Nghiên cứu chuyển gen kháng Soybean mosaic virus ở đậu tương DT84

Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 nhằm tạo dòng cây kháng virus đậu tương mosaic, góp phần nâng cao năng suất cây trồng.

• Người hướng dẫn: GS. Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu chuyển gen kháng Soybean mosaic virus ở đậu tương DT84
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giá trị dinh dưỡng của đậu tương

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Chuyển Gen Kháng Virus SMV Đậu Tương

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao. Tại Việt Nam, đậu tương được trồng rộng rãi, nhưng năng suất còn thấp, một phần do bệnh hại, đặc biệt là bệnh khảm lá do Soybean mosaic virus (SMV). Bệnh này có thể gây thiệt hại lớn, làm giảm năng suất tới 40% nếu nhiễm trước khi ra hoa. Các biện pháp phòng bệnh hiện tại chưa triệt để. Nghiên cứu chuyển gen kháng virus bằng kỹ thuật RNA interference (RNAi) mở ra hướng đi mới. Kỹ thuật này tạo ra cây trồng kháng bệnh bằng cách đưa gen của virus vào hệ gen cây chủ. Nhiều giống cây trồng chuyển gen đã kháng được các bệnh virus khác nhau. Đề tài "Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus" hướng đến mục tiêu này.

1.1. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của cây đậu tương

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, với protein (38-40%) và lipid (18-20%) dồi dào, cùng nhiều vitamin và khoáng chất. Protein đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein thực vật, thậm chí cao hơn cả cá và thịt. Lipid đậu tương chứa axit béo chưa no, tốt cho sức khỏe tim mạch. Đậu tương còn chứa lecithin, có tác dụng tăng cường trí nhớ và tái tạo mô. Từ đậu tương, người ta chế biến ra trên 600 sản phẩm khác nhau, từ thực phẩm truyền thống như sữa đậu nành, tương, chao đến các sản phẩm công nghiệp như socola đậu tương, bánh kẹo. Đậu tương còn được dùng làm thức ăn chăn nuôi và trong các ngành công nghiệp khác.

1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay, Mỹ là nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới, chiếm 45% diện tích và 55% sản lượng toàn cầu. Các nước sản xuất lớn khác bao gồm Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Phần lớn sản lượng đậu tương của Mỹ được dùng để nuôi gia súc hoặc xuất khẩu. Tại Việt Nam, mặc dù có lịch sử phát triển lâu đời, cây đậu tương vẫn chiếm vị trí khiêm tốn trong nền nông nghiệp. Năng suất và sản lượng còn thấp so với tiềm năng. Việc nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp cải thiện giống, đặc biệt là chuyển gen kháng virus, có ý nghĩa quan trọng để nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương.

II. Thách Thức Từ Soybean Mosaic Virus SMV Trên Đậu Tương

Soybean mosaic virus (SMV) là tác nhân gây bệnh khảm lá phổ biến trên đậu tương. Bệnh gây hại nghiêm trọng, đặc biệt khi cây nhiễm bệnh trước giai đoạn ra hoa. Năng suất có thể giảm tới 40%, và chất lượng hạt giảm sút, với 91% hạt có vết lốm đốm. SMV lây lan qua rệp và cơ học, gây khó khăn trong việc kiểm soát. Các biện pháp phòng bệnh hiện tại chỉ mang tính chất tạm thời, không thể loại trừ hoàn toàn virus. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp hiệu quả hơn để phòng chống Soybean mosaic virus là vô cùng cần thiết. Nghiên cứu chuyển gen kháng virus là một hướng đi đầy hứa hẹn.

2.1. Triệu chứng và tác hại của bệnh khảm lá đậu tương

Bệnh khảm lá do Soybean mosaic virus gây ra các triệu chứng điển hình như lá bị khảm, loang lổ, biến dạng. Cây sinh trưởng kém, còi cọc, giảm khả năng quang hợp. Nếu nhiễm bệnh sớm, cây có thể không ra hoa hoặc ra hoa ít, dẫn đến giảm năng suất nghiêm trọng. Hạt đậu từ cây bệnh thường nhỏ, chất lượng kém, có vết lốm đốm. Bệnh không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm giá trị thương phẩm của đậu tương.

2.2. Các phương pháp phòng trừ SMV truyền thống và hạn chế

Các biện pháp phòng trừ Soybean mosaic virus truyền thống bao gồm sử dụng giống kháng bệnh (nếu có), luân canh, vệ sinh đồng ruộng, và kiểm soát rệp. Tuy nhiên, các giống kháng bệnh thường không có khả năng kháng hoàn toàn, và virus có thể phát triển các chủng mới. Luân canh và vệ sinh đồng ruộng có thể giúp giảm nguồn bệnh, nhưng không loại trừ hoàn toàn. Kiểm soát rệp có thể hạn chế sự lây lan của virus, nhưng đòi hỏi sử dụng thuốc trừ sâu, gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người. Do đó, cần có các giải pháp phòng trừ hiệu quả và bền vững hơn.

III. Phương Pháp Chuyển Gen Kháng Virus SMV Vào Đậu Tương DT84

Nghiên cứu này tập trung vào phương pháp chuyển gen sử dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) để tạo ra giống đậu tương DT84 kháng Soybean mosaic virus. Kỹ thuật RNAi can thiệp vào quá trình biểu hiện gen của virus, làm giảm hoặc ngăn chặn sự nhân lên của virus trong cây. Cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV được đưa vào hệ gen của đậu tương DT84 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Quá trình này bao gồm lây nhiễm A. tumefaciens vào mô nách lá mầm hạt chín, tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo dòng cây chuyển gen. Sự có mặt của gen chuyển được xác nhận bằng kỹ thuật PCR.

3.1. Kỹ thuật RNA interference RNAi trong phòng chống virus

RNA interference (RNAi) là một cơ chế tự nhiên trong tế bào, giúp điều hòa biểu hiện gen. Trong công nghệ chuyển gen, RNAi được sử dụng để tạo ra các phân tử RNA nhỏ, có khả năng nhận diện và phá hủy RNA của virus. Khi virus xâm nhập vào cây chuyển gen, các phân tử RNAi sẽ liên kết với RNA của virus, kích hoạt quá trình phân hủy RNA, ngăn chặn sự nhân lên của virus. Kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao, chỉ tác động lên virus mục tiêu, không ảnh hưởng đến các gen khác của cây.

3.2. Quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn đất, có khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật. Trong nghiên cứu này, A. tumefaciens được sử dụng làm vector chuyển gen, mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV. Vi khuẩn được lây nhiễm vào mô nách lá mầm hạt chín của đậu tương DT84. Sau khi lây nhiễm, các tế bào thực vật bị nhiễm vi khuẩn sẽ nhận được gen chuyển. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy in vitro để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình chọn lọc được thực hiện để loại bỏ các cây không nhận được gen chuyển.

IV. Đánh Giá Hiệu Quả Chuyển Gen Kháng SMV Ở Đậu Tương DT84

Sau khi tạo dòng cây đậu tương DT84 chuyển gen, cần đánh giá hiệu quả chuyển gen và khả năng kháng Soybean mosaic virus. Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác nhận sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen. Hiệu suất chuyển gen được xác định bằng cách tính tỷ lệ cây chuyển gen thành công trên tổng số cây được xử lý. Các dòng cây chuyển gen được kiểm tra khả năng kháng virus bằng cách gây nhiễm SMV và theo dõi triệu chứng bệnh. Mức độ biểu hiện gen kháng virus cũng được đánh giá để xác định dòng cây có khả năng kháng bệnh tốt nhất.

4.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp khuếch đại DNA, cho phép nhân bản một đoạn DNA cụ thể lên hàng triệu lần. Trong nghiên cứu này, PCR được sử dụng để xác định sự có mặt của gen chuyển (cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV) trong các dòng cây đậu tương DT84. Mẫu DNA từ lá cây được sử dụng làm khuôn. Nếu gen chuyển có mặt, PCR sẽ tạo ra một đoạn DNA có kích thước đặc trưng, có thể được phát hiện bằng điện di trên gel.

4.2. Đánh giá khả năng kháng virus của dòng đậu tương chuyển gen

Để đánh giá hiệu quả chuyển gen trong việc tạo ra khả năng kháng virus ở đậu tương, các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng (không chuyển gen) được gây nhiễm Soybean mosaic virus. Triệu chứng bệnh trên cây được theo dõi và đánh giá theo thang điểm. Các chỉ số như tỷ lệ cây nhiễm bệnh, mức độ nghiêm trọng của triệu chứng, và năng suất được so sánh giữa các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng. Các dòng cây chuyển gen có triệu chứng bệnh nhẹ hơn hoặc không có triệu chứng được coi là có khả năng kháng virus tốt.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng Của Giống Đậu Tương DT84 Kháng SMV

Việc tạo ra giống đậu tương DT84 kháng Soybean mosaic virus có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương. Giống kháng bệnh giúp giảm thiểu thiệt hại do virus gây ra, giảm sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật, và góp phần vào sản xuất nông nghiệp bền vững. Giống mới có thể được sử dụng trực tiếp trong sản xuất hoặc làm vật liệu lai tạo để tạo ra các giống đậu tương ưu việt khác. Nghiên cứu này cũng mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ chuyển gen để tạo ra các giống cây trồng kháng bệnh khác.

5.1. Lợi ích kinh tế và xã hội của giống đậu tương kháng bệnh

Giống đậu tương kháng bệnh mang lại nhiều lợi ích kinh tế và xã hội. Năng suất ổn định hơn, giảm chi phí phòng trừ bệnh, tăng thu nhập cho người nông dân. Chất lượng hạt tốt hơn, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và chế biến. Giảm sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng. Góp phần đảm bảo an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và cải tiến giống đậu tương

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải tiến giống đậu tương DT84 kháng Soybean mosaic virus bằng cách lai tạo với các giống đậu tương địa phương để tạo ra các giống có năng suất cao, chất lượng tốt, và thích nghi với điều kiện khí hậu khác nhau. Nghiên cứu cũng có thể mở rộng sang việc chuyển gen kháng virus đối với các bệnh hại khác trên đậu tương. Việc đánh giá tính kháng bền vững của giống chuyển gen trong điều kiện sản xuất thực tế cũng rất quan trọng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao, được trồng rộng rãi ở Việt Nam với 65% diện tích ở miền Bắc và 35% ở miền Nam. Tuy nhiên, năng suất và sản lượng đậu tương trong nước vẫn còn thấp, chưa đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng và thức ăn cho gia súc, dẫn đến phải nhập khẩu từ nước ngoài. Một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến năng suất là bệnh do virus, đặc biệt là bệnh khảm lá đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) gây ra. SMV có thể làm giảm năng suất tới 40% và làm giảm chất lượng hạt đậu tương với tỷ lệ hạt bị vết lốm đốm lên đến 91%. Virus này lan truyền qua rệp và cơ học, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành sản xuất đậu tương.

Mục tiêu nghiên cứu là chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống đậu tương DT84 nhằm tạo dòng cây chuyển gen kháng virus SMV. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào, Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, trong khoảng thời gian từ năm 2014 đến 2015. Việc tạo ra cây đậu tương chuyển gen kháng SMV không chỉ góp phần nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương mà còn giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật, hướng tới phát triển nông nghiệp bền vững và an toàn sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: cơ chế RNA interference (RNAi) và phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. RNAi là cơ chế sinh học tự nhiên giúp ức chế biểu hiện gen thông qua việc phân hủy mRNA mục tiêu nhờ các phân tử siRNA, từ đó ngăn chặn sự tổng hợp protein gây hại. Cơ chế này được ứng dụng để tạo cây trồng chuyển gen kháng virus bằng cách đưa đoạn gen virus vào hệ gen cây chủ dưới dạng cấu trúc RNAi, tạo ra RNA dạng kẹp tóc (hairpin RNA) kích hoạt quá trình ức chế virus.

Phương pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens là kỹ thuật phổ biến và hiệu quả trong chuyển gen thực vật. Vi khuẩn này có khả năng chuyển đoạn DNA (T-DNA) từ plasmid Ti vào tế bào thực vật qua vết thương, nhờ đó đoạn gen mong muốn được tích hợp vào hệ gen cây trồng. Vector chuyển gen pK7GW-CPi-SMV được thiết kế chứa đoạn gen CPi của SMV dưới promoter CaMV35S, cùng các gen kháng kháng sinh để chọn lọc.

Các khái niệm chính bao gồm:

• RNAi (RNA interference): Cơ chế ức chế biểu hiện gen qua phân hủy mRNA.
• siRNA (small interfering RNA): Các đoạn RNA ngắn 21-25 nucleotide tham gia vào phức hệ RISC để phân hủy mRNA mục tiêu.
• Vector chuyển gen: Plasmid mang gen mục tiêu và gen chọn lọc dùng trong chuyển gen.
• Tái sinh đa chồi: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để tạo cây hoàn chỉnh từ mô nách lá mầm.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là giống đậu tương DT84, được chọn vì năng suất cao và khả năng chống đổ tốt nhưng dễ nhiễm bệnh. Vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pK7GW-CPi-SMV được sử dụng để chuyển gen. Phương pháp tái sinh đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được áp dụng để tạo cây chuyển gen.

Quy trình nghiên cứu gồm các bước:

1. Khử trùng hạt đậu tương bằng khí Clo, nảy mầm trên môi trường GM.
2. Tách đôi lá mầm, loại bỏ đỉnh sinh trưởng, gây tổn thương mô nách lá mầm.
3. Nhiễm khuẩn A. tumefaciens với OD600 từ 0,6 đến 1 trong 30 phút.
4. Đồng nuôi cấy mẫu trên môi trường CCM trong điều kiện tối 4-5 ngày.
5. Chuyển mẫu sang môi trường cảm ứng tạo đa chồi SIM có bổ sung kháng sinh để chọn lọc.
6. Kéo dài chồi trên môi trường SEM, ra rễ trên môi trường RM.
7. Trồng cây ra giá thể trong nhà lưới và theo dõi sự sống sót.
8. Tách chiết DNA tổng số từ lá cây, kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen CPi-SMV.
9. Tính hiệu suất chuyển gen dựa trên tỷ lệ cây dương tính PCR trên tổng số mẫu biến nạp.

Cỡ mẫu nghiên cứu là 285 mẫu biến nạp, được chọn ngẫu nhiên và lặp lại ba lần. Phân tích dữ liệu sử dụng kỹ thuật PCR và điện di agarose để xác định sự hiện diện của gen chuyển.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Chuyển gen thành công: Cấu trúc pK7GW-CPi-SMV đã được chuyển thành công vào giống đậu tương DT84 qua nách lá mầm hạt chín nhờ A. tumefaciens. Có 5 dòng cây chuyển gen được tạo ra ở thế hệ T0, trong đó 4 dòng dương tính với PCR, cho thấy sự tích hợp gen chuyển vào hệ gen cây.
2. Hiệu suất chuyển gen: Trong tổng số 285 mẫu biến nạp, có 5 cây sống sót (1,75%) và 4 cây dương tính PCR, tương ứng hiệu suất chuyển gen là 1,40%.
3. Khả năng tái sinh và chọn lọc: Số mẫu tạo đa chồi là 144/285 (50,5%), số mẫu kéo dài chồi là 91/285 (31,9%). Ở lô đối chứng không có gen chuyển, không có mẫu sống sót trên môi trường có kháng sinh, chứng tỏ hiệu quả chọn lọc gen chuyển.
4. Đặc điểm gen CPi-SMV: Đoạn gen CPi-SMV dài 294 nucleotide, nằm trong vùng đầu 3’ của gen coat protein (CP) của SMV, vùng này có tính bảo tồn cao và liên quan đến chức năng nhân lên và truyền virus, là mục tiêu phù hợp cho thiết kế RNAi.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất chuyển gen 1,40% tuy còn thấp so với một số nghiên cứu khác (ví dụ 4,3% ở giống DT84 với gen gus), nhưng phù hợp với các nghiên cứu chuyển gen qua nách lá mầm ở đậu tương. Nguyên nhân có thể do đặc điểm sinh học của giống DT84, điều kiện nuôi cấy, mật độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy và các yếu tố môi trường khác. Việc sử dụng khí Clo để khử trùng hạt và phương pháp tái sinh đa chồi giúp rút ngắn thời gian tạo cây chuyển gen xuống còn khoảng 3 tháng, thuận lợi cho nghiên cứu và ứng dụng.

Kết quả PCR và điện di agarose cho thấy gen CPi-SMV đã được tích hợp ổn định trong hệ gen cây, mở ra triển vọng tạo dòng đậu tương kháng SMV hiệu quả. So với các nghiên cứu chuyển gen kháng virus khác như kháng BGMV đạt 93% kháng bệnh, việc ứng dụng RNAi vào đậu tương là hướng đi mới đầy tiềm năng.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi và hiệu suất chuyển gen ở các lô thí nghiệm, cũng như bảng so sánh hiệu suất chuyển gen giữa các giống đậu tương và các nghiên cứu trước đây.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen: Điều chỉnh mật độ vi khuẩn A. tumefaciens, thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ kháng sinh chọn lọc để nâng cao hiệu suất chuyển gen trên giống DT84 trong vòng 12 tháng.
2. Phát triển các dòng chuyển gen thế hệ tiếp theo: Tiếp tục chọn lọc và phân tích các dòng T1, T2 để đánh giá tính ổn định và khả năng kháng virus SMV, đảm bảo tính di truyền và hiệu quả kháng bệnh trong 2-3 năm tới.
3. Mở rộng nghiên cứu sang các giống đậu tương khác: Áp dụng kỹ thuật RNAi và phương pháp chuyển gen đã phát triển cho các giống đậu tương phổ biến khác nhằm đa dạng hóa nguồn gen kháng bệnh trong 3 năm.
4. Ứng dụng trong sản xuất và chuyển giao công nghệ: Hướng dẫn nông dân và doanh nghiệp ứng dụng cây đậu tương chuyển gen kháng SMV, giảm thiểu tổn thất do bệnh, nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm trong vòng 5 năm.
5. Nâng cao nhận thức và đào tạo: Tổ chức các khóa đào tạo về công nghệ sinh học và chuyển gen cho cán bộ kỹ thuật và sinh viên nhằm phát triển nguồn nhân lực chất lượng cao phục vụ nghiên cứu và ứng dụng trong 2 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ sinh học và Nông nghiệp: Nghiên cứu về kỹ thuật chuyển gen, RNAi và ứng dụng trong tạo giống cây trồng kháng bệnh.
2. Chuyên gia phát triển giống cây trồng: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các giống đậu tương kháng virus, nâng cao năng suất và chất lượng.
3. Doanh nghiệp sản xuất giống và công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình chuyển gen và kỹ thuật tái sinh đa chồi để sản xuất giống chuyển gen thương mại.
4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp: Đánh giá tiềm năng và hướng phát triển công nghệ sinh học trong nông nghiệp, xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển giống cây trồng chuyển gen.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn giống đậu tương DT84 cho nghiên cứu chuyển gen?
   Giống DT84 có năng suất cao, chống đổ tốt nhưng dễ nhiễm bệnh, phù hợp để cải thiện tính kháng virus qua kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất.

2. Cơ chế RNAi giúp cây đậu tương kháng virus như thế nào?
   RNAi tạo ra các phân tử siRNA đặc hiệu phân hủy mRNA virus, ngăn chặn tổng hợp protein virus, từ đó làm giảm hoặc loại bỏ sự nhiễm virus trong cây.

3. Hiệu suất chuyển gen 1,4% có phải là thấp?
   Hiệu suất này phù hợp với phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm ở đậu tương, tuy còn thấp so với một số nghiên cứu khác nhưng có thể cải thiện bằng tối ưu hóa quy trình.

4. Làm thế nào để xác định cây chuyển gen thành công?
   Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để phát hiện sự có mặt của gen chuyển trong DNA tổng số của cây, kết hợp với chọn lọc trên môi trường có kháng sinh.

5. Ứng dụng thực tiễn của cây đậu tương chuyển gen kháng SMV?
   Giúp giảm thiểu tổn thất do bệnh SMV, nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương, giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững.

Kết luận

• Cấu trúc pK7GW-CPi-SMV đã được chuyển thành công vào giống đậu tương DT84 qua nách lá mầm hạt chín bằng A. tumefaciens.
• Đã tạo được 5 dòng cây chuyển gen ở thế hệ T0, trong đó 4 dòng dương tính với PCR, hiệu suất chuyển gen đạt 1,4%.
• Phương pháp tái sinh đa chồi từ nách lá mầm giúp rút ngắn thời gian tạo cây chuyển gen và nâng cao hiệu quả chọn lọc.
• RNAi là công cụ hiệu quả để tạo cây đậu tương kháng virus SMV, mở ra triển vọng ứng dụng trong sản xuất giống.
• Tiếp tục nghiên cứu chọn lọc các dòng chuyển gen thế hệ sau và tối ưu hóa quy trình chuyển gen là bước đi quan trọng trong phát triển giống đậu tương kháng bệnh.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp ứng dụng công nghệ RNAi trong tạo giống đậu tương kháng virus, đồng thời phát triển các chương trình đào tạo và chuyển giao công nghệ để nâng cao năng lực sản xuất giống chuyển gen tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng. Ngoài ra trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng năng suất của các giống cây trồng khác. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam.

Hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [53]. Bên cạnh những yếu tố như hạn hán, kĩ thuật canh tác thì nguyên nhân bệnh do côn trùng, do vi khuẩn và virus gây ra cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng đậu tương. Hiện nay người ta đã xác định được khoảng 30 loại bệnh hại ở cây đậu tương, trong đó có các bệnh do nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13]. Bệnh khảm lá đậu tương là bệnh hại xuất hiện phổ biến ở cây đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây ra.

Đậu tương bị nhiễm SMV ở thời điểm trước khi ra hoa năng suất có thể giảm tới 40% và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [35]. SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương do rệp, hoặc do cơ học. Hiện nay, những biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan truyền của SMV chỉ có tính chất phòng bệnh mà không thể chống lại triệt để. Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta đã tạo ra cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus bằng cách đưa ch nh gen của virus gây bệnh vào hệ gen của cây chủ.

Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống cây trồng chuyển gen kháng được các loại bệnh virus khác nhau đã được tạo ra, như cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV). Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn c 4 Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus”. ục t êu ê c u Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV ở giống đậu tương DT84. Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A.

tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Xác định hiệu suất chuyển gen. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn c 5 ươ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin và muối khoáng. Đậu tương là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipid. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein thực vật. Hàm lượng protein cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong các loại đậu đỗ khác [14].

Hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh như methionin, sistein,… của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này của trứng. Hàm lượng của cazein, đặc biệt là của lizin rất cao, gần gấp rưỡi trứng. Vì thế mà khi nói giá trị của protein ở đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo nên cholesteron.

Không có các dạng axit uric… Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi đây là cây cung cấp dầu thực vật. Hiện nay các nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon.

Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vữa động mạch [14]. Trong đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… và Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn c 6 các loại muối khoáng khác [14]. Do đó mà từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men… như làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… cho đến các sản phẩm cao cấp như đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… ngay như ở nước ta, từ hàng ngàn năm nay đậu tương đã được cung cấp như một phần nhu cầu chất đạm cho người và gia súc, thông qua các món ăn cổ truyền được chế biến từ đậu tương, phần nào tạo ra được sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phẩn thức ăn cho người dân. Đậu tương có thể chế biến thành giò, chả cho người ăn chay.

Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dạ dày và ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, mới ốm dậy hoặc do lao động quá sức. Các chất lexithin và cazein có trong đậu tương có thể dùng riêng hoặc phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng. Bột đậu tương sau khi đã ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp. Thân lá cây đậu tương có thể dùng làm thức ăn gia súc gia cầm rất tốt.

Ở nhiều nước phát triển người ta còn dùng đậu tương vào các ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không. Đậu tương còn có khả năng t ch lũy chất đạm của khí trời để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ sự cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ. Trong điều kiện thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần này có thể t ch lũy được một lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha. Do vậy có thể nói mỗi nốt sần như một “nhà máy đạm tý hon”, bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn t phân đạm mà còn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo bồi dưỡng đất [14].

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www. Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Triều Tiên. Chúng có rất nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [14]. Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ.

Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2. Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu và kỹ thuật trồng [14].

Trong điều kiện đất chua quá hoặc kiềm quá nốt sần hình thành kém. pH thích hợp cho sự hình thành của nốt sần là 6-7, vì vậy việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp rất quan trọng. Điều kiện dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nốt sần. Nhìn chung bón đầy đủ NPK thì nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nốt sần, còn hiệu quả kali không rõ lắm.

Bón đạm không thích hợp ức chế sự hình thành và phát triển của nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây. Lượng đạm cung cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha.

Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 - 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng. Quan hệ giữa vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương là mối quan hệ cộng sinh: cây cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự do của không khí chuyển sang dạng đạm hữu cơ cây có thể sử dụng được [14]. Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.vn c 8 nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này.

Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn non thân có màu t m thì hoa có màu t m đỏ. Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở ph a dưới thường ngắn, các lóng ở ph a trên thường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài). Tuỳ theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3 - 10 cm. Cây đậu tương trong vụ hè thường có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông.

Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân. Thân cây đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m. Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc. Những giống thân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão.