Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc tính sinh học của vi rút cúm type A 1. Hình thái và cấu trúc Vi rút cúm gia cầm thuộc type A là một trong 4 nhóm vi rút của họ Orthomyxoviridae, bao gồm: - Nhóm vi rút cúm A: gây bệnh cho mọi loài chim, một số động vật có vú và cả con người. - Nhóm vi rút cúm B: chỉ gây bệnh cho người.
- Nhóm vi rút cúm C: gây bệnh cho người, lợn. Vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae có hệ gen là axit Ribonucleic (ARN) sợi đơn, có cấu trúc sợi âm được ký hiệu là ss (-) ARN (Negative Single Stranded RNA). Sợi âm ARN của hệ gen có độ dài 10. Hạt vi rút (virion) có dạng hình cầu, đôi khi có dạng hình sợi, đường kính khoảng 80 - 120 nm.
Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton. Vỏ vi rút với bản chất protein có nguồn gốc từ màng tế bào mà vi rút đã gây nhiễm đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của vi rút vào, bao gồm một số protein được glycosyl hóa (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được glycosyl hóa (non - glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu Haemagglutinin (HA), protein enzym cắt thụ thể Neuraminidase (NA) và protein đệm Matrix (MA), đó là những gai, mấu có độ dài 10 - 14 nm, đường kính 4 - 6 nm. Vi rút cúm A có hệ gen gồm 8 phân đoạn kế tiếp nhau mã hóa cho 10 loại protein khác nhau của vi rút là HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2, 4 PA, NS1, NS2.
Tám phân đoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp điện di. (Ito et al., 1998[26]; Conenello et al.) + Phân đoạn 1 - 3: mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA là các protein có chức năng là enzym polymerase tổng hợp axit Ribonucleic nguyên liệu cho hệ gen và các ARN thông tin tổng hợp protein của vi rút. Trong đó PB1 có phân tử lượng là 87 x 103 Dalton, PB2 có phân tử lượng là 84 x 103 Dalton và PA có phân tử lượng là 83 x 103 Dalton. (Subbarao, 2007[52]; Wasilenko et al., 2008[54]; Uiprasertkul et al.
+ Phân đoạn 4: mã hóa cho protein Haemagglutinin (HA) là một protein bề mặt cắm gốc vào bên trong, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, có khả năng hợp nhất vỏ vi rút với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hòa vi rút. Phân tử lượng của HA là 63 x 103 Dalton (nếu không được glycosyl hóa) và có phân tử lượng là 77 x 103 Dalton (nếu được glycosyl hóa). HA là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng đoạn oligopeptit ngắn đặc trưng cho các subtype H (H1 - H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng. Chuỗi oligopeptit này chứa một số axit amin cơ bản làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtype H.
Sự thay đổi thành phần của chuỗi nối quyết định độc lực của vi rút thuộc biến chủng mới. (Luong, Palese, 1992[43]; Keawcharoen et al. + Phân đoạn 5: mã hóa cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein được phosphoryl hóa, có biểu hiện tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm (Group - Specific), chúng tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân đoạn ARN nên loại NP còn được gọi là Ribonucleo protein. Phân tử lượng là 56 x 103 Dalton.
5 + Phân đoạn 6: mã hóa cho protein enzym Neuraminidase (NA), có chức năng là một enzym phân cắt HA sau khi vi rút vào bên trong tế bào nhiễm (Castrucci và Kawaoka, 1993) [28]. Phân tử lượng là 50 x 103 Dalton. (Castrucci, Kawaoka, 1993[28]; Lê Thanh Hòa, 2006 [41]; Keawcharoen et al. + Phân đoạn 7: mã hóa cho 2 tiểu phần protein đệm M1 và M2, là protein màng không được glycosyl hóa, có vai trò làm đệm bao bọc lấy ARN.
M2 là một tetramer có chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ vi rút sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. M1 có chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nẩy mầm của vi rút (Holsingger và cộng sự, 1994) [33]. Phân tử lượng của M1 là 28 x 103 Dalton, M2 là 11 x 103 Dalton. (Scholtissek et al.
+ Phân đoạn 8: có độ dài ổn định (890 nucleotit) mã hóa 2 tiểu phần protein không cấu trúc là NS1 và NS2 (non - structural protein) có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1, kích thích phiên mã, chống lại hiện tượng interferon. Phân tử lượng của NS1 là 27 x 103 Dalton, NS2 là 14 x 103 Dalton. Nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của protein H5 của vi rút cúm A ở gà, H9 ở lợn và H5 của vi rút thích ứng gây bệnh trên người đã cho thấy: vi rút cúm gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa axit sialic liên kết với đường Galactose, góc quay alpha - 2,3 tại vị trí Gln - 226; trong khi ở lợn và người vi rút thích hợp với thụ thể có góc quay alpha - 2,6 với nhóm hydroxyl (4 - OH) của đường Galactose (glycosyl hóa) tại vị trí Leu - 226 (cúm người). Lợn có các loại tế bào tồn tại với thụ thể HA bề mặt có cả hai loại cấu trúc trên, điều đó giải thích vi rút cúm gia cầm trung gian qua lợn để tiến hóa tạo góc quay phù hợp thích ứng sang người.
(Sekellick et al., 2000 [50]; Zhu et al.1: Cấu trúc kháng nguyên của vi rút cúm 1. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A Các loại kháng nguyên được nghiên cứu nhiều nhất là protein nhân (NP), protein đệm (M), protein gây ngưng kết hồng cầu (HA) và protein enzym cắt thụ thể (NA). Protein NP và M1 thuộc loại hình kháng nguyên đặc hiệu nhóm (genus specific antigen), ký hiệu là gs kháng nguyên; HA và NA là protein thuộc loại hình kháng nguyên đặc hiệu type và dưới type (type - specific antigen), ký hiệu là ts kháng nguyên. Một đặc tính quan trọng là vi rút cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài động vật.
Đó là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của vi rút cúm với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo thành mạng ngưng kết thông qua cầu nối vi rút, gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Haemagglutination test). Kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên HA có khả năng trung hòa các loại vi rút tương ứng, chúng là kháng thể trung hòa có khả năng triệt tiêu vi rút gây bệnh. Nó có thể phong tỏa sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA. Do vậy thụ thể của hồng cầu không bám vào được để liên kết tạo thành mạng ngưng kết.
Người ta gọi phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng 7 thể có hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination inhibition test). Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA và phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI được sử dụng trong chẩn đoán cúm gia cầm. Theo Ito và Kawaoka (1998) [37], vấn đề phức tạp của kháng nguyên vi rút cúm là sự biến đổi và trao đổi trong nội bộ gen dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên. Có 2 cách biến đổi kháng nguyên của vi rút cúm: - Đột biến điểm (đột biến ngẫu nhiên hay hiện tượng trôi trượt, lệch lạc về kháng nguyên - Antigenic drift).
Đây là kiểu đột biến xảy ra liên tục thường xuyên trong quá trình tồn tại của vi rút mà bản chất là do có sự thay đổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hóa, đặc biệt đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N. Kết quả là tạo ra các phân type cúm hoàn toàn mới có tính thích ứng loài vật chủ khác nhau và mức độ độc lực gây bệnh khác nhau. Chính nhờ sự biến đổi này mà vi rút cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1 - H16) và 9 biến thể NA (N1 - N9). - Đột biến tái tổ hợp di truyền (hiện tượng thay ca - Antigenic shift): hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng đột biến điểm, nó chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại vi rút cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của vi rút.
Điều này tạo nên sự sai khác cơ bản về bộ gen của vi rút cúm đời con so với vi rút bố mẹ. Khi hiện tượng tái tổ hợp gen xuất hiện có thể sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và động vật với mức độ nguy hiểm không thể lường trước được. Theo Lê Văn Năm (2004) [16], do hạt vi rút cúm A có cấu trúc là 8 đoạn gen nên về lý thuyết từ 2 vi rút có thể tạo 256 kiểu tổ hợp của vi rút thế hệ sau. Khi nghiên cứu về đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm gia cầm cho thấy giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtype về huyết thanh học cho thấy không hoặc rất ít có phản ứng chéo.
Đây là điểm trở ngại lớn cho việc nghiên cứu nhằm tạo ra vắc xin cúm để phòng bệnh cho người và động 8 vật. Khi xâm nhiễm vào cơ thể động vật, vi rút cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể đặc hiệu, trong đó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hòa vi rút nhưng thông thường động vật và người chết rất nhanh trước khi hệ miễn dịch sản sinh kháng thể. Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của vi rút, ví dụ kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản vi rút giải phóng, kháng thể kháng M2 không cho quá trình bao gói vi rút xảy ra. Thành phần hóa học Nhân ARN của vi rút chiếm 0,8 - 1,1%; protein chiếm 70 - 75%; lipit chiếm 20 - 24%; hydratcarbon chiếm 5 - 8% khối lượng hạt vi rút.
Lipit tập trung ở màng vi rút chủ yếu có gốc phospho. Số còn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydrocarbon gồm các loại đường galactose, ribose, fructose, glucose. Protein của vi rút chủ yếu là glycoprotein. Quá trình nhân lên của vi rút Fener và cộng sự mô tả quá trình nhân lên của vi rút cúm A được tóm tắt như sau: Vi rút xâm nhập vào tế bào nhờ chức năng của protein HA thông qua hiện tượng ẩm bào (endocytosis) qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể.
Thụ thể liên kết tế bào của vi rút cúm có bản chất là axit sialic cắm sâu vào glycoprotein hay glycolipit của vỏ vi rút.