Nghiên cứu hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh thực vật và vai trò kích kháng của chito oligosaccharide trên mô hình cây cà chua solanum lycopersicum

Nghiên cứu về chito-oligosaccharide, giải pháp tiềm năng kháng nấm bệnh thực vật. Tìm hiểu vai trò kích kháng trên cây cà chua (Solanum lycopersicum).

• Tác giả: Trịnh Thị Vân Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Hợp
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh thực vật và vai trò kích kháng của chito-oligosaccharide trên mô hình cây cà chua (Solanum lycopersicum)
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ
• 1.1. Thực trạng nấm gây bệnh thực vật
• 1.2. Nấm Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum gây bệnh thực vật
• 1.3. CƠ CHẾ KHÁNG BỆNH Ở THỰC VẬT
• 1.3.1. Cơ chế kháng thụ động
• 1.3.2. Rào cản vật lý
• 1.3.3. Rào cản hóa học
• 1.3.4. Cơ chế kháng chủ động
• 1.3.4.1. Elicitor-phân tử kích kháng thực vật
• 1.3.4.2. Phản ứng bảo vệ nhanh
• 1.3.4.3. Phản ứng bảo vệ chậm
• 1.4. Chitin, chitosan và COS
• 1.5. Các phương pháp sản xuất COS
• 1.6. ỨNG DỤNG CỦA COS TRONG KIỂM SOÁT BỆNH THỰC VẬT
• 1.6.1. Hoạt tính kháng trực tiếp đối với các vi sinh vật gây bệnh
• 1.6.2. Hoạt tính kháng nấm
• 1.6.3. Hoạt tính kháng vi khuẩn
• 1.6.4. Hoạt tính kháng virus
• 1.6.5. Hoạt tính kích kháng thực vật
• 1.6.6. Protein liên quan đến tính kháng (PR protein)
• 1.6.7. Các enzyme liên quan đến tính kháng
• 1.6.8. Một số hợp chất liên quan đến tính kháng của thực vật
• 1.6.9. Vai trò của COS với con đường truyền tín hiệu
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ CHITOSAN VÀ COS
• 1.8. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.1. Chủng vi sinh vật
• 1.8.2. Giống cây cà chua
• 1.8.3. Môi trường và hoá chất
• 1.8.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.4.1. Tuyển chọn các chủng nấm sợi và xạ khuẩn sinh chitinase
• 1.8.4.2. Phương pháp cấy trực tiếp
• 1.8.4.3. Phương pháp định tính (khuếch tán trên đĩa thạch)
• 1.8.4.4. Phương pháp định lượng chitinase
• 1.8.4.5. Điện di chitinase trên gel hoạt tính
• 1.8.4.6. Định danh chủng vi sinh vật
• 1.8.4.6.1. Xác định đặc điểm hình thái
• 1.8.4.6.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
• 1.8.4.7. Điều chế COS từ chitosan
• 1.8.4.8. Phân tích mẫu COS bằng MS-TOF
• 1.9. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro
• 1.9.1. Đánh giá khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử nấm của COS
• 1.9.2. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm của COS
• 1.10. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vivo
• 1.10.1. Đánh giá khả năng kháng nấm của COS trên lá cây cà chua
• 1.10.2. Phương pháp nhuộm calcoflour
• 1.10.3. Phương pháp nhuộm trypan blue
• 1.11. Nghiên cứu khả năng kích kháng hệ thống trên mô hình cây cà chua
• 1.11.1. Phương pháp xác định hoạt độ phenylalanin ammonia lyase (PAL)
• 1.11.2. Phương pháp xác định hoạt độ polyphenol oxidase (PPO)
• 1.11.3. Phương pháp xác định hoạt độ lipoxygenase (LOX)
• 1.11.4. Phương pháp định lượng phenol tổng số
• 1.11.5. Phân tích sự biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-qPCR
• 1.11.6. Phân tích thống kê
• 2. CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. ĐIỀU CHẾ VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MẪU COS
• 2.1.1. Nghiên cứu điều chế COS
• 2.1.2. Sàng lọc và định danh chủng vi sinh vật sinh chitinase cao
• 2.1.3. Thu dịch chiết chitinase và điều chế COS
• 2.1.4. Thành phần mẫu COS
• 2.2. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM in vitro CỦA MẪU COS
• 2.2.1. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm B. cinerea in vitro của mẫu COS
• 2.2.2. Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm B.
• 2.2.3. Khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm B.
• 2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm F. oxysporum in vitro của mẫu COS
• 2.2.5. Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F.
• 2.2.6. Khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm F.
• 2.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM in vivo CỦA MẪU COS
• 2.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CỦA MẪU COS TRÊN MÔ HÌNH CÂY CÀ CHUA
• 2.4.1. Tác động của COS đối với các enzyme liên quan đến tính kháng
• 2.4.2. Tác động của COS đối với hoạt độ PAL
• 2.4.3. Tác động của COS đối với hoạt độ PPO
• 2.4.4. Tác động của COS đối với hoạt độ LOX
• 2.4.5. Tác động của COS đối với lượng phenol tổng số
• 2.4.6. Tác động của COS đối với sự biểu hiện của các PR gen
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Chito oligosaccharide COS Tổng quan và ứng dụng tiềm năng

Bệnh thực vật là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực toàn cầu, gây thiệt hại 20-40% năng suất cây trồng hàng năm. Trong đó, nấm chiếm 70-80% tác nhân gây bệnh. Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum là hai loại nấm gây hại nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cà chua. Để đối phó, thuốc bảo vệ thực vật hóa học được sử dụng rộng rãi, nhưng lại gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Do đó, xu hướng nông nghiệp xanh bền vững đang thúc đẩy việc tìm kiếm các giải pháp sinh học an toàn hơn. Chito-oligosaccharide (COS) nổi lên như một ứng cử viên tiềm năng. COS là một loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học hiệu quả, có khả năng kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh, an toàn và thân thiện với môi trường. Các nghiên cứu đã chứng minh COS có thể kiểm soát các loại nấm thuộc chi Fusarium, Rhizopus, Phythophthora, Botrytis, Alternaria. Hiệu quả của COS phụ thuộc vào mức độ polyme hoá (DP) và mức độ deacetyl hoá (DDA).

1.1. Nguồn gốc và đặc tính của Chito oligosaccharide COS

Chito-oligosaccharide (COS) có nguồn gốc từ chitin, một polymer tự nhiên dồi dào có trong vỏ các loài giáp xác như tôm, cua. Việt Nam là một trong những quốc gia hàng đầu về xuất khẩu tôm, tạo ra lượng phế phẩm lớn chứa chitin. Sử dụng phế phẩm này để sản xuất COS không chỉ giảm ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra sản phẩm giá trị cho nông nghiệp hữu cơ. COS có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh thực vật và an toàn cho môi trường. Việc điều chế COS từ chitin đòi hỏi các phương pháp thủy phân khác nhau. Trịnh Thị Vân Anh (2023) đã nghiên cứu điều chế COS từ nguồn vi sinh vật bản địa.

1.2. Vai trò của COS trong bảo vệ thực vật bền vững

COS đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật bền vững nhờ khả năng kiểm soát nấm bệnh mà không gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Theo xu hướng phát triển kinh tế xanh, COS là giải pháp phù hợp để phát triển nền nông nghiệp hữu cơ an toàn. Thị trường thuốc bảo vệ thực vật sinh học trên thế giới năm 2020 ước tính 4,3 tỷ USD và dự kiến tăng lên 8,5 tỷ USD năm 2025 với tốc độ tăng trưởng 14,7%. Chitosan và COS đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê duyệt cấp phép lưu hành.

II. Thách thức Nấm bệnh hại cà chua và giải pháp từ COS

Cà chua là một loại rau màu quan trọng trên toàn thế giới, với sản lượng hàng năm vượt quá 180 triệu tấn. Tuy nhiên, năng suất cà chua thường bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các bệnh do nấm gây ra. Botrytis cinerea gây ra bệnh thối xám, có thể gây chết non 70% số cây và gây thối quả trong và sau thu hoạch, thiệt hại ước tính từ 10 đến 100 tỷ USD mỗi năm. Fusarium oxysporum gây bệnh héo Fusarium, gây thiệt hại lớn cho nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cà chua. Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để kiểm soát các bệnh này có thể gây ra nhiều vấn đề về môi trường và sức khỏe. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả là vô cùng cần thiết. COS được xem là một giải pháp đầy hứa hẹn. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tối ưu hóa hiệu quả và mở rộng ứng dụng của COS trong bảo vệ cây trồng, đặc biệt là cà chua.

2.1. Các loại nấm bệnh gây hại cà chua phổ biến nhất

Botrytis cinerea gây bệnh thối xám là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất trên cà chua, gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả. Fusarium oxysporum gây bệnh héo Fusarium, làm cây bị héo rũ và chết. Các bệnh khác do nấm gây ra bao gồm bệnh mốc sương, bệnh đốm lá và bệnh thán thư. Việc nhận biết và phòng ngừa các bệnh này là rất quan trọng để bảo vệ năng suất cà chua. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO), 70-80% vi sinh vật gây bệnh thực vật là nấm.

2.2. COS như một giải pháp thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học

COS mang lại tiềm năng lớn để thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong việc kiểm soát nấm bệnh trên cà chua. COS có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và thân thiện với môi trường, không gây ra các tác dụng phụ tiêu cực như thuốc hóa học. COS có khả năng kích hoạt hệ miễn dịch của cây trồng, giúp cây tự bảo vệ mình trước sự tấn công của nấm bệnh. Hơn nữa, COS có thể được sản xuất từ phế phẩm nông nghiệp, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

III. Phương pháp Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của COS trên cà chua

Các nghiên cứu về hiệu quả của COS đối với bệnh hại cây trồng còn hạn chế. Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu đồng bộ ở mức độ in vitro, in vivo và phân tử về vai trò kiểm soát nấm gây bệnh và khả năng kích kháng của COS đối với cây trồng. Đặc biệt, những nghiên cứu về tính kháng của COS trên mô hình thực vật vẫn còn hạn chế. Luận án “Nghiên cứu hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh thực vật và vai trò kích kháng của chito-oligosaccharide trên mô hình cây cà chua” được thực hiện nhằm làm sáng tỏ vai trò của COS trong kiểm soát nấm bệnh. Mục tiêu nghiên cứu là điều chế COS bằng phương pháp thủy phân chitosan sử dụng enzyme chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa. Đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh và tính kích kháng trên mô hình cây cà chua của mẫu COS được tạo ra.

3.1. Điều chế COS bằng enzyme chitinase từ vi sinh vật bản địa

Nghiên cứu điều chế COS sử dụng chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa tại Việt Nam. Phân tích thành phần mẫu COS thu được. Enzyme chitinase có khả năng thủy phân chitin thành COS. Trịnh Thị Vân Anh (2023) đã tạo ra hai loại COS có thành phần oligo khác nhau với DP từ 2-10 bằng phương pháp thuỷ phân sử dụng chitinase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 (COSA) và nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103 (COSB).

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng nấm in vitro và in vivo của COS

Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro của mẫu COS đối với hai đối tượng nấm gây bệnh thực vật B. cinerea và F. oxysporum. Đánh giá khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử nấm và sự phát triển sợi nấm. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vivo của mẫu COS trên lá cây cà chua. Phương pháp nhuộm calcoflour và trypan blue được sử dụng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh.

IV. Kết quả COS kháng nấm và kích kháng cà chua hiệu quả

Kết quả nghiên cứu đã chứng minh COS có khả năng kháng nấm và kích kháng cà chua hiệu quả. COS ức chế sự nảy mầm và phát triển của cả B. cinerea và F. oxysporum in vitro. Trên lá cà chua, COS giảm thiểu sự lây nhiễm nấm bệnh. Hơn nữa, COS kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây cà chua, thể hiện qua việc tăng hoạt động của các enzyme liên quan đến tính kháng như phenylalanin ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), và lipoxygenase (LOX). Các nghiên cứu chỉ ra rằng COS có khả năng kháng hai đối tượng nấm gây bệnh thực vật B. cinerea và F. oxysporum, trong đó, COSA có khả năng kháng nấm B. cinerea tốt hơn COSB.

4.1. COS ức chế nấm bệnh in vitro và in vivo

COS thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh cả trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro) và trên cây trồng thực tế (in vivo). COS có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm, ngăn chặn quá trình xâm nhập và gây bệnh. COS cũng ức chế sự phát triển của sợi nấm, hạn chế sự lan rộng của bệnh. Các thí nghiệm trên lá cà chua cho thấy COS giúp giảm thiểu các triệu chứng bệnh do nấm gây ra.

4.2. COS kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây cà chua

COS kích thích cây cà chua sản xuất các enzyme phòng thủ như PAL, PPO, và LOX, giúp tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh. PAL tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất phenolic, có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm. PPO oxy hóa các hợp chất phenolic, tạo ra các chất độc đối với nấm bệnh. LOX tham gia vào quá trình tổng hợp jasmonic acid, một hormone thực vật quan trọng trong việc điều hòa phản ứng phòng thủ. Mức độ biểu hiện của các PR gen cũng tăng lên sau khi xử lý bằng COS.

V. Kích kháng cà chua Tác động của COS đến enzyme và gen

COS đã được chứng minh là có tác động đáng kể đến enzyme liên quan đến tính kháng của cà chua. Cụ thể, hoạt độ PAL, PPO, và LOX đều tăng lên sau khi xử lý bằng COS, cho thấy khả năng kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây. Bên cạnh đó, COS còn tác động đến sự biểu hiện của các PR gen (protein liên quan đến bệnh lý), những gen đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng bệnh của thực vật. Sự gia tăng biểu hiện của các PR gen cho thấy COS không chỉ kích hoạt các phản ứng sinh hóa mà còn tác động đến biểu hiện gen của cây trồng, giúp tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh.

5.1. Tác động của COS đối với hoạt động enzyme PAL PPO LOX

COS có khả năng kích thích hoạt động của các enzyme PAL, PPO, và LOX, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống phòng thủ của cây cà chua. PAL giúp tổng hợp các hợp chất phenolic, có tính kháng khuẩn và kháng nấm. PPO oxy hóa các hợp chất phenolic, tạo ra các chất độc đối với nấm bệnh. LOX tham gia vào quá trình tổng hợp jasmonic acid, một hormone thực vật quan trọng trong việc điều hòa phản ứng phòng thủ. Sự gia tăng hoạt động của các enzyme này cho thấy COS giúp cây cà chua tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh.

5.2. Ảnh hưởng của COS đến biểu hiện các gen PR PR 1 PR 2 PR 8

COS tác động đến biểu hiện của các gen PR (PR-1, PR-2, PR-8), những gen liên quan đến cơ chế kháng bệnh của thực vật. PR-1 là một protein liên quan đến bệnh lý có tác dụng kháng nấm. PR-2 là một glucanase, phân hủy thành tế bào nấm. PR-8 là một chitinase, phân hủy chitin trong thành tế bào nấm. Sự gia tăng biểu hiện của các gen PR này cho thấy COS không chỉ kích hoạt các phản ứng sinh hóa mà còn tác động đến biểu hiện gen của cây trồng, giúp tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh.

VI. Tương lai Ứng dụng COS và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế

Nghiên cứu về COS mở ra nhiều hướng ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp bền vững. Việc phát triển các chế phẩm COS hiệu quả, an toàn và thân thiện với môi trường có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của COS để tối ưu hóa hiệu quả sử dụng. Việc tìm hiểu về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của COS, như nồng độ, thời điểm và phương pháp ứng dụng, sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của COS trong bảo vệ cây trồng. Các nghiên cứu cần tiếp tục tập trung vào việc phát triển các phương pháp sản xuất COS hiệu quả, chi phí thấp và thân thiện với môi trường.

6.1. Phát triển các chế phẩm COS hiệu quả và bền vững

Việc phát triển các chế phẩm COS hiệu quả và bền vững có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong sản xuất nông nghiệp. Các chế phẩm COS nên được sản xuất từ nguồn nguyên liệu tái tạo, thân thiện với môi trường. Cần nghiên cứu để tối ưu hóa công thức và quy trình sản xuất COS nhằm đảm bảo hiệu quả kháng nấm và kích kháng cao nhất. Bên cạnh đó, cần có các nghiên cứu về độ ổn định và thời hạn sử dụng của các chế phẩm COS để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của COS

Để khai thác tối đa tiềm năng của COS, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của nó. Cần tìm hiểu về các thụ thể trên cây trồng nhận diện COS, các con đường tín hiệu được kích hoạt bởi COS, và các gen được điều hòa bởi COS. Việc hiểu rõ cơ chế tác động của COS sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả sử dụng, phát triển các chiến lược ứng dụng COS phù hợp với từng loại cây trồng và từng loại bệnh hại, và phát triển các loại COS mới với hiệu quả cao hơn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh thực vật do vi sinh vật gây ra là nguyên nhân gây tổn thất nghiêm trọng đối với ngành nông nghiệp toàn cầu. Theo số liệu của Savary và cộng sự (2019), các tác nhân gây hại làm suy giảm từ 20% đến 40% năng suất cây trồng hàng năm, trong đó nấm chiếm khoảng 70% đến 80% tổng số vi sinh vật gây bệnh theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO). Trong đó, loài nấm Botrytis cinerea (gây bệnh thối xám) có thể làm chết non tới 70% số cây cà chua và gây thiệt hại ước tính từ 10 đến 100 tỷ USD mỗi năm trên toàn thế giới; loài Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ mạch dẫn trên diện rộng. Nhằm kiểm soát các tác nhân này, lượng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã gia tăng liên tục (từ 3,08 triệu tấn năm 2000 lên 4,19 triệu tấn năm 2019 với chi phí 84,5 tỷ USD), kéo theo các hệ lụy về ô nhiễm môi trường và sức khỏe con người. Trong bối cảnh chuyển dịch sang nông nghiệp bền vững, các hợp chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên như chitosan và chito-oligosaccharide (COS) được xem là giải pháp thay thế phù hợp. Tại Việt Nam, nguồn phụ phẩm từ ngành chế biến tôm xuất khẩu (sản lượng 800.000–900.000 tấn/năm) chứa lượng chitin dồi dào (khoảng 15% trọng lượng), tạo tiềm năng nguyên liệu lớn cho sản xuất COS. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây về COS chủ yếu mới dừng lại trên các bộ phận thực vật tách rời (lá, quả dâu tây, nho) hoặc mô hình Arabidopsis, thiếu các nghiên cứu đồng bộ từ mức độ in vitro, in vivo đến mức độ phân tử trên cây trồng nguyên vẹn.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung:

1. Điều chế COS bằng phương pháp thuỷ phân chitosan sử dụng enzyme chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa tại Việt Nam;
2. Đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum của các mẫu COS được tạo ra;
3. Đánh giá vai trò kích kháng thực vật của mẫu COS trên mô hình cây cà chua (Solanum lycopersicum).

Đối tượng nghiên cứu của luận án bao gồm: các chủng nấm gây bệnh thực vật Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum; cây cà chua (Solanum lycopersicum); các chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 và nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103; enzyme chitinase và các chế phẩm oligo gồm COSA, COSB và polymer chitosan. Phạm vi không gian của nghiên cứu được triển khai tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) và Phòng Sinh học phân tử Thực vật, Khoa Khoa học Sự sống (Đại học Liège, Vương quốc Bỉ). Về thời gian, công trình gắn liền với việc thực hiện đề tài mã số QG.87 giai đoạn 2016–2019 và được hoàn thành vào năm 2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh học thực vật, cơ chế tự vệ của cây trồng và tiềm năng ứng dụng của chitosan/COS:

• Về tác nhân nấm gây bệnh và thiệt hại nông nghiệp: Tác giả phân tích hai nhóm nấm chính theo phương thức dinh dưỡng là nấm hoại sinh (necrotroph như B. cinerea, F. oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum) và nấm ký sinh (biotroph như Puccinia graminis, Blumeria graminis). Các dẫn chứng lịch sử và hiện đại được tổng hợp gồm: dịch hại Phytophthora infestans gây nạn đói khoai tây tại Ireland (1845–1852) theo công bố số [100]; dịch nấm cựa gà Claviceps purpurea [74]; và diễn biến của các chủng Fusarium cubense (nòi 1, nòi 2, nòi 4 cận nhiệt đới SR4 và nòi 4 nhiệt đới TR4) gây bệnh héo Panama trên chuối Cavendish [5, 92]. Tại Việt Nam, tác giả ghi nhận các thiệt hại do F. lycopersici trên cà chua, F. zingiberi gây mất mùa 100% diện tích gừng tại Quảng Nam năm 2000 [15], cùng các nghiên cứu phân bố nòi nấm của Cục Bảo vệ thực vật và Viện Nghiên cứu Rau quả.
• Về cơ chế kháng bệnh ở thực vật: Luận án điểm lại hệ thống phòng vệ thụ động gồm rào cản vật lý (biểu bì, vách tế bào như nghiên cứu trên Berberis julianae [155]) và rào cản hóa học chứa phytoanticipin (chất quinone như catechol, protocatechuic acid ở hành tây vỏ nâu [91, 145]). Về tính kháng chủ động, tác giả phân tích cơ chế nhận diện elicitor (không đặc hiệu từ vách tế bào Trichoderma [16] hoặc đặc hiệu gen từ sản phẩm gen avr [94, 164]), phản ứng bảo vệ nhanh qua tổng hợp phytoalexin [83, 101], phản ứng bảo vệ chậm qua hình thành tầng tế bào bần (cork layer) [2, 131], và hai con đường kháng hệ thống: kháng tập nhiễm (SAR) qua tín hiệu salicylic acid (SA) kích hoạt protein PR và enzyme phenylalanine ammonia lyase (PAL) [18]; kháng kích ứng (ISR) qua tín hiệu jasmonic acid (JA) và ethylene (ET) kích hoạt lipoxygenase (LOX), peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO) [36, 132].
• Về sản xuất và ứng dụng của COS: Các phương pháp cắt mạch chitosan gồm vật lý (siêu âm, vi sóng, tia gamma [124, 158, 160]), hóa học (acid vô cơ, H2O2 [53, 153]) và enzyme sinh học (chitinase, chitosanase [42, 102]). Các nghiên cứu về hoạt tính chitinase vi sinh vật được trích dẫn gồm Patil và cs. (2014) trên Penicillium ochrochloron MTCC 517 đạt 2443,23 U/g [89]; Loc và cs. (2020) trên Trichoderma asperellum PQ34 đạt 22 U/mL [66]; Du và cs. (2021) trên Paenibacillus sp. (30 kDa, pH 4,5, 50°C) [28]; Tsujibo và cs. (2003) trên Nocardiopsis prasina OPC-131 [152]; và Zhu và cs. (2007) trên Sphingomonas sp. [166]. Về hoạt tính sinh học, tác giả điểm lại các nghiên cứu của Meng và cs. (2010) [77], Romanazzi và cs. [112], Yoon và cs. [87], Rahman và cs. (2014, 2015) [106, 107], Liu và cs. [64] về khả năng kháng nấm phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa (DDA) và mức độ polymer hóa (DP 23–40 cho hoạt tính cao); các nghiên cứu kháng khuẩn [71], kháng virus khảm thuốc lá TMV [24, 41]; cùng các công trình về thụ thể CEBiP, CERK1, LYP4, LYP6 ở lúa và Arabidopsis [43, 62, 130], nghiên cứu của Petutschnig [93], Povero [99] và Hadwiger [35].

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định giải quyết là: Sàng lọc các chủng vi sinh vật bản địa của Việt Nam có khả năng sinh enzyme chitinase cao để thủy phân tạo chế phẩm COS có phân bố DP xác định (DP 2–10); đồng thời đánh giá toàn diện cả hoạt tính ức chế nấm trực tiếp (in vitro, in vivo) và cơ chế kích kháng gián tiếp trên mô hình cây cà chua thông qua việc định lượng các enzyme phòng vệ (PAL, PPO, LOX), hàm lượng phenol tổng số và mức độ phiên mã các gen PR-1, PR-2, PR-8.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Chitin là polymer sinh học mạch thẳng cấu tạo từ các đơn phân N-acetyl-D-glucosamine (NAcGlcN) liên kết với nhau qua liên kết $\beta$-1,4 glycoside, công thức phân tử $(C_8H_{13}O_5N)_n$. Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa một phần của chitin, mang điện tích dương do các nhóm amino tự do ($-NH_3^+$). Chito-oligosaccharide (COS) là sản phẩm cắt mạch ngắn từ chitin hoặc chitosan với mức độ polymer hóa DP từ 2 đến 10, tan hoàn toàn trong nước ở pH trung tính. Hoạt tính ức chế nấm trực tiếp của COS dựa trên tương tác tĩnh điện với màng tế bào nấm mang điện tích âm, làm biến đổi tính thấm màng tế bào hoặc chelat hóa các ion khoáng hóa trị 2 ($Ca^{2+}, Zn^{2+}$). Ở vai trò kích kháng, COS hoạt động như một phân tử elicitor bám vào thụ thể màng tế bào thực vật, kích hoạt tầng tín hiệu truyền tin nội bào (con đường kinase MAPK), thúc đẩy tổng hợp các hormone tín hiệu (SA, JA, ET), tăng cường hoạt tính các enzyme phòng vệ (PAL, PPO, LOX), kích thích tích lũy hợp chất chuyển hóa thứ cấp (polyphenol, phytoalexin, lignin) và phiên mã các gen sinh protein liên quan đến tính kháng (pathogenesis-related proteins - PR).

Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng kết hợp các phương pháp thực nghiệm định tính và định lượng:

• Sàng lọc và định danh chủng sinh chitinase: Áp dụng phương pháp cấy trực tiếp và khuếch tán trên đĩa thạch chứa cơ chất chitin keo để xác định vòng phân giải; định lượng hoạt độ enzyme chitinase theo phương pháp đo hàm lượng đường khử; phân tích thành phần enzyme bằng điện di trên gel hoạt tính (Zymogram). Định danh chủng vi sinh vật qua hình thái khuẩn lạc, vi thể (bar 5 $\mu$m và 10 $\mu$m) và giải trình tự gen 16S rDNA (đối với xạ khuẩn), vùng D1/D2 28S rDNA (đối với nấm sợi), sau đó xây dựng cây phát sinh chủng loại.
• Điều chế và phân tích cấu trúc COS: Thủy phân dung dịch chitosan bằng dịch chiết enzyme chitinase thu nhận từ các chủng vi sinh vật được tuyển chọn. Phân tích phân bố khối lượng phân tử và xác định mức độ polymer hóa (DP) của các mẫu COS bằng phương pháp khối phổ thời gian bay MS-TOF (Time-of-Flight Mass Spectrometry).
• Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vitro: Đánh giá khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm B. cinerea và F. oxysporum sau 16 giờ (quan sát vi thể) và sau 72 giờ ở các nồng độ xử lý khác nhau; đánh giá mức độ ức chế sự phát triển đường kính thể sợi nấm trên môi trường thạch PDA sau 96 giờ so với đối chứng và dạng polymer chitosan.
• Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vivo trên lá cà chua: Thử nghiệm gây nhiễm nhân tạo nấm B. cinerea trên lá cà chua trong buồng giữ ẩm ở 72 giờ. Quan sát sự nảy mầm và phát triển của sợi nấm bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang Calcofluor white dưới tia cực tím (UV); đánh giá mức độ tổn thương mô và chết tế bào thực vật bằng phương pháp nhuộm xanh Trypan (Trypan blue).
• Đánh giá khả năng kích kháng hệ thống và phân tích phân tử:
  • Bố trí thí nghiệm trên cây cà chua nguyên vẹn, xử lý phun COS tại các thời điểm quy định; thu mẫu lá ở các vị trí tầng lá số 3, số 4 và số 5 ở các thời điểm: ngay sau xử lý lần 2, sau 3 ngày không gây nhiễm (NI) và sau 3 ngày có gây nhiễm nấm (I - thời điểm T3).
  • Đo hoạt độ enzyme phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), lipoxygenase (LOX) bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) trên máy quang phổ.
  • Định lượng hàm lượng hợp chất phenol tổng số.
  • Phân tích mức độ biểu hiện phiên mã của các gen kháng bệnh (PR-1, PR-2, PR-8) bằng kỹ thuật RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative PCR), sau khi đã sàng lọc lựa chọn gen tham chiếu nội chuẩn có độ biểu hiện ổn định; xử lý và kiểm định số liệu thống kê.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu thiết lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thiệt hại do nấm B. cinerea và F. oxysporum gây ra trên cây cà chua, phân tích áp lực giảm thiểu hóa chất bảo vệ thực vật, sự cần thiết tận dụng phế liệu vỏ tôm chứa 15% chitin của Việt Nam để tạo chế phẩm COS tan trong nước, đồng thời xác định 3 mục tiêu và 4 nội dung nghiên cứu cụ thể.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này gồm 5 phần chính:

1. Nấm gây bệnh thực vật và biện pháp phòng trừ: Phân loại các nhóm nấm hoại sinh, ký sinh; phân tích chi tiết chu trình sinh trưởng, hình thái bào tử, hạch nấm và cơ chế xâm nhiễm của B. cinerea (họ Sclerotiniaceae) và F. oxysporum (họ Nectriaceae) cùng các triệu chứng thối xám, héo mạch dẫn.
2. Cơ chế kháng bệnh ở thực vật: Phân tích rào cản vật lý (lớp cutin, biểu bì), rào cản hóa học (phytoanticipin), các thụ thể nhận diện elicitor (CEBiP, CERK1), các phản ứng tạo lớp tế bào bần (cork), tích lũy phytoalexin, cùng mạng lưới truyền tín hiệu SAR (qua SA) và ISR (qua JA/ET).
3. Chito-oligosaccharide (COS): So sánh cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và COS; tổng quan ba nhóm phương pháp sản xuất (vật lý, hóa học, enzyme); phân loại enzyme chitinase (endo-chitinase, exo-chitinase gồm chitobiosidase, chitobiadase).
4. Ứng dụng của COS trong kiểm soát bệnh thực vật: Tổng kết các bằng chứng thực nghiệm về hoạt tính kháng trực tiếp đối với nấm, vi khuẩn Gram âm/Gram dương, virus TMV; tác động kích ứng sinh tổng hợp protein PR, kích hoạt các enzyme PAL, POD, PPO, LOX, tăng hàm lượng hợp chất phenol (rosmarinic acid, chlorogenic acid), lignin và phytoalexin.
5. Tình hình nghiên cứu trong nước về chitosan và COS: Tổng kết các hướng đi trong nước và định vị nội dung nghiên cứu của đề tài.

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết các chủng vi sinh vật (gồm mẫu xạ khuẩn, nấm sợi thu nhận từ Trung tâm Nguồn gen Vi sinh vật Quốc gia - VTCC; hai chủng nấm kiểm định B. cinerea, F. oxysporum), giống cây cà chua, hóa chất và môi trường nuôi cấy (PDA, PDB, YS, CMA, MALT, MSM). Thiết lập các quy trình kỹ thuật:

• Sàng lọc hoạt tính chitinase bằng phương pháp đĩa thạch và định lượng đường khử; điện di Zymogram;
• Định danh phân tử chủng vi sinh vật bằng giải trình tự 16S rDNA và D1/D2;
• Quy trình thủy phân điều chế COSA, COSB và phân tích khối phổ MS-TOF;
• Quy trình thử nghiệm in vitro (đo tỷ lệ nảy mầm bào tử sau 16–72 giờ, đo đường kính sợi nấm sau 96 giờ);
• Quy trình khảo nghiệm in vivo trên lá tách rời và trên cây hoàn chỉnh;
• Kỹ thuật nhuộm vi thể huỳnh quang Calcofluor và Trypan blue;
• Phương pháp chiết xuất và đo quang học xác định hoạt độ enzyme PAL, PPO, LOX, phenol tổng số;
• Quy trình RT-qPCR khuếch đại gen PR-1, PR-2, PR-8, phân tích độ ổn định gen nội chuẩn và xử lý thống kê.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Nội dung chương 3 được trình bày theo 4 phần logic:

[Sàng lọc, định danh chủng sinh Chitinase & Điều chế COS]
          [Phân tích thành phần MS-TOF (DP 2-10)]
[Kháng nấm in vitro & in vivo]       [Đánh giá kích kháng trên cà chua]
- Ức chế nảy mầm bào tử (16-72h)    - Hoạt độ enzyme (PAL, PPO, LOX)
- Ức chế thể sợi nấm (96h)           - Hàm lượng phenol tổng số
- Nhuộm Calcofluor & Trypan blue     - Biểu hiện gen PR-1, PR-2, PR-8 qua RT-qPCR

• Điều chế và phân tích thành phần mẫu COS:
  • Từ tập hợp các chủng vi sinh vật, luận án đã sàng lọc và tuyển chọn được chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 và chủng nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103 có hoạt tính chitinase cao. Chủng VTCC 940003 được định danh dựa trên hình thái tế bào và cây phát sinh chủng loại 16S rDNA; chủng VN10-F1103 được định danh qua đặc điểm cơ quan sinh sản và vùng D1/D2 28S rDNA.
  • Điện di gel hoạt tính xác nhận sự hiện diện của các băng enzyme chitinase A và chitinase B. Dịch chiết enzyme này được dùng để thủy phân chitosan, tạo ra hai chế phẩm tương ứng là COSA (từ S. macrosporeus) và COSB (từ B. bassiana).
  • Phân tích phổ MS-TOF cho thấy cả hai mẫu COSA và COSB đều gồm các phân đoạn chito-oligosaccharide có mức độ polymer hóa DP dao động từ 2 đến 10 với thành phần và tỷ lệ phân bố các oligomer khác biệt giữa hai mẫu.
• Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro của mẫu COS:
  • Đối với Botrytis cinerea: Cả COSA và COSB đều ức chế sự nảy mầm của bào tử sau 16 giờ và 72 giờ, đồng thời ức chế sự phát triển chiều dài sợi nấm trên đĩa thạch PDA sau 96 giờ theo mức độ phụ thuộc nồng độ. Mẫu COSA thể hiện hiệu lực ức chế nảy mầm bào tử và kìm hãm phát triển thể sợi của B. cinerea cao hơn so với mẫu COSB và cao hơn dạng polymer chitosan ban đầu.
  • Đối với Fusarium oxysporum: Cả hai mẫu COSA, COSB và chitosan đều thể hiện khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử sau 72 giờ và ức chế sự phát triển thể sợi sau 96 giờ trên môi trường PDA.
• Nghiên cứu khả năng kháng nấm in vivo của mẫu COS:
  • Trên mô hình lá cà chua sau 72 giờ gây nhiễm nhân tạo B. cinerea, nghiệm thức được xử lý COS có diện tích vết bệnh và mức độ thối mềm mô lá giảm rõ rệt so với đối chứng không xử lý.
  • Quan sát hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm Calcofluor white cho thấy sợi nấm B. cinerea bị biến dạng và hạn chế phát triển trên bề mặt biểu bì lá được xử lý COS. Kỹ thuật nhuộm Trypan blue xác nhận số lượng tế bào thực vật bị chết tại vết thương giảm đáng kể ở các mẫu có xử lý COS.
• Đánh giá khả năng kích kháng của mẫu COS trên mô hình cây cà chua:
  • Hoạt độ enzyme phòng vệ: Xử lý COSA kích thích làm tăng hoạt độ của cả 3 enzyme PAL, PPO và LOX tại các mẫu lá số 3, số 4 và số 5. Mức tăng được ghi nhận ngay sau khi xử lý lần 2, duy trì sau 3 ngày và tiếp tục giữ ở mức cao tại thời điểm T3 khi cây bị gây nhiễm nấm bệnh.
  • Hàm lượng phenol tổng số: Nồng độ phenol tổng số ở các tầng lá số 3, số 4 và số 5 của cây xử lý COSA cao hơn đối chứng ở cả thời điểm sau xử lý và sau khi gây nhiễm nấm bệnh 3 ngày, tương quan thuận với sự gia tăng hoạt tính của enzyme PAL.
  • Mức độ biểu hiện các gen PR: Sau khi kiểm tra độ ổn định và lựa chọn gen nội chuẩn phù hợp, phân tích RT-qPCR xác định mức độ phiên mã của các gen PR-1, PR-2 và PR-8 đều tăng cao ở các lá số 3, 4, 5 ở cả hai trạng thái: không gây nhiễm (NI) và có gây nhiễm B. cinerea (I) sau 3 ngày.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Đã sàng lọc và định danh được hai chủng vi sinh vật bản địa tại Việt Nam có hoạt tính sinh chitinase cao là xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 và nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103; ứng dụng dịch chiết enzyme của hai chủng này để thủy phân chitosan, tạo ra hai chế phẩm chito-oligosaccharide (COSA và COSB) có mức độ polymer hóa DP từ 2 đến 10.
2. Đã xác định và so sánh hoạt tính kháng nấm in vitro của COSA và COSB đối với hai loài nấm gây bệnh thực vật Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum; trong đó chứng minh COSA có hiệu lực ức chế nấm B. cinerea cao hơn so với COSB.
3. Đã chứng minh được vai trò kích kháng hệ thống của mẫu COS trên mô hình cây cà chua nguyên vẹn chống lại nấm bệnh Botrytis cinerea thông qua cơ chế tổng hợp: kìm hãm nấm trên bề mặt lá in vivo, gia tăng hoạt độ các enzyme phòng vệ (PAL, PPO, LOX), tăng tích lũy hàm lượng phenol tổng số và kích thích phiên mã các gen chỉ thị tính kháng (PR-1, PR-2, PR-8).

Bảng tổng hợp các thông số và đối tượng nghiên cứu chính

Hạng mục	Thông số / Dữ liệu thực nghiệm trong luận án
Chủng sinh enzyme	Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 (xạ khuẩn) và Beauveria bassiana VN10-F1103 (nấm sợi)
Sản phẩm oligo	Mẫu COSA (từ VTCC 940003) và COSB (từ VN10-F1103); dải mức độ polymer hóa DP từ 2 đến 10
Nấm kiểm định	Botrytis cinerea (thối xám) và Fusarium oxysporum (héo vàng mạch dẫn)
Mô hình thực vật	Cây cà chua (Solanum lycopersicum), đánh giá tại các tầng lá số 3, số 4 và số 5
Chỉ thị sinh hóa	Hoạt độ enzyme Phenylalanine ammonia lyase (PAL), Polyphenol oxidase (PPO), Lipoxygenase (LOX) và nồng độ Phenol tổng số
Chỉ thị phân tử	Mức độ biểu hiện phiên mã các gen PR-1, PR-2, PR-8 qua phân tích RT-qPCR
Kỹ thuật nhuộm vi thể	Nhuộm Calcofluor white (quan sát sợi nấm dưới UV) và nhuộm Trypan blue (đo tế bào thực vật chết)

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Nghiên cứu sử dụng chế phẩm dịch chiết chitinase thô từ môi trường nuôi cấy của hai chủng vi sinh vật để thủy phân chitosan mà chưa tiến hành tinh sạch đến trạng thái đồng nhất từng phân đoạn isoenzyme chitinase riêng biệt.
• Khảo nghiệm in vivo và đánh giá đáp ứng kích kháng hệ thống (hoạt độ enzyme, biểu hiện gen PR) được thực hiện chủ yếu đối với tác nhân Botrytis cinerea trên mô hình cây cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới kiểm soát, chưa triển khai khảo nghiệm đồng thời đối với Fusarium oxysporum trên toàn bộ cây nguyên vẹn ngoài đồng ruộng.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Nghiên cứu tinh sạch phân đoạn enzyme chitinase từ Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 nhằm tối ưu hóa các thông số phản ứng (nhiệt độ, pH, thời gian), hướng tới kiểm soát chính xác tỷ lệ các oligomer có DP mong muốn.
• Mở rộng đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh héo do Fusarium oxysporum trên cây cà chua và các cây trồng kinh tế khác trong điều kiện canh tác đồng ruộng thực tế.
• Tiếp tục làm rõ thụ thể tiếp nhận COS trên màng tế bào cây cà chua và phân tích chi tiết các con đường truyền tín hiệu nội bào qua kỹ thuật giải trình tự transcriptome.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Bảo vệ thực vật, Sinh lý học thực vật: Luận án cung cấp quy trình nghiên cứu thực nghiệm đồng bộ kết hợp từ công nghệ enzyme (sàng lọc vi sinh vật, thủy phân sinh học, phân tích MS-TOF) đến sinh lý bệnh học thực vật và sinh học phân tử (đo hoạt độ enzyme quang phổ, nhuộm hiển vi huỳnh quang, RT-qPCR phân tích biểu hiện gen).
• Đối với các đơn vị sản xuất và doanh nghiệp nông nghiệp sinh học: Quy trình điều chế COS sử dụng enzyme chitinase từ chủng xạ khuẩn bản địa cung cấp cơ sở kỹ thuật để tận dụng nguồn phụ phẩm vỏ tôm (chiếm 15% chitin) nhằm tạo ra chế phẩm sinh học tan trong nước phục vụ kiểm soát nấm bệnh thay thế thuốc hóa học.
• Đối với cơ quan quản lý nông nghiệp và phát triển nông thôn: Cung cấp các dữ liệu thực nghiệm phục vụ việc hoàn thiện các tiêu chuẩn, hướng dẫn ứng dụng các chế phẩm elicitor sinh học trong chiến lược phát triển nông nghiệp hữu cơ và kinh tế tuần hoàn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã tuyển chọn những chủng vi sinh vật nào để sản xuất chitinase điều chế COS? Luận án đã tuyển chọn và định danh được 2 chủng từ nguồn gen vi sinh vật bản địa Việt Nam (VTCC) gồm: chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 (định danh qua hình thái và trình tự 16S rDNA) và chủng nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103 (định danh qua hình thái và vùng trình tự D1/D2 28S rDNA).

2. Mẫu COS điều chế được có đặc điểm cấu trúc và mức độ polymer hóa (DP) như thế nào? Hai mẫu COS điều chế được ký hiệu là COSA (thủy phân bằng enzyme từ S. macrosporeus) và COSB (thủy phân bằng enzyme từ B. bassiana). Phân tích trên phổ khối lượng MS-TOF xác định cả hai mẫu đều là hỗn hợp các oligo mạch ngắn có mức độ polymer hóa DP từ 2 đến 10, tan hoàn toàn trong nước.

3. Khả năng kháng nấm Botrytis cinerea của mẫu COSA và COSB khác nhau như thế nào? Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy cả hai mẫu đều có hoạt tính ức chế sự nảy mầm bào tử (sau 16 giờ và 72 giờ) và kìm hãm phát triển sợi nấm (sau 96 giờ), tuy nhiên mẫu COSA thể hiện hiệu lực ức chế nấm B. cinerea cao hơn so với mẫu COSB và cao hơn dạng polymer chitosan ban đầu.

4. Khả năng kích kháng của COS trên mô hình cây cà chua được chứng minh qua những chỉ thị nào? Tính kích kháng được chứng minh đồng bộ qua 3 nhóm chỉ thị:

• Mức độ mô - tế bào: Giảm diện tích tổn thương trên lá in vivo, kìm hãm phát triển sợi nấm (nhuộm Calcofluor white) và giảm tỷ lệ chết tế bào thực vật (nhuộm Trypan blue);
• Mức độ sinh hóa: Gia tăng hoạt độ các enzyme phòng vệ phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), lipoxygenase (LOX) và tăng hàm lượng phenol tổng số tại các tầng lá số 3, 4, 5;
• Mức độ phân tử: Tăng cường mức độ biểu hiện phiên mã của các gen kháng bệnh PR-1, PR-2 và PR-8 qua phân tích RT-qPCR ở cả điều kiện không gây nhiễm và có gây nhiễm nấm.

5. Vì sao nghiên cứu lại chọn phụ phẩm vỏ tôm làm nguyên liệu định hướng cho sản xuất COS? Việt Nam có sản lượng tôm xuất khẩu lớn (800.000–900.000 tấn/năm), tạo ra lượng lớn phụ phẩm đầu vỏ tôm chứa tới 15% trọng lượng là chitin. Việc khai thác nguồn phế phẩm này để sản xuất chitosan và COS vừa giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường chất thải thủy sản, vừa tạo ra chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học phục vụ nông nghiệp an toàn.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Trịnh Thị Vân Anh đã thực hiện thành công quy trình điều chế hai loại chito-oligosaccharide (COSA và COSB có dải DP từ 2 đến 10) từ chitosan bằng enzyme chitinase thu nhận từ hai chủng vi sinh vật bản địa Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 và Beauveria bassiana VN10-F1103. Công trình đã chứng minh hoạt tính kháng nấm in vitro của các mẫu COS đối với Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum, trong đó COSA thể hiện hiệu lực ức chế B. cinerea vượt trội. Đồng thời, nghiên cứu làm sáng tỏ cơ chế bảo vệ cây cà chua của COS thông qua việc kết hợp giữa ức chế nấm trực tiếp trên bề mặt lá và kích hoạt hệ thống tự vệ chủ động của thực vật (gia tăng hoạt độ enzyme PAL, PPO, LOX, tăng tích lũy phenol tổng số và cảm ứng biểu hiện các gen PR-1, PR-2, PR-8). Kết quả của luận án cung cấp các luận cứ khoa học và thực nghiệm hoàn chỉnh, phục vụ định hướng ứng dụng nguồn phụ phẩm vỏ tôm để phát triển các chế phẩm sinh học kiểm soát bệnh hại cây trồng trong nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh thực vật đang là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại năng suất cây trồng và đe dọa đến tình hình an ninh lương thực toàn cầu. Theo nghiên cứu của Savary và cs. (2019), các tác nhân khác nhau như côn trùng, vi sinh vật và động vật hàng năm gây thiệt hại từ 20-40% năng suất cây trồng. Trong số các tác nhân gây bệnh thực vật, nấm là một tác nhân chính gây ra các thiệt hại lớn trong sản xuất nông nghiệp.

Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations; FAO), 70-80% vi sinh vật gây bệnh thực vật là nấm. Trong số đó, Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum là hai đối tượng gây bệnh quan trọng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, trong đó có cà chua - cây rau màu quan trọng với sản lượng hàng năm hơn 180 triệu tấn. cinerea gây chết non 70% số cây cà chua và gây ra thối quả trong và sau thu hoạch, với ước tính thiệt hại từ 10 đến 100 tỷ USD mỗi năm. oxysporum gây bệnh héo Fusarium và đang là vấn đề thời sự khi gây ra những thiệt hại lớn cho nền sản xuất nông nghiệp đối với nhiều loại cây trồng khác nhau.

Để hạn chế tác hại của bệnh thực vật, nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật đã được sử dụng phổ biến trong sản xuất nông nghiệp. Ước tính từ năm 2000, lượng thuốc bảo vệ thực vật sử dụng hàng năm trên toàn thế giới là 3,08 triệu tấn và con số này đã lên tới 4,19 triệu tấn trong năm 2019. Chi phí cho thuốc bảo vệ thực vật trên toàn thế giới năm 2019 ước tính khoảng 84,5 tỷ USD, và với mức độ tăng trưởng 4,2% năm, dự kiến sẽ tăng lên 130 tỷ USD vào năm 2023. Tuy nhiên thực tế cho thấy việc sử dụng các loại thuốc này gây ra những tác hại to lớn đối với môi trường sống cũng như sức khoẻ con người.

Theo xu hướng phát triển kinh tế xanh, bền vững trên toàn cầu, thuốc bảo vệ thực vật sinh học là giải pháp phù hợp để phát triển nền nông nghiệp hữu cơ an toàn. Thị trường thuốc bảo vệ thực vật sinh học trên thế giới năm 2020 ước tính 4,3 tỷ USD và dự kiến tăng lên 8,5 tỷ USD năm 2025 với tốc độ tăng trưởng 14,7%. Chitosan và các sản phẩm chito-oligosaccharide (COS) là loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học đã được ứng dụng hiệu quả cho phát triển nông nghiệp hữu cơ, giúp kiểm soát hữu hiệu các bệnh thực vật do nấm gây ra, an toàn và thân thiện với môi trường. 1 Chitosan và COS đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê duyệt cấp phép lưu hành.

Các nghiên cứu và thực tế cho thấy chitosan và COS có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh thực vật thuộc các chi Fusarium, Rhizopus, Phythophthora, Botrytis, Alternaria…vv. Hiệu quả chống nấm của COS và chitosan phụ thuộc vào mức độ polymer hoá (degree of polymeration; DP) và mức độ deacetyl hoá (degree of deacetylation; DDA). Chitosan và COS được điều chế từ chitin, một polymer sẵn có nhiều thứ hai trong tự nhiên và là thành phần cấu tạo chính của vỏ ngoài các động vật giáp xác như tôm, cua, …vv. Trong khi đó, Việt Nam luôn nằm trong số các quốc gia hàng đầu về nuôi trồng thủy sản và xuất khẩu tôm, do đó đã tạo ra một lượng phế phẩm vô cùng lớn.

Sản lượng tôm hàng năm xuất khẩu ước tính đạt 800-900 nghìn tấn và tạo ra lượng phế phẩm vỏ đầu tôm lớn chứa chitin (15% trọng lượng). Sử dụng nguồn phế phẩm này để sản xuất thuốc bảo vệ sinh học (COS và chitosan) sẽ không chỉ làm giảm hiện tượng ô nhiễm môi trường do lượng chất thải từ đầu vỏ tôm gây ra mà còn tạo ra sản phẩm có giá trị để phát triển nền nông nghiệp hữu cơ an toàn. Mặc dù vậy, các nghiên cứu về hiệu quả COS và chitosan được sản xuất ra để ứng dụng cho việc kiểm soát các bệnh cây trồng vẫn còn nhiều hạn chế. Cho đến nay, chưa có nhiều công trình nghiên cứu đồng bộ ở mức độ in vitro, in vivo và phân tử về vai trò kiểm soát nấm gây bệnh thực vật và khả năng kích kháng của COS đối với cây trồng.

Đặc biệt, những nghiên cứu về tính kháng của COS trên mô hình thực vật vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu gây nhiễm mới chỉ trên các bộ phận bị tách ra từ cây như lá, hoa của dâu tây, nho hoặc mô hình cây Arabidopsis. Do đó, đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh thực vật và vai trò kích kháng của chito-oligosaccharide trên mô hình cây cà chua (Solanum lycopersicum)” được thực hiện nhằm làm sáng tỏ vai trò của COS trong kiểm soát nấm bệnh B. oxysporum, và vai trò kích kháng thực vật trên mô hình cây cà chua.

Kết quả đề tài sẽ là luận cứ khoa học và thực nghiệm giúp cho phát triển chế phẩm COS có chất lượng và hoạt tính cao trong việc kiểm soát hai loài nấm bệnh thực vật phổ biến là nấm gây bệnh thối xám (B. cinerea) và nấm gây bệnh héo cây (F. 2 Mục tiêu nghiên cứu Điều chế COS bằng phương pháp thuỷ phân chitosan sử dụng enzyme chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa; đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật B. oxysporum và tính kích kháng thực vật trên mô hình cây cà chua của mẫu COS được tạo ra.

Nội dung nghiên cứu - Điều chế COS bằng phương pháp thuỷ phân sử dụng chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa tại Việt Nam và phân tích thành phần mẫu COS thu được. - Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro của mẫu COS đối với hai đối tượng nấm gây bệnh thực vật B. - Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vivo của mẫu COS trên lá cây cà chua. - Nghiên cứu tính kích kháng của mẫu COS trên mô hình cây cà chua thông qua đánh giá các chỉ thị phân tử từ thực vật và sự biểu hiện của các gene liên quan đến tính kháng bệnh.

Những đóng góp mới của luận án - Đã tạo ra hai loại COS có thành phần oligo khác nhau với DP từ 2-10 bằng phương pháp thuỷ phân sử dụng chitinase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 (COSA) và nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103 (COSB) có khả năng kháng hai đối tượng nấm gây bệnh thực vật B. oxysporum; trong đó, COSA có khả năng kháng nấm B. cinerea tốt hơn COSB. - Đã minh chứng được tính kích kháng của mẫu COS trên mô hình cây cà chua chống lại tác nhân nấm gây bệnh thực vật B.

NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ 1. Thực trạng nấm gây bệnh thực vật Nấm là tác nhân chính gây bệnh trên thực vật, chiếm 70-80% tổng số tác nhân gây bệnh từ vi sinh vật [80]. Nấm gây bệnh trên thực vật không những gây ra thiệt hại lớn về sản lượng mà còn giảm chất lượng của các sản phẩm nông sản. Theo ước tính, nấm cùng với các tác nhân khác gây ra thiệt hại khoảng một phần ba sản lượng mùa vụ, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đời sống của con người [125].

Trong quá khứ, nấm gây bệnh mốc sương Phytophthora infestans ở khoai tây đã gây ra nạn đói ở Ireland (1845-1852) và cái chết của hơn một triệu người, làm ảnh hưởng nghiêm trọng tình hình kinh tế không chỉ của Ireland mà còn của toàn châu Âu trong thời gian đó [100]. Năm 1970, bệnh gây chết héo trên chuối đã được xác định là do nấm F. cubense gây ra. Đến nay, những thiệt hại gây ra bởi F.

cubense đối với nền nông nghiệp trồng chuối vẫn đang được ghi nhận ở nhiều quốc gia khác nhau trên toàn thế giới [92]. Bên cạnh đó, nấm cũng có thể sản sinh ra các độc tố vào các sản phẩm sau thu hoạch gây hại cho con người và các loài động vật khi ăn phải. Ví dụ như bệnh nấm cựa gà trên các cây ngũ cốc do các loài thuộc chi Claviceps gây ra, tiêu biểu là C. Từ thời Trung cổ, các hợp chất độc do nấm gây ra được ghi lại trong nhiều tài liệu lịch sử.

Ở Pháp những năm 800-900 sau Công nguyên, nhiều người đã tử vong do ăn phải bánh mì nhiễm độc tố từ nấm. Sự bùng nổ của bệnh do ăn phải thực phẩm bị nhiễm nấm cũng được ghi nhận ở Ethiopia vào năm 1977-1978 và Ấn Độ vào năm 1975. Đến nay các dịch bệnh do nấm gây ra đối với cây trồng vẫn đang diễn ra trên toàn thế giới và gây ra thiệt hại lớn lên đến hàng trăm tỉ đô mỗi năm cho nền nông nghiệp [74]. Nấm gây bệnh trên thực vật tuy rất đa dạng nhưng theo cách thức sinh trưởng và tác động trên cây chúng được chia làm hai nhóm chính là nhóm hoại sinh (necrotroph) và nhóm ký sinh (biotroph) [80].

Trong đó, nấm hoại sinh tấn công vật chủ thông vết thương hoặc lỗ hở tự nhiên. Chúng tiết ra các enzyme phân giải thành tế bào và độc tố để giết chết tế bào, từ đó chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng từ các tế bào 4 đã bị chết. Các loài nấm hoại sinh thường có phổ vật chủ rộng. Một số đại diện của nhóm hoại sinh như B.

oxysporum, Sclerotia sclerotium, Cochliobolus heterostrophus …vv. Nấm ký sinh thường tạo ra những tổn thương nhỏ ở vật chủ và ít khi tiết độc tố hay các enzyme phân giải. Chúng sử dụng dinh dưỡng từ các khoang gian bào của cây và tồn tại ký sinh lâu dài trên cây. Các loài nấm ký sinh thường có phổ vật chủ hẹp và đặc hiệu đối với một nhóm vật chủ nhất định.

Một số ví dụ của nấm ký sinh như Blumeria (Erysiphe) graminis, Uromyces fabae, Ustilago maydis, Cladosporium fulvum, Puccinia graminis [80]. Sự phát triển bệnh phụ thuộc vào đặc điểm mầm bệnh, cây vật chủ và điều kiện môi trường. Sự tương tác của ba yếu tố này tạo ra hiện tượng nhiễm bệnh [45]. Nếu thiếu một yếu tố, ví dụ như điều kiện không thuận lợi của nhiệt độ, độ ẩm thì tình trạng nhiễm bệnh sẽ khó hoặc không xảy ra.

Để quá trình nhiễm bệnh diễn ra, đầu tiên mầm bệnh phải có độc lực và tương thích với đối tượng vật chủ đó. Một số mầm bệnh có phạm vi vật chủ rộng như B. cinerea, trong khi một số mầm bệnh khác chỉ tấn công một số ít loài thực vật như Rhizoctonia solani. Một số mầm bệnh phát triển theo cách tạo ra các dạng loài có tính đặc hiệu loài formae specialis (f.) như trường hợp của F.

oxysporum với nhiều nhóm đặc hiệu loài khác nhau. Điều kiện thứ hai là vật chủ phải ở giai đoạn nhạy cảm bệnh, ví dụ một số bệnh chỉ gây nhiễm ở giai đoạn hạt, hoặc cây non.