Nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine vào cây đậu tương dưới sự điều khiển của promoter rd29a

Nghiên cứu chuyển gen enzyme sinh tổng hợp glycine betain vào cây đậu tương dưới sự điều khiển của promoter rd29a trong điều kiện khô hạn.

• Tác giả: Tạ Thị Đông
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu chuyển gen codA mã hóa enzyme sinh tổng hợp Glycine Betain dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng khô hạn rd29A vào cây đậu tương
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG
• 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
• 1.1.2. Đặc điểm sinh học
• 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương
• 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG
• 1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ
• 1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm
• 1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá
• 1.3. GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB
• 1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật
• 1.3.2. Các con đường sinh tổng hợp GB
• 1.3.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi
• 1.4. PROMOTER VÀ PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A
• 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter
• 1.4.2. Promoter cảm ứng khô hạn RD29A
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Vật liệu thực vật
• 2.1.2. Chủng vi khuẩn và vector
• 2.1.3. Hóa chất thiết bị
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen pIBTII- rd29A-codA
• 2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium
• 2.2.3. Phương pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen codA
• 2.2.4. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen
• 2.2.5. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng phản ứng PCR
• 2.2.6. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng Phosphinothricin
• 2.2.7. Xây dựng đường chuẩn xử lý hạn ở giống đậu tương ĐT22
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A
• 3.1.1. PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R
• 3.1.2. Tách dòng rd29A bằng vector pBT, cắt pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA với HindIII và Xbal
• 3.1.3. Nối rd29A với pIBTII-codA, biến nạp vào E.coli, chọn dòng băng phản ứng cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-XbaL-R
• 3.1.4. Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng băng phản ứng colony PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R
• 3.2. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO THUỐC LÁ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM
• 3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào giống thuốc lá K326
• 3.2.2. Kết quả đánh giá và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen
• 3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá chuyển gen
• 3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22
• 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. Tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả năng cảm ứng tạo chồi
• 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ ppt (Phosphinothricin) đến hiệu quả chuyển gen
• 3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương
• 3.4. PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN
• 3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA bằng phản ứng PCR
• 3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-codA bằng ppt
• 3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine

Nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine vào cây đậu tương dưới sự điều khiển của promoter rd29a là một trong những hướng đi mới trong công nghệ sinh học. Việc này không chỉ giúp cây đậu tương tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn mà còn nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Cây đậu tương (Glycine max) là một trong những cây trồng quan trọng, có giá trị kinh tế cao. Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp.

1.1. Tầm quan trọng của enzyme glycine betaine trong cây trồng

Enzyme glycine betaine đóng vai trò quan trọng trong việc giúp cây trồng chống chịu với các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Nó giúp duy trì áp suất thẩm thấu trong tế bào, từ đó bảo vệ cây khỏi tình trạng khô hạn. Nghiên cứu cho thấy, cây trồng có chứa glycine betaine có khả năng sinh trưởng tốt hơn trong điều kiện hạn hán.

1.2. Promoter rd29a và vai trò của nó trong chuyển gen

Promoter rd29a là một trong những loại promoter cảm ứng khô hạn hiệu quả nhất. Nó giúp điều khiển sự biểu hiện của gen glycine betaine trong cây đậu tương, từ đó tăng cường khả năng chống chịu với hạn. Việc sử dụng promoter này trong nghiên cứu chuyển gen sẽ giúp tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp glycine betaine.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu chuyển gen

Mặc dù nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine vào cây đậu tương mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng gặp phải không ít thách thức. Các vấn đề như sự ổn định của gen chuyển, khả năng biểu hiện của gen trong cây trồng và sự tương tác giữa các gen là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng. Ngoài ra, việc đảm bảo an toàn sinh học cho cây trồng biến đổi gen cũng là một thách thức lớn.

2.1. Sự ổn định của gen chuyển trong cây trồng

Một trong những thách thức lớn nhất trong nghiên cứu chuyển gen là đảm bảo sự ổn định của gen chuyển trong cây trồng. Gen chuyển cần phải được duy trì qua các thế hệ để đảm bảo tính bền vững của cây trồng. Nghiên cứu cho thấy, sự ổn định này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại promoter và phương pháp chuyển gen.

2.2. An toàn sinh học và tác động môi trường

An toàn sinh học là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu cây trồng biến đổi gen. Cần phải đánh giá tác động của cây trồng biến đổi gen đến môi trường và sức khỏe con người. Việc này đòi hỏi các nghiên cứu sâu rộng và sự hợp tác giữa các nhà khoa học, nhà quản lý và cộng đồng.

III. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine

Nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine vào cây đậu tương được thực hiện thông qua các phương pháp hiện đại trong công nghệ sinh học. Các phương pháp này bao gồm thiết kế vector chuyển gen, sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen vào cây trồng, và các phương pháp phân tích gen để đánh giá hiệu quả chuyển gen.

3.1. Thiết kế vector chuyển gen pIBTII rd29A codA

Vector pIBTII-rd29A-codA được thiết kế để chứa gen mã hóa enzyme glycine betaine dưới sự điều khiển của promoter rd29a. Việc thiết kế vector này là bước quan trọng để đảm bảo gen chuyển được biểu hiện hiệu quả trong cây đậu tương.

3.2. Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương

Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thường sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Vi khuẩn này có khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật một cách tự nhiên, giúp tăng cường hiệu quả chuyển gen. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc tối ưu hóa điều kiện chuyển gen có thể nâng cao tỷ lệ thành công.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine vào cây đậu tương đã cho thấy những tín hiệu tích cực. Các dòng cây đậu tương biến đổi gen đã thể hiện khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện khô hạn, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Những kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển giống cây trồng có khả năng thích ứng với biến đổi khí hậu.

4.1. Đánh giá khả năng chống chịu của cây đậu tương biến đổi gen

Các dòng cây đậu tương biến đổi gen đã được đánh giá khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn. Kết quả cho thấy, cây trồng có chứa enzyme glycine betaine có khả năng sinh trưởng tốt hơn, tỷ lệ sống sót cao hơn so với cây đối chứng.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa trong việc nâng cao năng suất cây đậu tương mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại cây trồng khác. Việc phát triển giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn sẽ góp phần quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực trong bối cảnh biến đổi khí hậu.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine vào cây đậu tương dưới sự điều khiển của promoter rd29a đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành nông nghiệp. Những kết quả đạt được không chỉ giúp nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng mà còn góp phần vào việc phát triển bền vững trong sản xuất nông nghiệp. Triển vọng trong tương lai là tiếp tục nghiên cứu và phát triển các giống cây trồng mới có khả năng thích ứng tốt hơn với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ sinh học

Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa các phương pháp chuyển gen và phát triển các giống cây trồng mới. Việc này sẽ giúp nâng cao hiệu quả của công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp.

5.2. Tác động của biến đổi khí hậu đến nghiên cứu cây trồng

Biến đổi khí hậu đang là một thách thức lớn đối với sản xuất nông nghiệp. Nghiên cứu chuyển gen enzyme glycine betaine sẽ giúp cây trồng thích ứng tốt hơn với các điều kiện khắc nghiệt, từ đó đảm bảo an ninh lương thực trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max) là một trong những cây trồng thực phẩm và công nghiệp quan trọng hàng đầu thế giới với sản lượng dầu thực vật chiếm 50% tổng sản lượng toàn cầu. Trên thế giới, diện tích gieo trồng đậu tương duy trì khoảng 91 triệu hecta với năng suất bình quân 2,2 đến 2,3 tấn/ha. Tại Việt Nam, giai đoạn 2011-2015, diện tích canh tác chỉ dao động trong khoảng 117,8 đến 181,1 nghìn hecta, năng suất bình quân đạt mức khiêm tốn từ 1,43 đến 1,48 tấn/ha và sản lượng chỉ đạt từ 168,4 đến 266,9 nghìn tấn, chưa đáp ứng được 30% nhu cầu chế biến trong nước.

Một trong những trở ngại lớn nhất kìm hãm năng suất đậu tương là tình trạng biến đổi khí hậu và khô hạn gay gắt. Đậu tương rất nhạy cảm với sự thiếu hụt nước; chỉ sau 4 ngày gặp hạn, hoạt tính của enzyme nitrogenase trong nốt sần rễ giảm tới 70%, gây suy giảm nghiêm trọng khả năng cố định nitơ và tổng hợp protein. Đề tài luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm của học viên Tạ Thị Đông, dưới sự hướng dẫn của Phó giáo sư Chu Hoàng Hà tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tập trung giải quyết vấn đề cấp thiết này.

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là thiết kế thành công vector chuyển gen pIBTII-rd29A-codA mang gen codA mã hóa enzyme choline oxidase dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng khô hạn rd29A, đồng thời thực hiện biến nạp vào giống đậu tương thuần ĐT22 và đánh giá thử nghiệm trên mô hình thuốc lá K326. Nghiên cứu hoàn thành vào tháng 10 năm 2017, mang lại ý nghĩa học thuật và thực tiễn sâu sắc trong việc tạo nguồn vật liệu di truyền chịu hạn, hướng tới mục tiêu ổn định năng suất cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên thuyết điều hòa thẩm thấu và cơ chế bảo vệ tế bào thực vật trước stress phi sinh học. Khi thiếu nước, tế bào thực vật đối mặt với sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu và tích lũy các gốc oxy phản ứng (ROS) phá hủy phức hệ quang hóa PSII cùng màng thylakoid. Glycine Betaine (GB) là một hợp chất amoni bậc bốn đóng vai trò chất bảo vệ thẩm thấu hữu hiệu, giúp duy trì cấu trúc đại phân tử và ổn định hoạt tính enzyme Rubisco.

Ở thực vật bậc cao, con đường sinh tổng hợp GB diễn ra qua 2 bước phức tạp nhờ enzyme CMO và BADH, tạo ra chất trung gian betaine aldehyde có độc tính cho tế bào. Ngược lại, con đường sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn Arthrobacter chỉ trải qua 1 phản ứng oxy hóa 4 electron từ tiền chất choline tạo trực tiếp thành GB nhờ enzyme choline oxidase (COD) do gen codA mã hóa (kích thước 1641 bp, protein gồm 547 axit amin, trọng lượng 60 kDa).

Hệ thống biểu hiện gen được kiểm soát bởi promoter cảm ứng khô hạn rd29A phân lập từ cây Arabidopsis thaliana (kích thước khoảng 1300 bp). Khác với promoter cấu trúc CaMV 35S luôn hoạt động liên tục gây tiêu tốn năng lượng của cây, promoter rd29A chứa các yếu tố điều hòa cis-acting như DRE và ABRE, giúp kích hoạt phiên mã nhanh chóng chỉ sau 20 phút mất nước và đạt đỉnh thứ hai sau 3 đến 4 giờ, đảm bảo gen codA chỉ biểu hiện mạnh khi cây đối mặt với khô hạn.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 50 mảnh lá cây thuốc lá mô hình K326 và hàng trăm nốt lá mầm hạt chín của giống đậu tương ĐT22 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ cung cấp. Phương pháp chọn mẫu áp dụng quy trình lấy mẫu ngẫu nhiên có kiểm soát, tuyển chọn các hạt đậu tương đạt độ thuần cao, hạt sáng mẩy, khử trùng bằng khí clo sinh ra từ phản ứng giữa 100 ml dung dịch Javel và 4 ml HCl 37%.

Quy trình tạo cấu trúc vector pIBTII-rd29A-codA thực hiện bằng phản ứng cắt nối giới hạn với hai enzyme HindIII và XbaI, tinh sạch sản phẩm qua gel agarose 0,8%, biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5alpha và chuyển vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 bằng phương pháp xung điện (2,5 kV, 25 uF).

Lý do lựa chọn phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium vào nách lá mầm là nhờ khả năng chuyển nạp T-DNA với số lượng bản sao thấp, hạn chế tối đa hiện tượng câm lặng gen. Các dòng chuyển gen được chọn lọc in vitro trên môi trường nuôi cấy mô chứa chất diệt cỏ Phosphinothricin (nồng độ 2 đến 3 mg/l) và kháng sinh diệt khuẩn cefotaxim (250 đến 500 mg/l). Cây chuyển gen thế hệ T0 và T1 được phân tích khẳng định bằng phản ứng PCR với chu trình nhiệt chuẩn hóa (biến tính tại 94 độ C, bắt cặp tại 53 độ C) và thử nghiệm quét lá trực tiếp với dung dịch Phosphinothricin nồng độ 200 đến 250 mg/l kết hợp chất bám dính Tween 20.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã nhân dòng thành công đoạn promoter rd29A kích thước khoảng 1,3 kb từ DNA tổng số của Arabidopsis và tái tổ hợp vào vector chuyển gen pIBTII-codA có kích thước 11 kb. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật colony-PCR trên 6 dòng khuẩn lạc E. coli và 6 dòng Agrobacterium đều cho tỷ lệ dương tính đạt 100%, xuất hiện đúng băng phân đoạn 1,3 kb trên gel điện di.

Thử nghiệm kiểm tra chức năng vector trên cây mô hình thuốc lá K326 ghi nhận tỷ lệ tạo chồi đạt 80% (40 trên tổng số 50 mẫu biến nạp). Từ 68 chồi cắt nuôi cấy ra rễ, có 27 chồi phát triển rễ hoàn chỉnh và 19 cây sinh trưởng ổn định trong điều kiện nhà lưới. Trên môi trường gây hạn nhân tạo chứa 2,5% PEG 8000, mẫu mô thuốc lá chuyển gen thể hiện sức sống vượt trội với khả năng tái sinh chồi và ra rễ cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng không chuyển gen.

Quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 xác định mật độ vi khuẩn A. tumefaciens tối ưu ở mức OD650 từ 0,6 đến 0,8 và nồng độ chất chọn lọc Phosphinothricin đạt hiệu quả cao nhất ở mức 3 mg/l. Phân tích phân tử các dòng đậu tương thế hệ T0 và T1 bằng PCR xác nhận sự hiện diện đồng thời của phân đoạn gen codA (khoảng 750 bp), rd29A (khoảng 1300 bp) và gen chỉ thị chọn lọc bar (khoảng 400 bp). Khi thử nghiệm quét lá với dung dịch Phosphinothricin 250 mg/l, các dòng chuyển gen hoàn toàn không bị cháy vàng lá, khẳng định gen chọn lọc và gen đích đã hoạt động hiệu quả.

Thảo luận kết quả

Khả năng chống chịu bất lợi của cây chuyển gen bắt nguồn từ việc tổng hợp Glycine Betaine được kích hoạt kịp thời nhờ promoter rd29A. Trong điều kiện đủ nước, cây không bị suy giảm sinh khối do gen codA ở trạng thái biểu hiện cơ bản. Khi gặp stress hạn, cơ chế truyền tín hiệu nội bào qua yếu tố phiên mã DRE/ABRE thúc đẩy enzyme choline oxidase chuyển hóa nhanh nguồn choline nội sinh thành Glycine Betaine, duy trì độ căng tế bào và ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid màng.

Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế trên cây lúa và cà chua chuyển gen codA, nơi hàm lượng Glycine Betaine tích lũy từ 0,3 đến 1,3 micromol/g khối lượng tươi đã giúp bảo vệ trung tâm phản ứng của phức hệ quang hóa PSII dưới nhiệt độ cao và hạn hán.

Để tối ưu hóa tính trực quan trong báo cáo học thuật, toàn bộ dữ liệu thực nghiệm về tỷ lệ cảm ứng chồi và tần số tạo cây hoàn chỉnh qua các môi trường SIM, SEM, RM được hệ thống hóa chi tiết thành các bảng số liệu tương quan. Song song đó, các biểu đồ cột so sánh mức độ phục hồi sinh khối rễ và thân, kết hợp hình ảnh điện di gel agarose sắc nét có thang chuẩn DNA 1 kb, đã minh chứng rõ ràng cho tính chính xác và độ tin cậy của quy trình chuyển gen.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất nông nghiệp, tác giả và nhóm nghiên cứu đưa ra 4 giải pháp trọng tâm:

1. Định lượng chi tiết hàm lượng Glycine Betaine nội sinh trong các dòng đậu tương ĐT22 chuyển gen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hướng đến mục tiêu xác định ngưỡng tích lũy tối ưu đạt 1,0 đến 2,0 micromol/g lá tươi trong giai đoạn 2018-2019 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật chủ trì thực hiện.
2. Khảo nghiệm khả năng chống chịu hạn và đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học của các dòng đậu tương thế hệ T2 đến T3 trong điều kiện nhà lưới bán tự nhiên, đặt mục tiêu duy trì năng suất hạt đạt từ 85% đến 90% so với điều kiện tưới tiêu chuẩn khi ngừng tưới nước 10 đến 12 ngày, thực hiện trong lộ trình 2019-2021 do Viện Công nghệ sinh học phối hợp với Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
3. Đánh giá tính ổn định di truyền của cấu trúc gen chuyển qua các thế hệ T4 đến T6 và xây dựng hồ sơ an toàn sinh học theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về sinh vật biến đổi gen, hoàn thành phê duyệt thử nghiệm diện hẹp vào năm 2022 dưới sự quản lý của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
4. Mở rộng ứng dụng cấu trúc vector pIBTII-rd29A-codA để biến nạp trên các giống đậu tương triển vọng khác như DT84, ĐVN6 hoặc chuyển giao cho các đối tượng cây họ đậu ngắn ngày, thực hiện chuyển giao công nghệ cho các trung tâm nghiên cứu giống cây trồng trong giai đoạn 2023-2025.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cho nhiều nhóm đối tượng chuyên môn:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học: Nắm bắt chi tiết quy trình thiết kế vector biểu hiện cảm ứng, kỹ thuật colony-PCR và phương pháp nuôi cấy mô chuyển gen qua vết thương nách lá mầm.
2. Cán bộ nghiên cứu chọn tạo giống tại các Viện và Trung tâm Nông nghiệp: Tiếp cận giải pháp kỹ thuật di truyền hiện đại nhằm cải thiện tính chống chịu hạn cho các giống đậu tương thuần nội địa mà phương pháp lai tạo truyền thống khó đạt được.
3. Giảng viên và sinh viên các trường Đại học khối Nông - Lâm - Sinh học: Sử dụng công trình như một giáo trình chuyên khảo thực nghiệm sinh động về sinh lý chống chịu stress ở thực vật, cơ chế sinh tổng hợp Glycine Betaine và phương pháp đánh giá an toàn sinh học.
4. Chuyên gia phân tích chính sách công nghệ sinh học nông nghiệp: Khai thác cơ sở dữ liệu khoa học về cây trồng biến đổi gen thế hệ mới để xây dựng chiến lược phát triển nông nghiệp công nghệ cao ứng phó biến đổi khí hậu tại các vùng khô hạn như Tây Nguyên và Nam Trung Bộ.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần dùng promoter cảm ứng rd29A thay vì promoter CaMV 35S? Promoter CaMV 35S hoạt động liên tục khiến cây tiêu tốn năng lượng tổng hợp enzyme ngay cả khi không bị hạn, gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng. Promoter rd29A chỉ kích hoạt phiên mã mạnh mẽ khi tế bào mất nước sau 20 phút, giúp tối ưu hóa hiệu quả sinh lý của cây.

2. Gen codA có ưu thế gì vượt trội so với các gen sinh tổng hợp Glycine Betaine ở thực vật? Ở thực vật, quá trình sinh tổng hợp GB cần 2 enzyme và tạo ra chất trung gian betaine aldehyde gây độc. Gen codA từ vi khuẩn mã hóa enzyme choline oxidase xúc tác phản ứng oxy hóa 4 electron chuyển trực tiếp choline thành GB trong 1 bước duy nhất, hoàn toàn không tạo chất độc trung gian.

3. Hiệu quả biến nạp trên mô hình cây thuốc lá đạt được kết quả ra sao? Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ tạo chồi chuyển gen đạt 80% từ 50 mảnh lá biến nạp. Đã thu được 68 chồi tái sinh, chọn lọc thành công 27 chồi ra rễ và phát triển được 19 cây hoàn chỉnh trong nhà lưới, thể hiện sức chống chịu vượt trội trên môi trường chứa 2,5% PEG 8000.

4. Phương pháp nào đã chứng minh đậu tương ĐT22 tích hợp thành công gen chuyển? Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại chính xác các đoạn gen đặc hiệu gồm codA (750 bp), rd29A (1300 bp) và bar (400 bp). Đồng thời, thử nghiệm bôi dung dịch Phosphinothricin 250 mg/l lên phiến lá không gây cháy lá, khẳng định gen đã biểu hiện thành công.

5. Đặc điểm phản ứng của giống đậu tương ĐT22 khi chịu hạn nhân tạo như thế nào? Trong buồng sinh trưởng ở nhiệt độ 33 độ C và độ ẩm 55%, khi ngừng cung cấp nước hoàn toàn, cây đậu tương ĐT22 ở giai đoạn lá V3 bị héo rũ nghiêm trọng sau 12 ngày. Đường chuẩn xử lý hạn nhân tạo xác lập thời gian phục hồi sinh trưởng tối ưu của giống từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 11.

Kết luận

Công trình luận văn thạc sĩ đã mang lại những đóng góp khoa học và thực tiễn nổi bật sau:

• Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pIBTII-rd29A-codA mang promoter cảm ứng hạn rd29A kích thước 1,3 kb và gen codA kích thước 1,6 kb.
• Khẳng định hoạt tính sinh học của vector chuyển gen trên mô hình thuốc lá K326 với tỷ lệ tạo chồi đạt 80% và tăng cường sức sống trên môi trường PEG 8000 nồng độ 2,5%.
• Chuẩn hóa quy trình chuyển gen vào nách lá mầm giống đậu tương ĐT22 qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với mật độ quang học OD650 từ 0,6 đến 0,8.
• Xác nhận sự tích hợp và biểu hiện của gen codA, rd29A và gen chọn lọc bar trên các dòng đậu tương thế hệ T0 và T1 qua phản ứng PCR và kiểm tra tính kháng Phosphinothricin 250 mg/l.
• Xây dựng thành công đường chuẩn xử lý hạn nhân tạo ở giai đoạn 3 lá thật của giống đậu tương ĐT22, làm nền tảng cho các thử nghiệm sinh lý tiếp theo.

Đóng góp chính của luận văn là tạo ra tiền đề khoa học vững chắc trong việc ứng dụng công nghệ chuyển gen cảm ứng để nâng cao tính chống chịu hạn cho cây đậu tương tại Việt Nam. Trong lộ trình giai đoạn 2023-2025, việc tiếp tục khảo nghiệm nông sinh học ngoài đồng ruộng và đánh giá an toàn sinh học sẽ mở ra triển vọng thương mại hóa các giống đậu tương biến đổi gen chất lượng cao. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp nông nghiệp quan tâm có thể kết nối chuyển giao công nghệ để chung tay xây dựng nền nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1. Nguồn gốc và phân loại Dựa vào sự đa dạng về hình thái của hạt, Fukuda và nhiều nhà khoa học đã thống nhất rằng cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc, xuất phát từ một loại đậu tương dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học là Glycile Soja Sieb và Zucc[26].

Từ Trung Quốc đậu tương được lan truyền dần ra khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu tương được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật đến giữa thế kỷ 17 đậu tương được nhà thựcvật học người Đức Engellbert Caempler đưa về Châu Âu và đến năm 1954 đậu tương mới được du nhập vào Hoa Kỳ. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, đậu tương phát triển mạnh ở Mỹ, Brazin và Canada. Ở nước ta đậu tương có lịch sử phát triển lâu đời nhưng trải qua thời gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí rất khiêm tốn trong nền sản xuất của nông nghiệp Việt Nam.

Đậu tương được trồng lấy hạt, là loại cây thực phẩm quan trọng sau lúa mì, lúa nước và ngô. Đậu tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á. Ở nước ta hiện nay có 6 vùng sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam Bộ 26,2%, miền núi Bắc Bộ 24,7%, đồng bằng Sông Hồng 17,5%, đồng bằng Sông Cửu Long 12,4%, hai vùng còn lại trồng đậu tương với tỷ lệ thấp hơn là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên. Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae chi Glycine với tên khoa học là Glycine max.

Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì Hymowit và Newell (1984) cho rằng ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja[35]. Chi Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu tương trồng Glycine max [1]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc điểm sinh học Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo.

Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo giống. Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3 thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ.

Hình dạng của lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn. Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.

Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3 hạt. Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục… những giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g.

Hình dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống. Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài 1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng.

Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha. Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120 ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 - 150 ngày [1]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày, giàu dinh dưỡng, có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt.

Giá trị dinh dưỡng: Trong hạt đậu tương có các thành phần hoá học sau protein (40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Trong đậu tương có đủ các acid amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể. Các thực phẩm làm từ đậu tương được xem là một loại "thịt không xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật.

Thậm chí, lượng đạm (protein) trong 100 g đậu tương có thể tương đương với lượng đạm trong 800 g thịt bò. Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do đậu tương cung cấp. Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác. Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá, thịt và cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần tạo cholesterol.

Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần giúp ích cho sức khỏe con người như phytosterol, lecithin, isoflavon, phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân hủy protein[1]. Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18°C và từ dầu người ta có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng[1]. Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có thể dùng làm thức ăn cho gia súc.

Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất trồng, một ha đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu cơ. Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam Thế giới: Nhận thấy với những giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao của cây đậu tương, nên đây được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á.

Bình quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc.000 ha) trong số 111 triệu ha đậu tương trồng trên toàn cầu là đậu tương chuyển gen. Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ rất sớm, nó được trồng trước cây đậu xanh và đậu đen. Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là nguyên nhân khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương.

Vì vậy, diện tích và sản lượng đậu tương của nước ta phát triển chậm. Năm 2012, sản lượng đậu tương nước ta giảm 34,3% so với cùng kỳ năm trước, xuống còn 175,2 nghìn tấn do thời tiết lạnh khác nghiệt vào cuối năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất và diện tích gieo trồng giảm mạnh. Quy mô sản xuất vẫn còn tương đối nhỏ và tiếp tục không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước. USDA dự báo diện tích trồng đậu tương năm 2013 nước ta tăng khoảng 180 nghìn ha so với năm 2011 và sản lượng đạt ở mức 270.

Theo LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 số liệu thống kê chính thức, đậu tương đang được trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam. Thủ tướng Chính phủ cũng đã phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, diện tích đất quy hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo trồng khoảng 350.000 ha, sản lượng 700.000 tấn; vùng sản xuất chính là đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên. Theo Hiệp hội chăn nuôi Việt Nam (VNFA), đậu tương sản xuất trong nước có mức giá bán kém cạnh tranh so với đậu tương nhập khẩu.

Ví dụ, đậu tương sản xuất trong nước hiện có giá từ 16.000 VND/kg (tương đương 0,77 – 0.82 USD/kg), trong khi giá đậu tương nhập khẩu chỉ khoảng từ 14.