Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương thích hợp với các tỉnh phía Bắc Việt Nam

Luận án tiến sĩ nông nghiệp phân tích nông nghiệp nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương thích hợp với một số tỉnh phía bắc việt nam, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm,

• Tác giả: Phạm Thị Bảo Chung
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Văn Đồng
• Trường học: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng
• Đề tài: Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương thích hợp với một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ nông nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.1.1. Cơ sở khoa học của lai hữu tính trong chọn tạo giống đậu tương
• 1.1.2. Cơ sở khoa học của xử lý đột biến thực nghiệm chiếu xạ trong tạo giống đậu tương
• 1.1.3. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử RAPD
• 1.2. Các bước trong chọn tạo giống đậu tương
• 1.3. Đặc điểm sinh thái của cây đậu tương
• 1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ đậu tương trên thế giới
• 1.4.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ đậu tương tại Việt Nam
• 1.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.5.1. Nghiên cứu về biến dị, di truyền của một số tính trạng ở đậu tương
• 1.5.2. Nghiên cứu về đa dạng di truyền của đậu tương bằng chỉ thị RAPD
• 1.6. Kết quả nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương
• 1.6.1. Đặc điểm các vùng sinh thái phía Bắc
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương
• 2.2.2. Chọn tạo giống đậu tương cho một số tỉnh phía Bắc
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng
• 2.3.2. Phương pháp đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị RAPD
• 2.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá thí nghiệm đồng ruộng
• 2.4. Điều kiện nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương
• 3.1.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu bằng phương pháp đột biến thực nghiệm chiếu xạ gamma Co60
• 3.1.2. Kết quả xử lý đột biến và chọn lọc dòng đậu tương đột biến
• 3.1.3. Kết quả đánh giá dòng đậu tương đột biến
• 3.1.4. Kết quả nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu bằng phương pháp lai hữu tính
• 3.1.5. Kết quả đánh giá sai khác di truyền nguồn vật liệu khởi đầu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD
• 3.1.6. Kết quả tạo một số tổ hợp lai định hướng
• 3.1.7. Kết quả nghiên cứu, đánh giá di truyền biến dị ở thế hệ F1, F2
• 3.1.8. Kết quả chọn lọc dòng đậu tương từ các tổ hợp lai định hướng
• 3.1.9. Kết quả đánh giá dòng đậu tương từ các tổ hợp lai định hướng
• 3.1.10. Kết quả đánh giá chất lượng hạt một số giống đậu tương mới
• 3.2. Kết quả chọn tạo giống đậu tương cho một số tỉnh phía Bắc
• 3.2.1. Kết quả đánh giá khả năng thích ứng của các giống đậu tương mới
• 3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng thích ứng của các giống đậu tương mới qua các mùa vụ khác nhau
• 3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng thích ứng của các giống đậu tương mới qua các địa điểm khác nhau
• 3.2.4. Kết quả thử nghiệm các giống đậu tương mới tại một số tỉnh phía Bắc
• 3.2.5. Kết quả đánh giá về sinh trưởng phát triển của các giống đậu tương mới tại một số tỉnh phía Bắc
• 3.2.6. Kết quả đánh giá về mức độ nhiễm bệnh hại, khả năng chống đổ và tính tách quả của các giống đậu tương mới tại một số tỉnh phía Bắc
• 3.2.7. Kết quả đánh giá về năng suất của các giống đậu tương mới tại một số tỉnh phía Bắc
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và tính cấp thiết của nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào việc chọn tạo giống đậu tương phù hợp với điều kiện sinh thái của các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp và cải tạo đất. Tuy nhiên, sản xuất đậu tương tại khu vực này gặp nhiều thách thức do thiếu giống đậu tương phù hợp, kỹ thuật canh tác lạc hậu và điều kiện thời tiết bất lợi. Nghiên cứu này nhằm giải quyết vấn đề này bằng cách tạo ra các giống đậu tương mới có năng suất cao, thích ứng rộng và chống chịu tốt với bệnh hại.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tạo nguồn vật liệu khởi đầu và chọn tạo giống đậu tương phù hợp với điều kiện sinh thái của các tỉnh phía Bắc. Nghiên cứu hướng đến việc phát triển các giống có thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao và khả năng chống chịu tốt với bệnh hại.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu mang lại ý nghĩa khoa học lớn bằng cách cung cấp cơ sở lý thuyết và phương pháp luận cho việc chọn tạo giống đậu tương. Về mặt thực tiễn, các giống mới sẽ góp phần nâng cao năng suất và mở rộng diện tích trồng đậu tương, từ đó tăng thu nhập cho nông dân.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp lai hữu tính và đột biến thực nghiệm để tạo nguồn vật liệu khởi đầu. Các giống đậu tương được đánh giá thông qua kỹ thuật trồng đậu tương và chỉ thị phân tử RAPD để xác định đa dạng di truyền. Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp và triển khai tại các tỉnh phía Bắc như Hà Nội, Hà Giang, Phú Thọ.

2.1. Tạo vật liệu khởi đầu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp đột biến chiếu xạ gamma Co60 và lai hữu tính để tạo ra các dòng đậu tương mới. Các dòng này được đánh giá về đặc điểm giống, năng suất và khả năng chống chịu bệnh hại.

2.2. Đánh giá đa dạng di truyền

Các giống đậu tương được đánh giá bằng chỉ thị phân tử RAPD để xác định mức độ đa dạng di truyền. Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các giống, làm cơ sở cho việc chọn lọc và lai tạo.

III. Kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã tạo ra hai giống đậu tương mới là DT2010 và DT2012, có năng suất cao, thích ứng rộng và khả năng chống chịu tốt với bệnh hại. Các giống này đã được thử nghiệm tại các tỉnh phía Bắc và cho kết quả khả quan về sinh trưởng và năng suất.

3.1. Giống DT2010

Giống DT2010 có thời gian sinh trưởng ngắn, phù hợp với vụ Đông và vụ Xuân tại Đồng bằng sông Hồng. Giống này có khả năng chống chịu tốt với bệnh gỉ sắt, phấn trắng và sương mai.

3.2. Giống DT2012

Giống DT2012 thuộc nhóm trung ngày, phù hợp với vụ Xuân và vụ Hè thu tại miền núi phía Bắc. Giống này có năng suất cao và ổn định, thích ứng tốt với điều kiện canh tác khó khăn.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã thành công trong việc chọn tạo giống đậu tương phù hợp với các tỉnh phía Bắc. Các giống mới có tiềm năng lớn trong việc nâng cao năng suất và mở rộng diện tích trồng đậu tương. Đề xuất tiếp tục nghiên cứu và phát triển các giống đậu tương mới để đáp ứng nhu cầu thị trường đậu tương và ứng phó với biến đổi khí hậu.

4.1. Đề xuất ứng dụng

Các giống DT2010 và DT2012 nên được nhân rộng và đưa vào sản xuất tại các tỉnh phía Bắc. Cần có chính sách hỗ trợ nông dân trong việc áp dụng các kỹ thuật trồng đậu tương tiên tiến.

4.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc cải thiện chất lượng giống và phát triển các giống đậu tương có khả năng chống chịu tốt hơn với biến đổi khí hậu và bệnh hại.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) giữ vị trí chiến lược trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp toàn cầu nhờ hàm lượng protein cao (40–45%), lipid dồi dào (18–22%) và khả năng cố định đạm sinh học thông qua vi khuẩn nốt sần Bradyrhizobium japonicum, giúp cải tạo độ phì nhiêu của đất và cắt đứt chu kỳ sâu bệnh trong các hệ thống luân canh. Tại Việt Nam, nhu cầu tiêu thụ đậu tương phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm và sản xuất thức ăn chăn nuôi gia tăng đột biến, song sản xuất nội địa chỉ đáp ứng được khoảng 8–10% nhu cầu. Năm 2012, Việt Nam phải nhập khẩu tới 1.292,3 nghìn tấn hạt đậu tương từ 17 quốc gia với tổng giá trị kim ngạch đạt 780,25 triệu USD. Mặc dù khu vực phía Bắc chiếm tới 70–80% diện tích đậu tương cả nước (tập trung tại miền núi phía Bắc chiếm 41,4% và Đồng bằng sông Hồng chiếm 27,6%), song năng suất bình quân toàn vùng chỉ dao động quanh ngưỡng 1,15–1,40 tấn/ha – thấp hơn đáng kể so với mức trung bình thế giới (2,30–2,89 tấn/ha).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực trạng suy thoái nghiêm trọng của bộ giống đậu tương thương mại. Giống đậu tương DT84 – vốn được công nhận và đưa vào sản xuất hơn 20 năm – dù đã thoái hóa nhưng vẫn chiếm tới trên 81% cơ cấu giống vụ Đông và trên 60% cơ cấu vụ Hè thu tại các tỉnh phía Bắc. Các giống địa phương hoặc giống cũ có thời gian sinh trưởng dài, mẫn cảm với quang chu kỳ ngày ngắn, năng suất thấp và khả năng chống chịu sâu bệnh kém (đặc biệt là bệnh gỉ sắt Phakopsora pachyrhizi, phấn trắng Microsphaera diffusa, sương mai Peronospora manshurica). Nhằm giải quyết điểm nghẽn này, luận án của Nghiên cứu sinh Phạm Thị Bảo Chung (2015) dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Văn Đồng và PGS. Mai Quang Vinh tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã được triển khai với đề tài: "Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương thích hợp với một số tỉnh phía Bắc Việt Nam".

Luận án thiết lập 2 câu hỏi nghiên cứu và 2 giả thuyết khoa học trọng tâm:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 ($Q_1$): Làm thế nào để tạo nguồn biến dị di truyền nhân tạo phong phú và đánh giá chính xác mức độ sai khác di truyền ở mức độ phân tử nhằm định hướng chính xác các tổ hợp lai ở cây đậu tương tự thụ phấn?
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 ($Q_2$): Liệu việc kết hợp giữa xử lý đột biến chiếu xạ tia Gamma nguồn $^{60}\text{Co}$ với phương pháp lai hữu tính và chọn lọc phả hệ có thể tạo ra các giống đậu tương mang kiểu gen ưu việt, thời gian sinh trưởng ngắn đến trung ngày, năng suất vượt trội (>2,0–2,5 tấn/ha), kháng bệnh hại chính và thích ứng rộng cho cả 3 vụ/năm tại Đồng bằng sông Hồng và Trung du miền núi phía Bắc?

• Giả thuyết khoa học 1 ($H_1$): Xử lý đột biến thực nghiệm bằng bức xạ ion hóa tia Gamma $^{60}\text{Co}$ ở dải liều lượng 150–180 Gy trên hạt khô kết hợp chỉ thị phân tử RAPD cho phép phá vỡ liên kết gen chặt, tạo nguồn vật liệu đột biến mang các tính trạng nông sinh học quý và thiết lập khoảng cách di truyền tin cậy phục vụ lai tạo.
• Giả thuyết khoa học 2 ($H_2$): Các dòng con lai phân ly từ tổ hợp lai định hướng giữa nguồn gen đột biến triển vọng (DT2008) và các giống đậu tương thích nghi (DT99, DT84) khi được chọn lọc qua phương pháp phả hệ (Pedigree method) từ thế hệ $F_2$ đến $F_8$ sẽ phân lập được các giống thuần (DT2010, DT2012) có tính ổn định cao, phá vỡ tính cách vụ và chịu được áp lực sinh thái phức tạp của các tỉnh phía Bắc.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên Di truyền học số lượng (Quantitative Genetics), Lý thuyết đột biến thực nghiệm bằng bức xạ ion hóa (Radiation Mutagenesis Theory) và Sinh học phân tử quần thể (Molecular Population Genetics). Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ 12/2010 đến 12/2014 (kế thừa các chuỗi dữ liệu chọn lọc đột biến từ năm 2003) tại các điểm thí nghiệm trọng điểm thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Cổ Nhuế, Song Phượng – Hà Nội) cùng hệ thống khảo nghiệm sinh thái đa điểm tại Hà Giang, Phú Thọ, Thái Nguyên.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương trên thế giới đã trải qua nhiều giai đoạn phát triển từ thuần hóa, nhập nội, lai tạo hữu tính đến chọn giống đột biến và công nghệ sinh học phân tử. Theo tổng kết của Whigham & Sham (1983), Bhatia et al. (2001), và Sleper & Poehlman (2006), năng suất đậu tương là một tính trạng số lượng phức tạp chịu sự kiểm soát của hệ thống đa gen (polygenic) và tương tác mạnh mẽ với môi trường ($G \times E$).

Trong lai hữu tính truyền thống, phương pháp lai luân phiên (Diallel cross) và lai quy tụ theo sơ đồ Mackey (1954) được áp dụng rộng rãi tại Úc và Mỹ nhằm tích lũy các alen có lợi quy định năng suất hạt (đạt 3,0–4,0 tấn/ha ở các giống Clark 63, Harosoy). Tuy nhiên, rào cản lớn nhất của lai hữu tính ở cây đậu tương là cấu tạo hoa nhỏ, nhị và nhụy tự thụ phấn trước khi nở hoa (cleistogamy), tỷ lệ rụng hoa sinh lý tự nhiên vượt quá 75% (Johnson & Bernard, 1976), và tỷ lệ đậu quả nhân tạo thành công ngoài đồng ruộng rất thấp, chỉ đạt 2–15% (Agrawal et al., 1988). Kỹ thuật lai không khử đực dựa trên đặc tính nhụy chín trước nhị (protogyny) do Talukdar et al. (2012) đề xuất đã nâng tỷ lệ đậu quả lên 39% và tỷ lệ cây lai $F_1$ đạt 72–78%, vượt trội so với phương pháp khử đực truyền thống (64% theo Vollmann et al., 2005).

Về đột biến thực nghiệm, thuyết tác động trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa (Ehrenberg et al., 1973; Nguyễn Hữu Đống et al., 1997) giải thích rằng tia Gamma phá hủy liên kết phosphodiester của ADN trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua hiện tượng xạ phân nước tạo gốc tự do ($\text{H}^+, \text{OH}^-, \text{H}_2\text{O}_2$), gây ra những biến đổi cấu trúc NST sâu sắc. Dữ liệu từ Cơ sở dữ liệu giống đột biến của FAO/IAEA ghi nhận trên thế giới có 58 giống đậu tương đột biến được phát triển, trong đó gần 90% được tạo ra bằng bức xạ ion hóa và hơn 64% từ tia Gamma.

• Tại Trung Quốc, hai giống đậu tương đột biến Henong và Tiefeng 18 được gieo trồng trên diện tích hơn 2,3 triệu ha; giống Lunxuan 1 đạt năng suất kỷ lục 5,97 tấn/ha (năm 2005).
• Tại Nhật Bản, kỹ thuật chiếu xạ tia X và Gamma đã chọn tạo thành công 16 giống đột biến thương phẩm; tiêu biểu là giống Ichihime bị bất hoạt hoàn toàn cả 3 enzyme lipoxygenase (L-1, L-2, L-3), loại bỏ mùi tanh đặc trưng để nâng cao chất lượng chế biến (Heppard, 1996; Nakagawa, 2008).
• Tại Thái Lan, chiếu xạ Gamma liều lượng 100–200 Gy trên giống Chiang Mai 60 và SJ4 đã cải thiện hàm lượng protein lên 40,3–41,9% và tăng tỷ lệ nảy mầm lên 75–89% (El-Bagoury et al., 2001; Yathaputanon et al., 2005).
• Tại Brazil, Tulmann Neto & Alves (1997) dùng liều 22 Krad Gamma $^{60}\text{Co}$ trên giống Paraná rút ngắn 10 ngày sinh trưởng; tại Iran, Hamzekhanlu et al. (2011) xử lý liều 150–250 Gy trên giống L17 làm tăng số lượng nốt sần từ 41–215%.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Đình Long (1991, 1996), Nguyễn Tấn Hinh & Vũ Tuyên Hoàng (1990), Mai Quang Vinh (2009) chứng minh rằng hiệu quả chọn lọc kiểu hình đạt mức rất cao đối với khối lượng 1000 hạt ($P_{1000}$) và số quả chắc/cây nhờ tác động cộng hợp của gen. Các giống đậu tương đột biến phóng xạ như DT84, DT90, DT95, DT99 (xử lý ở liều 150–180 Gy) đã đóng góp to lớn cho nông nghiệp nước nhà. Tuy nhiên, việc đánh giá đa dạng di truyền trước đây chủ yếu dựa vào hình thái nông học – vốn bị che lấp bởi tác động môi trường. Sự xuất hiện của chỉ thị phân tử RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) của Williams et al. (1990) và Welsh & McClelland (1990), sau đó được Chu Hoàng Mậu (2001), Đinh Thị Phòng & Ngô Thị Lam Giang (2008), Nguyễn Thị Lang et al. (2007) áp dụng tại Việt Nam, đã mở ra kỷ nguyên phân tích bộ genome ở cấp độ phân tử. Luận án đã định vị chính xác khoảng trống học thuật: tích hợp công nghệ đột biến phóng xạ $^{60}\text{Co}$ với đánh giá đa dạng di truyền phân tử bằng RAPD để thiết kế các tổ hợp lai bổ trợ chuẩn xác, khắc phục triệt để tính thoái hóa của nguồn giống cũ.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đã đóng góp sâu sắc vào hệ thống lý thuyết Di truyền học thực vật và Chọn giống cây trồng thông qua các khía cạnh:

1. Lý thuyết di truyền số lượng và tính trạng số lượng: Mở rộng nghiên cứu của Mather & Jinks (1982) và Falconer & Mackay (1996) trên đối tượng cây đậu tương tự thụ phấn trong điều kiện nhiệt đới gió mùa. Luận án lượng hóa chính xác mức độ ưu thế lai ($F_1$), hệ số di truyền theo nghĩa rộng ($H^2$), và tương quan kiểu gen – kiểu hình qua các thế hệ phân ly $F_2$, khẳng định tính trạng khối lượng 1000 hạt ($P_{1000}$) và số lóng/thân chịu sự kiểm soát chủ đạo của hiệu ứng gen cộng hợp (additive effect), trong khi số quả chắc/cây và năng suất cá thể chịu tác động vượt trội của hiệu ứng không cộng hợp (non-additive/epistasis).
2. Lý thuyết phát sinh đột biến nhân tạo (Mutation Induction Theory): Xác lập biên độ liều lượng bức xạ Gamma $^{60}\text{Co}$ tối ưu (180 Gy) cho các giống đậu tương bản địa và nhập nội tại Việt Nam. Luận án cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tần số và phổ biến dị ở các thế hệ $M_1$–$M_3$, chứng minh rằng xử lý bức xạ ion hóa hạt khô có thể tạo ra các đột biến chín sớm, phân cành thấp, kháng tách quả và kháng nấm bệnh mà không làm suy thoái tiềm năng sinh khối tổng thể.
3. Mô hình tương tác Kiểu gen $\times$ Môi trường ($G \times E$ Interaction): Bổ sung luận cứ khoa học vào mô hình thích nghi của Eberhart & Russell (1966), chỉ ra rằng tính ổn định kiểu hình về thời gian sinh trưởng (TGST 80–90 ngày cho vụ Đông và 95–110 ngày cho vụ Xuân/Hè) là yếu tố quyết định hàng đầu đối với tính ổn định năng suất hạt trong điều kiện biến thiên nhiệt độ và quang chu kỳ khắc nghiệt ở miền Bắc.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên hoàn 4 trụ cột phương pháp luận:

• Trụ cột 1 – Tạo nguồn biến dị đột biến: Chiếu xạ thực nghiệm tạo bước nhảy vọt về biến dị di truyền, thu nhận dòng đột biến thuần 01HC45 (tiền thân giống DT2008).
• Trụ cột 2 – Định lượng đa dạng di truyền phân tử: Sử dụng chỉ thị RAPD ngẫu nhiên 10-mer, tính toán hệ số tương đồng di truyền Nei & Li (1979) và thiết lập cây phân loại phát sinh chủng loại UPGMA để lựa chọn cặp bố mẹ có khoảng cách di truyền tối ưu.
• Trụ cột 3 – Di truyền phả hệ lai có định hướng: Lai các bố mẹ bổ trợ tính trạng, phân tích phân ly di truyền Menđen ($\chi^2$), mức độ trội ($D$), hệ số di truyền ($H^2$), và chọn lọc liên tục từ $F_2$ đến $F_8$.
• Trụ cột 4 – Đánh giá tính ổn định sinh thái: Khảo nghiệm đa môi trường (vụ Xuân, Hè, Đông; vùng đồng bằng và miền núi) để xác định chỉ số thích nghi ($b_i$) và độ lệch ổn định ($S^2_{di}$).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ nghiêm ngặt quan điểm thực chứng (Positivism) kết hợp thiết kế nghiên cứu thực nghiệm đồng ruộng đa nhân tố và phân tích sinh học phân tử trong phòng thí nghiệm. Thiết kế nghiên cứu đa tầng (Multi-level design) được bố trí khoa học:

• Cấp độ phân tử: Phân tích đa hình ADN của 10 mẫu giống đậu tương đại diện.
• Cấp độ cá thể và quần thể: Đánh giá các thế hệ đột biến $M_1$–$M_{13}$ và các thế hệ con lai $F_1$–$F_8$.
• Cấp độ hệ sinh thái nông nghiệp: Khảo nghiệm so sánh sơ bộ, khảo nghiệm sản xuất tại 4 vùng sinh thái trọng điểm (Hà Nội, Hà Giang, Phú Thọ, Thái Nguyên).

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Phương pháp xử lý đột biến phóng xạ: Chiếu xạ tia Gamma $^{60}\text{Co}$ trên nguồn hạt khô (độ ẩm 12–13%) tại Viện Di truyền Nông nghiệp ở các mức liều 100 Gy, 150 Gy, 180 Gy. Quần thể $M_1$ được gieo cấy vụ Đông 2003, tiến hành chọn lọc các cá thể đột biến chín sớm (C1, C2) ở thế hệ $M_2$ (vụ Xuân 2004) và duy trì chọn lọc dòng thuần phả hệ liên tục từ $M_2$ đến $M_{10}$ (2003–2006).
2. Quy trình phân tích chỉ thị phân tử RAPD:
   • Tách chiết ADN tổng số từ lá non bánh tẻ theo quy trình CTAB cải tiến.
   • Kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng ADN bằng đo mật độ quang học phổ kế (tỷ lệ $OD_{260}/OD_{280}$ đạt 1,8–2,0) và điện di kiểm chứng trên gel agarose 0,8%.
   • Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại với bộ mồi ngẫu nhiên 10-mer (Operon Technologies) trên máy luân nhiệt (Thermal Cycler). Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu ở 94°C (4 phút); 40 chu kỳ gồm biến tính 94°C (1 phút), gắn mồi 36°C (1 phút), kéo dài 72°C (2 phút); kéo dài kết thúc ở 72°C (7 phút).
   • Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5–2,0% trong đệm TAE $1\times$, nhuộm Ethidium Bromide và chụp ảnh gel dưới ánh sáng tia tử ngoại (UV transilluminator).
3. Quy trình lai hữu tính và chọn lọc:
   • Thực hiện phép lai vụ Xuân 2009 tại khu thí nghiệm Cổ Nhuế – Hà Nội giữa giống mẹ mang gen đột biến DT2008 với các giống bố DT99, DT84.
   • Khử đực vào buổi chiều (15h30–17h30) trên các nụ hoa đạt tiêu chuẩn (cánh hoa bắt đầu hé lộ màu) và thụ phấn bổ sung vào sáng sớm hôm sau (6h30–8h30).
   • Thu hoạch hạt lai $F_1$, gieo trồng đánh giá ưu thế lai vụ Hè 2009; gieo quần thể $F_2$ vụ Đông 2009 để đánh giá quy luật phân ly tính trạng. Chọn lọc cá thể ưu tú theo phương pháp phả hệ (Pedigree breeding) từ $F_3$ đến $F_7$ và đưa vào so sánh sơ bộ ở $F_8$ (năm 2011).
4. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng: Thí nghiệm so sánh giống bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần nhắc lại. Diện tích ô thí nghiệm: $10\text{ m}^2$ (khảo nghiệm sơ bộ) và $50\text{–}100\text{ m}^2$ (thử nghiệm sản xuất). Mật độ gieo trồng: 35–40 cây/$\text{m}^2$ (vụ Xuân/Hè) và 45–50 cây/$\text{m}^2$ (vụ Đông).

Data và phân tích

• Đánh giá tính đa hình phân tử: Tính toán chỉ số đa hình thông tin (Polymorphic Information Content – PIC) theo công thức: $$\text{PIC}i = 1 - \sum{j=1}^{n} p_{ij}^2$$ Ma trận khoảng cách và tương đồng di truyền được thiết lập bằng hệ số Nei & Li (1979) thông qua phần mềm NTSYS-pc (version 2.1), xây dựng sơ đồ phân nhánh (dendrogram) theo thuật toán UPGMA.
• Xử lý số liệu sinh học và di truyền:
  • Kiểm định độ phù hợp phân ly Menđen bằng chuẩn $\chi^2$ (Chi-square test): $$\chi^2 = \sum \frac{(O - E)^2}{E}$$
  • Mức độ trội ($D$) tính theo công thức của Mather: $$D = \frac{F_1 - \text{MP}}{\text{HP} - \text{MP}}$$ (Trong đó $F_1$ là giá trị con lai, $\text{MP}$ là trung bình bố mẹ, $\text{HP}$ là giá trị bố hoặc mẹ cao hơn).
  • Hệ số di truyền nghĩa rộng ($H^2$): $$H^2 = \frac{V_{F2} - \sqrt{V_{P1} \cdot V_{P2}}}{V_{F2}} \times 100%$$
  • Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định sai khác trung bình bằng phép thử Duncan/LSD ($p < 0,05$ và $p < 0,01$) trên phần mềm thống kê sinh học IRRISTAT 5.0 và SAS 9.1.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Hiệu quả phát sinh đột biến ở liều 180 Gy Gamma $^{60}\text{Co}$: Xử lý đột biến trên nguồn gen gốc đã tạo ra dòng đột biến thuần 01HC45 ở thế hệ $M_{10}$ (được đặt tên chính thức là DT2008). Dòng này mang đột biến rút ngắn thời gian sinh trưởng (88–92 ngày), dạng hình thân đứng, khả năng phân cành cấp 1 đạt 2,8–3,2 cành/cây, số quả chắc đạt 38,5–45,2 quả/cây, khối lượng 1000 hạt đạt 165–175g, tiềm năng năng suất đạt 2,2–2,8 tấn/ha, chống đổ ngã và kháng bệnh gỉ sắt vượt trội so với giống gốc.

"Giống DT2008 được chọn tạo bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co60 liều lượng 180 Gy trên hạt khô... có thể gieo trồng 3 vụ/năm (xuân, hè và đông) ở các tỉnh phía Bắc, thích ứng rộng trong các vùng trồng đậu tương cả nước so với giống gốc" (Trang 34, Luận án).

2. Cấu trúc đa dạng di truyền phân tử qua chỉ thị RAPD: Phân tích 10 giống đậu tương bằng bộ mồi RAPD ngẫu nhiên đã phát hiện tính đa hình cao với tỷ lệ các phân đoạn ADN đa hình đạt từ 65–75%, chỉ số PIC dao động từ 0,35 đến 0,68. Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu giống nghiên cứu dao động trong khoảng $r = 0,64\text{–}0,98$. Sơ đồ hình cây UPGMA đã phân chia 10 giống thành các nhóm rõ rệt, trong đó giống DT2008 có mức độ sai khác di truyền di truyền đủ lớn với DT99 và DT84, tạo cơ sở khoa học chính xác cho việc thiết lập các tổ hợp lai định hướng.

"Chỉ thị RAPD có khoảng cách di truyền lớn với hệ số tương quan r = 0,64 – 0,98 và sự tương quan trong nhóm là rất cao (0,77)... là cơ sở cho các nhà chọn tạo giống đậu tương lựa chọn tổ hợp lai có định hướng bằng phân tích, đánh giá tính trạng kiểu hình kết hợp với đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử" (Trang 27-28 & Ý nghĩa khoa học, Luận án).

3. Quy luật di truyền và mức độ phân ly tính trạng ở $F_1$ và $F_2$:

   • Các tính trạng chất lượng (màu hoa, màu lông, màu vỏ quả, màu rốn hạt) phân ly ở thế hệ $F_2$ hoàn toàn phù hợp với định luật phân ly độc lập của Menđen theo tỷ lệ 3 trội : 1 lặn với giá trị $\chi^2 < \chi^2_{0,05} = 3,84$ ($p > 0,05$).
   • Tính trạng số lượng ở thế hệ $F_1$ biểu hiện ưu thế lai cao về chiều cao thân ($D = 0,65\text{–}0,82$), số đốt/thân ($D = 0,45\text{–}0,60$) và năng suất cá thể ($D = 0,72\text{–}0,95$).
   • Hệ số di truyền nghĩa rộng ($H^2$) ở thế hệ $F_2$ phân hóa rõ rệt: tính trạng khối lượng 1000 hạt đạt $H^2 = 72,5\text{–}78,4%$ (chịu sự chi phối lớn của di truyền, hiệu quả chọn lọc sớm ở $F_2\text{–}F_3$ rất cao), trong khi số quả chắc/cây đạt $H^2 = 45,2\text{–}52,6%$ (cần chọn lọc duy trì qua nhiều thế hệ $F_4\text{–}F_6$).

4. Chọn tạo thành công giống đậu tương DT2010: Chọn lọc phả hệ từ tổ hợp lai DT2008 $\times$ DT99 đã tạo ra giống DT2010 mang các đặc tính đột phá: TGST cực ngắn (82–88 ngày trong vụ Đông, 88–92 ngày trong vụ Xuân), cây cao 45–55 cm, phân cành gọn, đóng quả tập trung, tỷ lệ quả 3 hạt đạt 22–26%, khối lượng 1000 hạt đạt 160–170g, năng suất thực thu đạt 2,0–2,4 tấn/ha (vượt đối chứng DT84 từ 15–20%), nhiễm rất nhẹ bệnh gỉ sắt và sương mai (điểm 1–2). Đặc biệt phù hợp cho công thức luân canh "2 lúa + 1 đậu tương đông" tại Đồng bằng sông Hồng.

"Giống đậu tương DT2010 với ưu điểm về thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất khá và ổn định, thích ứng rộng, trồng được 3 vụ/năm, nhiễm nhẹ một số bệnh hại chính (gỉ sắt, phấn trắng, sương mai), thích hợp gieo trồng vụ Xuân và vụ Đông trên đất sau 2 lúa vùng Đồng bằng sông Hồng" (Trang 4, Luận án).

5. Chọn tạo thành công giống đậu tương DT2012: Phân lập từ tổ hợp lai DT2008 $\times$ DT84, giống DT2012 thuộc nhóm trung ngày (95–105 ngày), sinh trưởng vô hạn thiên hữu hạn, thân cứng chống đổ ngã cấp 1, bộ lá xanh đậm bền bỉ, khả năng tạo nốt sần mạnh, số quả chắc/cây đạt 45–58 quả, khối lượng 1000 hạt đạt 175–190g, năng suất thực nghiệm đạt 2,4–2,9 tấn/ha (tại Hà Giang đạt 1,8–2,2 tấn/ha, cao hơn giống địa phương 50–70%), chống chịu tốt với điều kiện hạn rét đầu vụ Xuân và hạn cuối vụ Hè thu trên đất dốc.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết di truyền: Chứng minh sự kết hợp giữa đột biến phóng xạ $^{60}\text{Co}$ và lai tích lũy có thể dung hòa được hai tính trạng vốn tương quan nghịch là thời gian sinh trưởng ngắn và năng suất hạt cao.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình ứng dụng song song chỉ thị phân tử RAPD và khảo nghiệm kiểu hình đồng ruộng để rút ngắn chu kỳ chọn tạo dòng thuần từ 10 năm xuống còn 6–7 năm.
• Về mặt thực tiễn canh tác: Mở rộng biên độ gieo trồng đậu tương vụ Đông tại miền Bắc. Giống DT2010 giúp nông dân thu hoạch trước ngày 25–30/12, giải quyết triệt để rủi ro rét đậm và mưa phùn gió mùa Đông Bắc tháng 1. Giống DT2012 tạo đột phá cho vùng cao Hà Giang, thay thế các giống thoái hóa trên đất nương rẫy và đất ruộng 1 vụ.
• Về mặt chính sách nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để Bộ Nông nghiệp & PTNT triển khai Quyết định chuyển đổi cơ cấu cây trồng trên đất lúa giai đoạn 2014–2020, hiện thực hóa mục tiêu chuyển đổi 60 nghìn ha tại Đồng bằng sông Hồng và 57 nghìn ha tại Trung du miền núi phía Bắc sang trồng đậu tương.

Limitations và Future Research

1. Hạn chế về chỉ thị phân tử: Kỹ thuật RAPD sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên 10-mer có tính lặp lại (reproducibility) nhạy cảm với nồng độ khuôn ADN và nhiệt độ gắn mồi so với các chỉ thị phân tử thế hệ mới như SSR (Simple Sequence Repeat) hoặc SNP (Single Nucleotide Polymorphism).
2. Giới hạn sinh thái cực đoan: Các dòng giống mới dù có tính thích ứng rộng nhưng khi gặp nhiệt độ rét đậm kéo dài dưới 10°C ở giai đoạn cây con vụ Xuân hoặc nắng nóng gay gắt trên 40°C kết hợp khô hạn ở giai đoạn nở hoa vụ Hè vẫn bị suy giảm tỷ lệ đậu hạt khoảng 12–18%.
3. Định hướng nghiên cứu tương lai:
   • Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gen (Marker-Assisted Selection – MAS) và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) để lập bản đồ QTL kiểm soát tính trạng kháng bệnh gỉ sắt (Rpp1–Rpp5) và chịu hạn.
   • Sử dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để bất hoạt các gen mã hóa enzyme Lipoxygenase (Lox1, Lox2, Lox3), tạo giống đậu tương chất lượng cao không mùi phục vụ công nghiệp sữa đậu nành.
   • Nghiên cứu hoàn thiện quy trình thâm canh tích hợp phân bón vi sinh cố định đạm và chế phẩm đối kháng sinh học cho giống DT2010 và DT2012 trên đất dốc xói mòn.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Kết quả của luận án là nguồn dữ liệu tham khảo kinh điển cho các viện nghiên cứu (Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) và các trường đại học khối Nông – Lâm – Sinh học; mở ra hướng tiếp cận kết hợp đột biến – phân tử trong cải tiến di truyền cây họ đậu.
• Chuyển đổi kinh tế nông nghiệp: Việc đưa 2 giống DT2010 và DT2012 vào sản xuất đại trà tại các tỉnh Hà Nội, Hà Giang, Phú Thọ, Thái Nguyên giúp nâng cao năng suất trung bình toàn vùng từ 1,15–1,40 tấn/ha lên 2,0–2,5 tấn/ha (tăng giá trị kinh tế 30–45% trên một đơn vị diện tích).
• Ý nghĩa an ninh lương thực và môi trường: Góp phần giảm áp lực nhập siêu đậu tương hàng trăm triệu USD mỗi năm, đồng thời thúc đẩy hệ thống canh tác bền vững nhờ khả năng tích lũy 40–60 kg N/ha tồn dư sinh học cho vụ lúa/ngô kế tiếp.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên: Tiếp cận hệ thống dẫn liệu thực nghiệm bài bản về quy luật di truyền số lượng, xử lý đột biến bức xạ và phân tích đa dạng di truyền RAPD trên cây đậu tương.
• Nhà chọn tạo giống cây trồng (Breeders): Sở hữu nguồn vật liệu khởi đầu quý giá gồm dòng đột biến thuần DT2008 và các tổ hợp lai phân ly mang tổ hợp gen năng suất cao, chống chịu tốt.
• Nông dân và Hợp tác xã nông nghiệp: Tiếp cận bộ giống DT2010 và DT2012 ngắn ngày, năng suất ổn định, ít sâu bệnh, tối ưu hóa cơ cấu quay vòng đất (3 vụ/năm) để tăng thu nhập.
• Cơ quan quản lý nông nghiệp (Bộ NN&PTNT, Sở NN&PTNT các tỉnh phía Bắc): Có luận cứ khoa học thực tiễn để xây dựng quy hoạch vùng sản xuất đậu tương tập trung và chính sách trợ giá giống.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Trả lời: Luận án đã phát triển thành công mô hình tích hợp giữa lý thuyết đột biến phóng xạ ion hóa ($^{60}\text{Co}$) và di truyền số lượng Menđen trên cây đậu tương tự thụ phấn. Luận án chứng minh liều lượng bức xạ 180 Gy trên hạt khô tạo ra đột biến có lợi về dạng hình và tính chống chịu, đồng thời xác lập giá trị hệ số di truyền $H^2$ của khối lượng 1000 hạt đạt trên 72%, chứng minh hiệu quả chọn lọc kiểu hình vượt trội ở các thế hệ sớm $F_2\text{–}F_3$.

2. Cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây thể hiện như thế nào? Trả lời: So với các nghiên cứu truyền thống của Trần Đình Long (1991) chỉ dựa vào phân loại hình thái hoặc nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu (2001) chỉ dừng lại ở phân tích đa hình RAPD đơn lẻ, luận án đã thiết lập quy trình khép kín: dùng RAPD để lượng hóa khoảng cách di truyền ($r = 0,64\text{–}0,98$) nhằm định hướng cặp lai bố mẹ $\rightarrow$ kiểm định phân ly Menđen ($\chi^2$) ở $F_2$ $\rightarrow$ chọn lọc phả hệ đến $F_8$ $\rightarrow$ khảo nghiệm thích nghi đa môi trường theo mô hình Eberhart & Russell.

3. Phát hiện bất ngờ nhất về mặt dữ liệu thực nghiệm là gì? Trả lời: Giống đột biến DT2008 khi lai với DT99 tạo ra con lai $F_1$ biểu hiện mức độ trội ($D$) vượt bậc về năng suất cá thể ($D = 0,72\text{–}0,95$) và cho ra dòng DT2010 có thời gian sinh trưởng rút ngắn chỉ còn 82–88 ngày trong vụ Đông nhưng năng suất không hề suy giảm (đạt 2,0–2,4 tấn/ha), phá vỡ quy luật tương quan thuận thông thường giữa độ dài sinh trưởng sinh dưỡng và tích lũy chất khô ở đậu tương.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân giống và bảo tồn chuẩn xác không? Trả lời: Có. Luận án chi tiết hóa quy trình nhân giống tác giả và siêu nguyên chủng qua 4 bước: duy trì dòng thuần phả hệ, đánh giá độ thuần đồng ruộng, loại bỏ cây phân ly/dị hình trước trổ hoa, và bảo quản hạt giống ở ẩm độ an toàn <12% nhằm ngăn chặn hiện tượng thoái hóa giống do tự thụ tích lũy đột biến lặn có hại.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo từ kết quả luận án được định hình ra sao? Trả lời: Định hướng mở rộng gồm: (1) Ứng dụng chỉ thị SSR/SNP để lập bản đồ gen kháng bệnh gỉ sắt; (2) Lai chuyển gen hoặc chỉnh sửa gen chất lượng hạt (loại bỏ enzyme Lipoxygenase); (3) Xây dựng mạng lưới khảo nghiệm sản xuất quy mô công nghiệp tại 14 tỉnh Trung du miền núi phía Bắc và Đồng bằng sông Hồng.

Kết luận

1. Tạo lập nguồn vật liệu đột biến quý giá: Đã xác lập liều lượng chiếu xạ Gamma $^{60}\text{Co}$ 180 Gy tối ưu, chọn tạo thành công dòng đột biến thuần 01HC45 (giống DT2008) với nhiều đặc tính nông sinh học vượt trội làm vật liệu khởi đầu cho công tác lai tạo.
2. Định lượng đa dạng di truyền bằng RAPD: Phân tích thành công cấu trúc di truyền của 10 mẫu giống đậu tương đại diện, xác định hệ số tương đồng di truyền $r = 0,64\text{–}0,98$ và xây dựng cây phân loại UPGMA, tạo nền tảng chính xác cho việc thiết kế các tổ hợp lai định hướng.
3. Làm sáng tỏ quy luật di truyền tính trạng: Xác nhận quy luật phân ly Menđen 3:1 đối với các tính trạng màu sắc hoa, lông, quả, hạt ở thế hệ $F_2$; xác định tính trạng khối lượng 1000 hạt có hệ số di truyền cao ($H^2 > 72%$) chịu sự kiểm soát của gen cộng hợp.
4. Phát triển thành công giống đậu tương DT2010: Giống có TGST ngắn (82–88 ngày), năng suất đạt 2,0–2,4 tấn/ha, nhiễm nhẹ bệnh hại chính, giải quyết triệt để bài toán bố trí cây đậu tương vụ Đông sau 2 vụ lúa tại Đồng bằng sông Hồng.
5. Phát triển thành công giống đậu tương DT2012: Giống trung ngày (95–105 ngày), tiềm năng năng suất cao (2,4–2,9 tấn/ha), thích ứng rộng trên cả đất nương rẫy vùng cao và đất bãi đồng bằng, chịu hạn rét tốt, chống đổ ngã vượt trội.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng đột phá: Khởi xướng chương trình chọn giống đậu tương đa vụ cho miền Bắc; kết hợp công nghệ sinh học phân tử với phương pháp chọn giống đột biến truyền thống; đóng góp thiết thực vào chiến lược tái cơ cấu ngành trồng trọt và an ninh nguyên liệu thực phẩm quốc gia.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1. Cơ sở khoa học của đề tài 1. Cơ sở khoa học của lai hữu tính trong chọn tạo giống đậu tương Lai hữu tính là phương pháp chủ yếu trong công tác chọn tạo giống đậu tương hiện nay. Đó là việc lai 2 cá thể có tính di truyền khác nhau, phối hợp tính trạng của 2 giống và chọn lọc ra những cây mang đặc tính mong muốn của cả 2 bố mẹ thông qua tái tổ hợp trong quá trình phân ly ở đời con cháu (Trần Đình Long và cs.

Ở đậu tương, do kích thước hoa nhỏ và điều kiện môi trường ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa để lai nên các kỹ thuật lai khác nhau đã được phát triển. Kỹ thuật lai phổ biến được các nhà chọn giống sử dụng là khử đực ở hoa cái trước khi thụ phấn vào buổi chiều hôm trước và thụ phấn vào buổi sáng ngày hôm sau. Một số nhà chọn giống sử dụng kỹ thuật khử đực và thụ phấn cùng lúc. Cả hai kỹ thuật này đều đòi hỏi kỹ năng lai tốt để giảm tối đa việc gây ra những tổn thương nhất định trong quá trình lai.

Một kỹ thuật khác cũng được sử dụng trong lai tạo ở đậu tương là thụ phấn không cần khử đực. Kỹ thuật này được phát triển dựa trên đặc tính sinh vật học của hoa đậu tương là có nhụy chín trước nhị và đầu nhụy trở nên dễ tiếp nhận hạt phấn 1 ngày trước khi tung phấn, trong khi đó hạt phấn có thể nảy mầm trong vòng 24 giờ sau thụ phấn. Ưu điểm của kỹ thuật này là hạn chế tối đa việc gây ra những tổn thương cho hoa trong quá trình lai và được khẳng định mang lại hiệu quả lai cao với tỉ lệ đậu quả lên đến 39% và tỷ lệ cây lai F1 đạt được lên đến 72 – 78% (Talukdar và cs., 2012), cao hơn phương pháp lai truyền thống chỉ đạt 64% tỷ lệ cây lai F1 (Vollmann và cs. Hạn chế của phương pháp là phải xác định được chính xác nụ hoa lai sẽ nở vào ngày hôm sau nếu không hạt lai thu được sẽ là hạt tự thụ và điều kiện thời tiết thuận lợi đảm bảo cho hạt phấn nảy mầm.

Tuy nhiên thành công của phép lai phụ thuộc vào cả hai yếu tố khoa học và kỹ năng bao gồm bản chất loài cây trồng, mùa vụ, tình hình sinh trưởng của cây, điều kiện thời tiết, giống bố, mẹ…. Theo nhiều công bố, sự thành công của phương pháp lai hữu tính ở cây họ đậu trong đó có đậu tương là rất thấp so với nhóm ngũ cốc. Một trong những nguyên nhân chính là do hiện tượng rụng hoa sinh lý ở nhóm 5 cây trồng này. Ở đậu tương, tỷ lệ thành công của phép lai nhân tạo là rất thấp, dao động từ 2 – 15% trong điều kiện đồng ruộng (Agrawal và cs.

Thời gian tiến hành lai thay đổi theo mùa trồng và điều kiện thời tiết. Ở mùa nóng, có thể tiến hành lai từ 8 giờ 30 – 10 giờ 30 sáng. Ở mùa lạnh, do nhiệt độ thấp, quá trình nở hoa và tung phấn muộn hơn từ 0,5 – 1 giờ. Sự thành công của phép lai ở mùa đông thấp hơn so với những mùa khác do nhiệt độ thấp với độ dài ngày ngắn hơn làm cho quá trình thụ phấn xảy ra trước khi hoa nở.

Mục tiêu của lai tạo trước đây là tạo ưu thế lai ở những cây trồng giao phấn. Song, ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học nó đã được ứng dụng với cả cây trồng tự thụ phấn như ở lúa. Ở đậu tương, cho đến nay ưu thế lai vẫn chưa được áp dụng và mục tiêu của lai tạo giống đậu tương là nhằm tổ hợp các tính trạng mong muốn của hai hay nhiều giống (dòng) khác nhau để tạo ra một giống mới đáp ứng với đòi hỏi cụ thể của thực tế sản xuất như tạo giống chống chịu sâu bệnh, TGST ngắn, năng suất cao… (Trần Đình Long và cs. Vì vậy, việc lựa chọn bố mẹ để tạo quần thể chọn lọc là một trong những khâu quan trọng nhất mang lại thành công trong chọn tạo giống đậu tương bằng phương pháp lai hữu tính.

Quá trình chọn bố mẹ phụ thuộc vào mục tiêu chọn giống trên cơ sở bổ sung cho nhau (điểm yếu của một bố mẹ này được bổ sung bằng bố mẹ kia). Có thể tìm sự bổ sung cho một số tính trạng thông qua các tính trạng nông học, hình thái, các đặc điểm sinh hóa hoặc chỉ thị phân tử (Vũ Đình Hòa và cs. Có 3 phương pháp lai tạo chính được sử dụng trong công tác lai tạo giống đậu tương là lai quy tụ, lai luân phiên và lai trở lại. - Phương pháp lai quy tụ: là phương pháp được ứng dụng phổ biến nhất bởi tính đơn giản của nó, sau này một số nhà chọn giống đưa ra các sơ đồ khác, có cải tiến và chỉnh lý thêm như sơ đồ của Mackey (1954) (Singh, 1990).

- Phương pháp lai luân phiên (lai diallel): là phương pháp tối ưu nhất, song cũng phức tạp nhất vì nó đòi hỏi số lượng cặp lai lớn, mất nhiều công và rất tốn kém (Singh, 1990). Dựa vào phương pháp này người ta có thể tiên đoán được một số kết quả của các cặp lai, đồng thời nó là cơ sở cho việc chọn các bố mẹ để lai, 6 giúp cho các nhà chọn giống định hướng trong khi lai. Ở Úc đã ứng dụng để tạo ra các giống đậu tương có năng suất cao (4 tấn/ha) và chống bệnh khá… - Phương pháp lai trở lại (backcross): Phương pháp này được dùng để duy trì khả năng cho năng suất của một số giống đã thích ứng tốt với việc sáp nhập thêm tính chống chịu từ bố (mẹ) không thích ứng (Singh, 1990). Phương pháp này được áp dụng chủ yếu để tạo giống đậu tương chống chịu (chống chịu sâu, bệnh hại, chống chịu điều kiện bất thuận như chịu hạn, chịu mặn…).

Hiện nay, trong lai tạo giống đậu tương người ta không dùng một phương pháp mà họ thường áp dụng kết hợp các phương pháp như trong lai tích lũy người ta thường kết hợp giữa lai trở lại với lai quy tụ để tạo giống đậu tương chống bệnh hoặc kết hợp lai trở lại với lai luân phiên để tạo giống đậu tương cao sản … 1. Cơ sở khoa học của xử lý đột biến thực nghiệm chiếu xạ trong tạo giống đậu tương Trong chọn giống cây trồng nói chung, cây đậu tương nói riêng, lai giống nhân tạo dù có tiềm năng vô hạn trong việc tạo ra các tổ hợp có đặc tính mới mà có thể được chọn lọc trong quần thể phân ly nhưng nó chỉ là sự phân bổ lại và tái tổ hợp nguồn gen sẵn có. Vấn đề là sự giới hạn nguồn gen trong tự nhiên và tỷ lệ đột biến tự nhiên rất thấp, chỉ khoảng 10-7. Ngược lại, phương pháp đột biến có thể cải tiến tính trạng đơn mà không gây ra sự tổn thương sâu trong bộ gen, đồng thời làm tăng nguồn tài nguyên di truyền cho lai giống nhân tạo và các biến dị di truyền mới có khả năng thích ứng tốt.

Đột biến là những biến đổi trong vật chất di truyền xảy ra ở cấp độ phân tử hay cấp độ tế bào (Nguyễn Minh Công, 2005). Đột biến thường xuất hiện gián đoạn, đột ngột về một hoặc một vài tính trạng nào đó trên cơ thể thực vật. Khi biểu hiện thành kiểu hình, đa số có hại, một số ít có lợi hoặc trung tính. Ở đậu tương, việc tạo ra các biến dị di truyền bằng phương pháp lai hữu tính là một quá trình khó vì hoa của chúng nhỏ, gây khó khăn trong quá trình khử đực vì các bộ phận của hoa dễ bị tổn thương và làm rụng hoa (>75%), thậm chí trong điều kiện thuận lợi (Johnson và Bornard, 1976).

Những hạn chế này cộng với tính tự thụ hoàn toàn tạo ra hạn chế trong đa dạng di truyền ở đậu tương. Do đó, chọn giống 7 bằng phương pháp đột biến trong đó có phương pháp chiếu xạ gamma Co60 đóng vai trò quan trọng trong cải tiến giống cây trồng này. Tia Gamma nguồn Co60 là tia phóng xạ có bước sóng ngắn từ 10-9 – 10-12 m, thuộc nhóm bức xạ sóng điện từ, đặc trưng bởi vận tốc lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch khỏi từ trường hay điện trường nên hiệu quả xuyên sâu cao. Tia Gamma không điện li trực tiếp mà có tác dụng điện li gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện.

Cơ chế tác động của tia gamma (Co60) lên vật chất di truyền ở các cấp độ khác nhau (phân tử, tế bào…) đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ cơ chế phát sinh đột biến. Bản chất cơ thể sinh vật là các chất hoặc hợp chất hóa học với các mối liên kết tinh tế, nhạy bén và đồng bộ. Bức xạ ion hóa bằng tia gamma tác động nhờ việc tạo nên các ion, đã phá hủy cục bộ hay toàn bộ các cấu trúc đó, gây rối loạn trong cấu trúc di truyền của sinh vật, làm chậm hay dừng phân bào, hạn chế hay làm sai lệch sự tái sinh ADN. Bức xạ gây hại lớn nhất khi nó tác động vào nhân tế bào nơi chứa phần lớn các gen NST quy định các đặc tính chủ yếu của sinh vật.

Cơ thể hoặc tế bào càng non thì tính mẫn cảm với bức xạ ion hóa càng cao (Nguyễn Hữu Đống và cs. Có nhiều giả thuyết giải thích cơ chế tác động của bức xạ ion hóa (trong đó có tia gamma) lên tế bào sống, trong đó thuyết hiện đại về tác động của phóng xạ lên vật chất di truyền được coi là phổ biến và hoàn thiện hơn cả bởi nó là sự kết hợp giữa 2 thuyết về cơ chế tác dụng trực tiếp và cơ chế tác dụng gián tiếp. Theo thuyết hiện đại, trong cơ thể có nhiều hợp chất hữu cơ ở dạng dung dịch, tùy theo trạng thái mà nồng độ của chúng cao hay thấp. Nếu nồng độ dung dịch của các hợp chất hữu cơ đó cao thì sự va chạm của các lượng tử vào các phân tử sẽ lớn và hiệu quả trực tiếp nhiều hơn (sự va chạm giữa các tia bức xạ ion hóa (các hạt cơ bản, các ion) với các đơn vị cảm ứng (gen, NST, các bào quan…).

Nếu nồng độ dung dịch của các hợp chất hữu cơ đó thấp sẽ gây ra hiện tượng xạ phân nước tạo ra các ion, gốc tự do (H+, OH-, H2O…) và các peroxyt hữu cơ, do đó chúng tác dụng gián tiếp lên vật chất di truyền, gây ra những biến đổi sơ cấp và thứ cấp ở tế bào sống.