêu phát triển các sản phẩm sinh học có hiệu quả cao và ổn định.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm chuyên sâu về vi sinh vật và sinh học phân tử.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và giảng viên ngành Vi sinh vật học, Nông học

   • Lợi ích: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về đa dạng vi khuẩn Bacillus, phương pháp phân lập, phân tích di truyền và ứng dụng trong nông nghiệp.
   • Use case: Phát triển đề tài nghiên cứu mới, giảng dạy chuyên sâu về vi sinh vật ứng dụng.

2. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và phân bón hữu cơ

   • Lợi ích: Tham khảo quy trình tách chiết, tinh sạch chất kháng sinh và đánh giá tính an toàn sản phẩm.
   • Use case: Nghiên cứu phát triển sản phẩm mới, cải tiến công nghệ sản xuất.

3. Chuyên gia quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp xanh

   • Lợi ích: Hiểu rõ tiềm năng ứng dụng vi sinh vật trong phòng trừ dịch hại và nâng cao năng suất bền vững.
   • Use case: Xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển nông nghiệp sinh học.

4. Nông dân và kỹ thuật viên nông nghiệp

   • Lợi ích: Nắm bắt kiến thức về các chế phẩm sinh học an toàn, hiệu quả trong phòng trừ bệnh cây.
   • Use case: Áp dụng thực tế trong canh tác, giảm sử dụng hóa chất độc hại.

Câu hỏi thường gặp

1. B. plantarum có thể thay thế hoàn toàn thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh cây không?
   B. plantarum có khả năng kháng nấm và vi khuẩn gây bệnh hiệu quả, tuy nhiên nên kết hợp với các biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp để đạt hiệu quả tối ưu và bền vững.

2. Các chất kháng sinh từ B. plantarum có an toàn cho cây trồng và môi trường không?
   Thử nghiệm cho thấy các chất này không ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng cây, đồng thời bền vững trong môi trường tự nhiên, phù hợp cho ứng dụng nông nghiệp sinh học.

3. Phương pháp tách chiết nào hiệu quả nhất để thu nhận chất kháng sinh từ B. plantarum?
   Dung môi 1-butanol và 2-pentanol cùng phương pháp hấp phụ hạt amberlite-XAD7 cho hiệu quả tách chiết cao, giúp thu được chất kháng nấm và kháng khuẩn tinh khiết.

4. Làm thế nào để đánh giá đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn?
   Kỹ thuật rep-PCR với mồi ERIC và GTG5 kết hợp phân tích đa gen 6 gen là phương pháp hiệu quả để phân loại và đánh giá sự đa dạng kiểu gen giữa các chủng.

5. Các enzyme ngoại bào do B. plantarum sản sinh có vai trò gì trong nông nghiệp?
   Các enzyme như lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase giúp phân hủy chất hữu cơ, cải tạo đất và hỗ trợ hấp thu dinh dưỡng, góp phần thúc đẩy sự phát triển của cây trồng.

Kết luận

• Các chủng B. plantarum phân lập từ nhiều vùng sinh thái Việt Nam có đa dạng di truyền cao và sở hữu nhiều đặc tính sinh học có lợi cho cây trồng như kháng nấm, kháng khuẩn, sinh enzyme ngoại bào, phân giải phosphate và sinh IAA.
• Chủng CP 1604 sản sinh hai loại chất kháng nấm và kháng khuẩn riêng biệt, có đặc tính bền nhiệt, bền pH và chịu enzyme thủy phân, phù hợp cho phát triển chế phẩm sinh học.
• Thử nghiệm tính an toàn cho thấy các chất kháng sinh không ảnh hưởng tiêu cực đến hạt và cây trồng, đảm bảo an toàn khi ứng dụng thực tế.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển các sản phẩm sinh học thân thiện môi trường, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản tại Việt Nam.
• Đề xuất tiếp tục mở rộng khảo sát đa dạng vi khuẩn, nghiên cứu cơ chế tác động và phát triển quy trình sản xuất chế phẩm sinh học quy mô công nghiệp.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai thử nghiệm quy mô lớn, đồng thời đào tạo kỹ thuật viên và nông dân áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp bền vững.