NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ VAI TRÒ KÍCH KHÁNG CỦA ...

Nghiên cứu về chito-oligosaccharide, giải pháp tiềm năng kháng nấm bệnh thực vật. Tìm hiểu vai trò kích kháng trên cây cà chua (Solanum lycopersicum).

• Tác giả: Trịnh Thị Vân Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Hợp
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh thực vật và vai trò kích kháng của chito-oligosaccharide trên mô hình cây cà chua (Solanum lycopersicum)
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ
• 1.1. Thực trạng nấm gây bệnh thực vật
• 1.2. Nấm Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum gây bệnh thực vật
• 1.3. CƠ CHẾ KHÁNG BỆNH Ở THỰC VẬT
• 1.3.1. Cơ chế kháng thụ động
• 1.3.2. Rào cản vật lý
• 1.3.3. Rào cản hóa học
• 1.3.4. Cơ chế kháng chủ động
• 1.3.4.1. Elicitor-phân tử kích kháng thực vật
• 1.3.4.2. Phản ứng bảo vệ nhanh
• 1.3.4.3. Phản ứng bảo vệ chậm
• 1.4. Chitin, chitosan và COS
• 1.5. Các phương pháp sản xuất COS
• 1.6. ỨNG DỤNG CỦA COS TRONG KIỂM SOÁT BỆNH THỰC VẬT
• 1.6.1. Hoạt tính kháng trực tiếp đối với các vi sinh vật gây bệnh
• 1.6.2. Hoạt tính kháng nấm
• 1.6.3. Hoạt tính kháng vi khuẩn
• 1.6.4. Hoạt tính kháng virus
• 1.6.5. Hoạt tính kích kháng thực vật
• 1.6.6. Protein liên quan đến tính kháng (PR protein)
• 1.6.7. Các enzyme liên quan đến tính kháng
• 1.6.8. Một số hợp chất liên quan đến tính kháng của thực vật
• 1.6.9. Vai trò của COS với con đường truyền tín hiệu
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ CHITOSAN VÀ COS
• 1.8. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.1. Chủng vi sinh vật
• 1.8.2. Giống cây cà chua
• 1.8.3. Môi trường và hoá chất
• 1.8.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.8.4.1. Tuyển chọn các chủng nấm sợi và xạ khuẩn sinh chitinase
• 1.8.4.2. Phương pháp cấy trực tiếp
• 1.8.4.3. Phương pháp định tính (khuếch tán trên đĩa thạch)
• 1.8.4.4. Phương pháp định lượng chitinase
• 1.8.4.5. Điện di chitinase trên gel hoạt tính
• 1.8.4.6. Định danh chủng vi sinh vật
• 1.8.4.6.1. Xác định đặc điểm hình thái
• 1.8.4.6.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
• 1.8.4.7. Điều chế COS từ chitosan
• 1.8.4.8. Phân tích mẫu COS bằng MS-TOF
• 1.9. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro
• 1.9.1. Đánh giá khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử nấm của COS
• 1.9.2. Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm của COS
• 1.10. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vivo
• 1.10.1. Đánh giá khả năng kháng nấm của COS trên lá cây cà chua
• 1.10.2. Phương pháp nhuộm calcoflour
• 1.10.3. Phương pháp nhuộm trypan blue
• 1.11. Nghiên cứu khả năng kích kháng hệ thống trên mô hình cây cà chua
• 1.11.1. Phương pháp xác định hoạt độ phenylalanin ammonia lyase (PAL)
• 1.11.2. Phương pháp xác định hoạt độ polyphenol oxidase (PPO)
• 1.11.3. Phương pháp xác định hoạt độ lipoxygenase (LOX)
• 1.11.4. Phương pháp định lượng phenol tổng số
• 1.11.5. Phân tích sự biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-qPCR
• 1.11.6. Phân tích thống kê
• 2. CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. ĐIỀU CHẾ VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MẪU COS
• 2.1.1. Nghiên cứu điều chế COS
• 2.1.2. Sàng lọc và định danh chủng vi sinh vật sinh chitinase cao
• 2.1.3. Thu dịch chiết chitinase và điều chế COS
• 2.1.4. Thành phần mẫu COS
• 2.2. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM in vitro CỦA MẪU COS
• 2.2.1. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm B. cinerea in vitro của mẫu COS
• 2.2.2. Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm B.
• 2.2.3. Khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm B.
• 2.2.4. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm F. oxysporum in vitro của mẫu COS
• 2.2.5. Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F.
• 2.2.6. Khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm F.
• 2.3. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM in vivo CỦA MẪU COS
• 2.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CỦA MẪU COS TRÊN MÔ HÌNH CÂY CÀ CHUA
• 2.4.1. Tác động của COS đối với các enzyme liên quan đến tính kháng
• 2.4.2. Tác động của COS đối với hoạt độ PAL
• 2.4.3. Tác động của COS đối với hoạt độ PPO
• 2.4.4. Tác động của COS đối với hoạt độ LOX
• 2.4.5. Tác động của COS đối với lượng phenol tổng số
• 2.4.6. Tác động của COS đối với sự biểu hiện của các PR gen
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Chito oligosaccharide COS Tổng quan và ứng dụng tiềm năng

Bệnh thực vật là mối đe dọa lớn đối với an ninh lương thực toàn cầu, gây thiệt hại 20-40% năng suất cây trồng hàng năm. Trong đó, nấm chiếm 70-80% tác nhân gây bệnh. Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum là hai loại nấm gây hại nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cà chua. Để đối phó, thuốc bảo vệ thực vật hóa học được sử dụng rộng rãi, nhưng lại gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Do đó, xu hướng nông nghiệp xanh bền vững đang thúc đẩy việc tìm kiếm các giải pháp sinh học an toàn hơn. Chito-oligosaccharide (COS) nổi lên như một ứng cử viên tiềm năng. COS là một loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học hiệu quả, có khả năng kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh, an toàn và thân thiện với môi trường. Các nghiên cứu đã chứng minh COS có thể kiểm soát các loại nấm thuộc chi Fusarium, Rhizopus, Phythophthora, Botrytis, Alternaria. Hiệu quả của COS phụ thuộc vào mức độ polyme hoá (DP) và mức độ deacetyl hoá (DDA).

1.1. Nguồn gốc và đặc tính của Chito oligosaccharide COS

Chito-oligosaccharide (COS) có nguồn gốc từ chitin, một polymer tự nhiên dồi dào có trong vỏ các loài giáp xác như tôm, cua. Việt Nam là một trong những quốc gia hàng đầu về xuất khẩu tôm, tạo ra lượng phế phẩm lớn chứa chitin. Sử dụng phế phẩm này để sản xuất COS không chỉ giảm ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra sản phẩm giá trị cho nông nghiệp hữu cơ. COS có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh thực vật và an toàn cho môi trường. Việc điều chế COS từ chitin đòi hỏi các phương pháp thủy phân khác nhau. Trịnh Thị Vân Anh (2023) đã nghiên cứu điều chế COS từ nguồn vi sinh vật bản địa.

1.2. Vai trò của COS trong bảo vệ thực vật bền vững

COS đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật bền vững nhờ khả năng kiểm soát nấm bệnh mà không gây hại cho môi trường và sức khỏe con người. Theo xu hướng phát triển kinh tế xanh, COS là giải pháp phù hợp để phát triển nền nông nghiệp hữu cơ an toàn. Thị trường thuốc bảo vệ thực vật sinh học trên thế giới năm 2020 ước tính 4,3 tỷ USD và dự kiến tăng lên 8,5 tỷ USD năm 2025 với tốc độ tăng trưởng 14,7%. Chitosan và COS đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê duyệt cấp phép lưu hành.

II. Thách thức Nấm bệnh hại cà chua và giải pháp từ COS

Cà chua là một loại rau màu quan trọng trên toàn thế giới, với sản lượng hàng năm vượt quá 180 triệu tấn. Tuy nhiên, năng suất cà chua thường bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các bệnh do nấm gây ra. Botrytis cinerea gây ra bệnh thối xám, có thể gây chết non 70% số cây và gây thối quả trong và sau thu hoạch, thiệt hại ước tính từ 10 đến 100 tỷ USD mỗi năm. Fusarium oxysporum gây bệnh héo Fusarium, gây thiệt hại lớn cho nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cà chua. Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để kiểm soát các bệnh này có thể gây ra nhiều vấn đề về môi trường và sức khỏe. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả là vô cùng cần thiết. COS được xem là một giải pháp đầy hứa hẹn. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tối ưu hóa hiệu quả và mở rộng ứng dụng của COS trong bảo vệ cây trồng, đặc biệt là cà chua.

2.1. Các loại nấm bệnh gây hại cà chua phổ biến nhất

Botrytis cinerea gây bệnh thối xám là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất trên cà chua, gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả. Fusarium oxysporum gây bệnh héo Fusarium, làm cây bị héo rũ và chết. Các bệnh khác do nấm gây ra bao gồm bệnh mốc sương, bệnh đốm lá và bệnh thán thư. Việc nhận biết và phòng ngừa các bệnh này là rất quan trọng để bảo vệ năng suất cà chua. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO), 70-80% vi sinh vật gây bệnh thực vật là nấm.

2.2. COS như một giải pháp thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học

COS mang lại tiềm năng lớn để thay thế thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong việc kiểm soát nấm bệnh trên cà chua. COS có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và thân thiện với môi trường, không gây ra các tác dụng phụ tiêu cực như thuốc hóa học. COS có khả năng kích hoạt hệ miễn dịch của cây trồng, giúp cây tự bảo vệ mình trước sự tấn công của nấm bệnh. Hơn nữa, COS có thể được sản xuất từ phế phẩm nông nghiệp, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

III. Phương pháp Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của COS trên cà chua

Các nghiên cứu về hiệu quả của COS đối với bệnh hại cây trồng còn hạn chế. Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu đồng bộ ở mức độ in vitro, in vivo và phân tử về vai trò kiểm soát nấm gây bệnh và khả năng kích kháng của COS đối với cây trồng. Đặc biệt, những nghiên cứu về tính kháng của COS trên mô hình thực vật vẫn còn hạn chế. Luận án “Nghiên cứu hoạt tính kháng một số nấm gây bệnh thực vật và vai trò kích kháng của chito-oligosaccharide trên mô hình cây cà chua” được thực hiện nhằm làm sáng tỏ vai trò của COS trong kiểm soát nấm bệnh. Mục tiêu nghiên cứu là điều chế COS bằng phương pháp thủy phân chitosan sử dụng enzyme chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa. Đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh và tính kích kháng trên mô hình cây cà chua của mẫu COS được tạo ra.

3.1. Điều chế COS bằng enzyme chitinase từ vi sinh vật bản địa

Nghiên cứu điều chế COS sử dụng chitinase từ nguồn vi sinh vật bản địa tại Việt Nam. Phân tích thành phần mẫu COS thu được. Enzyme chitinase có khả năng thủy phân chitin thành COS. Trịnh Thị Vân Anh (2023) đã tạo ra hai loại COS có thành phần oligo khác nhau với DP từ 2-10 bằng phương pháp thuỷ phân sử dụng chitinase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces macrosporeus VTCC 940003 (COSA) và nấm sợi Beauveria bassiana VN10-F1103 (COSB).

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng nấm in vitro và in vivo của COS

Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro của mẫu COS đối với hai đối tượng nấm gây bệnh thực vật B. cinerea và F. oxysporum. Đánh giá khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử nấm và sự phát triển sợi nấm. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vivo của mẫu COS trên lá cây cà chua. Phương pháp nhuộm calcoflour và trypan blue được sử dụng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh.

IV. Kết quả COS kháng nấm và kích kháng cà chua hiệu quả

Kết quả nghiên cứu đã chứng minh COS có khả năng kháng nấm và kích kháng cà chua hiệu quả. COS ức chế sự nảy mầm và phát triển của cả B. cinerea và F. oxysporum in vitro. Trên lá cà chua, COS giảm thiểu sự lây nhiễm nấm bệnh. Hơn nữa, COS kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây cà chua, thể hiện qua việc tăng hoạt động của các enzyme liên quan đến tính kháng như phenylalanin ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), và lipoxygenase (LOX). Các nghiên cứu chỉ ra rằng COS có khả năng kháng hai đối tượng nấm gây bệnh thực vật B. cinerea và F. oxysporum, trong đó, COSA có khả năng kháng nấm B. cinerea tốt hơn COSB.

4.1. COS ức chế nấm bệnh in vitro và in vivo

COS thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh cả trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro) và trên cây trồng thực tế (in vivo). COS có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm, ngăn chặn quá trình xâm nhập và gây bệnh. COS cũng ức chế sự phát triển của sợi nấm, hạn chế sự lan rộng của bệnh. Các thí nghiệm trên lá cà chua cho thấy COS giúp giảm thiểu các triệu chứng bệnh do nấm gây ra.

4.2. COS kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây cà chua

COS kích thích cây cà chua sản xuất các enzyme phòng thủ như PAL, PPO, và LOX, giúp tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh. PAL tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất phenolic, có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm. PPO oxy hóa các hợp chất phenolic, tạo ra các chất độc đối với nấm bệnh. LOX tham gia vào quá trình tổng hợp jasmonic acid, một hormone thực vật quan trọng trong việc điều hòa phản ứng phòng thủ. Mức độ biểu hiện của các PR gen cũng tăng lên sau khi xử lý bằng COS.

V. Kích kháng cà chua Tác động của COS đến enzyme và gen

COS đã được chứng minh là có tác động đáng kể đến enzyme liên quan đến tính kháng của cà chua. Cụ thể, hoạt độ PAL, PPO, và LOX đều tăng lên sau khi xử lý bằng COS, cho thấy khả năng kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây. Bên cạnh đó, COS còn tác động đến sự biểu hiện của các PR gen (protein liên quan đến bệnh lý), những gen đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng bệnh của thực vật. Sự gia tăng biểu hiện của các PR gen cho thấy COS không chỉ kích hoạt các phản ứng sinh hóa mà còn tác động đến biểu hiện gen của cây trồng, giúp tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh.

5.1. Tác động của COS đối với hoạt động enzyme PAL PPO LOX

COS có khả năng kích thích hoạt động của các enzyme PAL, PPO, và LOX, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống phòng thủ của cây cà chua. PAL giúp tổng hợp các hợp chất phenolic, có tính kháng khuẩn và kháng nấm. PPO oxy hóa các hợp chất phenolic, tạo ra các chất độc đối với nấm bệnh. LOX tham gia vào quá trình tổng hợp jasmonic acid, một hormone thực vật quan trọng trong việc điều hòa phản ứng phòng thủ. Sự gia tăng hoạt động của các enzyme này cho thấy COS giúp cây cà chua tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh.

5.2. Ảnh hưởng của COS đến biểu hiện các gen PR PR 1 PR 2 PR 8

COS tác động đến biểu hiện của các gen PR (PR-1, PR-2, PR-8), những gen liên quan đến cơ chế kháng bệnh của thực vật. PR-1 là một protein liên quan đến bệnh lý có tác dụng kháng nấm. PR-2 là một glucanase, phân hủy thành tế bào nấm. PR-8 là một chitinase, phân hủy chitin trong thành tế bào nấm. Sự gia tăng biểu hiện của các gen PR này cho thấy COS không chỉ kích hoạt các phản ứng sinh hóa mà còn tác động đến biểu hiện gen của cây trồng, giúp tăng cường khả năng chống lại nấm bệnh.

VI. Tương lai Ứng dụng COS và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế

Nghiên cứu về COS mở ra nhiều hướng ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp bền vững. Việc phát triển các chế phẩm COS hiệu quả, an toàn và thân thiện với môi trường có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của COS để tối ưu hóa hiệu quả sử dụng. Việc tìm hiểu về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của COS, như nồng độ, thời điểm và phương pháp ứng dụng, sẽ giúp khai thác tối đa tiềm năng của COS trong bảo vệ cây trồng. Các nghiên cứu cần tiếp tục tập trung vào việc phát triển các phương pháp sản xuất COS hiệu quả, chi phí thấp và thân thiện với môi trường.

6.1. Phát triển các chế phẩm COS hiệu quả và bền vững

Việc phát triển các chế phẩm COS hiệu quả và bền vững có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong sản xuất nông nghiệp. Các chế phẩm COS nên được sản xuất từ nguồn nguyên liệu tái tạo, thân thiện với môi trường. Cần nghiên cứu để tối ưu hóa công thức và quy trình sản xuất COS nhằm đảm bảo hiệu quả kháng nấm và kích kháng cao nhất. Bên cạnh đó, cần có các nghiên cứu về độ ổn định và thời hạn sử dụng của các chế phẩm COS để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của COS

Để khai thác tối đa tiềm năng của COS, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của nó. Cần tìm hiểu về các thụ thể trên cây trồng nhận diện COS, các con đường tín hiệu được kích hoạt bởi COS, và các gen được điều hòa bởi COS. Việc hiểu rõ cơ chế tác động của COS sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả sử dụng, phát triển các chiến lược ứng dụng COS phù hợp với từng loại cây trồng và từng loại bệnh hại, và phát triển các loại COS mới với hiệu quả cao hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** TRỊNH THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ VAI TRÒ KÍCH KHÁNG CỦA CHITO-OLIGOSACCHARIDE TRÊN MÔ HÌNH CÂY CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** TRỊNH THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ VAI TRÒ KÍCH KHÁNG CỦA CHITO-OLIGOSACCHARIDE TRÊN MÔ HÌNH CÂY CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: PGS. Dương Văn Hợp GS. Jacques Dommes Hà Nội - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi. Trong quá trình nghiên cứu, một số kết quả có sự cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả luận án Trịnh Thị Vân Anh LỜI CẢM ƠN Luận án này được thực hiện tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN, Việt Nam và phòng Sinh học phân tử Thực vật, khoa Khoa học Sự sống, Đại học Liege, Bỉ. Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Dương Văn Hợp, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học và GS. Jacques Dommes, Đại học Liege, hai người thầy đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình làm luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Hoàng Văn Vinh, chủ trì đề tài “Nâng cấp quy mô sản xuất chế phẩm chitosan oligomer từ nguồn phế liệu vỏ tôm ứng dụng cho bảo vệ thực vật”, QG.87 năm 2016-2019, đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và TS. Nguyễn Quỳnh Uyển, các cô đã giúp tôi tháo gỡ những khó khăn và động viên tôi trong suốt quá trình học tập của mình. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Trịnh Thành Trung, Viện trưởng Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, người đã tạo điều cho tôi trong các công việc của luận án cũng như công việc tại cơ quan. Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hỗ trợ từ đề tài “Nâng cấp quy mô sản xuất chế phẩm chitosan oligomer từ nguồn phế liệu vỏ tôm ứng dụng cho bảo vệ thực vật”, QG. Tôi luôn trân trọng sự hỗ trợ này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả cán bộ của Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, cũng như người thân, gia đình đã luôn ủng hộ, giúp đỡ, động viên và chỉ bảo tôi để tôi có thể hoàn thành luận án này. Hà nội, ngày … tháng … năm 2023 Trịnh Thị Vân Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU . NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ . Thực trạng nấm gây bệnh thực vật . Nấm Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum gây bệnh thực vật . CƠ CHẾ KHÁNG BỆNH Ở THỰC VẬT . Cơ chế kháng thụ động . Rào cản vật lý . Rào cản hóa học. Cơ chế kháng chủ động . Elicitor-phân tử kích kháng thực vật . Phản ứng bảo vệ nhanh . Phản ứng bảo vệ chậm . Chitin, chitosan và COS . Các phương pháp sản xuất COS . ỨNG DỤNG CỦA COS TRONG KIỂM SOÁT BỆNH THỰC VẬT . Hoạt tính kháng trực tiếp đối với các vi sinh vật gây bệnh . Hoạt tính kháng nấm . Hoạt tính kháng vi khuẩn . Hoạt tính kháng virus . Hoạt tính kích kháng thực vật . Protein liên quan đến tính kháng (PR protein) . Các enzyme liên quan đến tính kháng . Một số hợp chất liên quan đến tính kháng của thực vật . Vai trò của COS với con đường truyền tín hiệu . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ CHITOSAN VÀ COS . NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . Chủng vi sinh vật . Giống cây cà chua . Môi trường và hoá chất . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Tuyển chọn các chủng nấm sợi và xạ khuẩn sinh chitinase . Phương pháp cấy trực tiếp . Phương pháp định tính (khuếch tán trên đĩa thạch) . Phương pháp định lượng chitinase . 42 Điện di chitinase trên gel hoạt tính . Định danh chủng vi sinh vật . Xác định đặc điểm hình thái . Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử . Điều chế COS từ chitosan . Phân tích mẫu COS bằng MS-TOF. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro . Đánh giá khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử nấm của COS . Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm của COS . Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vivo. Đánh giá khả năng kháng nấm của COS trên lá cây cà chua . Phương pháp nhuộm calcoflour . Phương pháp nhuộm trypan blue . Nghiên cứu khả năng kích kháng hệ thống trên mô hình cây cà chua . Phương pháp xác định hoạt độ phenylalanin ammonia lyase (PAL) . Phương pháp xác định hoạt độ polyphenol oxidase (PPO) . Phương pháp xác định hoạt độ lipoxygenase (LOX) . Phương pháp định lượng phenol tổng số . Phân tích sự biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-qPCR . Phân tích thống kê . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . ĐIỀU CHẾ VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MẪU COS . Nghiên cứu điều chế COS . Sàng lọc và định danh chủng vi sinh vật sinh chitinase cao . Thu dịch chiết chitinase và điều chế COS . Thành phần mẫu COS . NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM in vitro CỦA MẪU COS . Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm B. cinerea in vitro của mẫu COS . Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm B. Khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm B. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm F. oxysporum in vitro của mẫu COS . Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F. Khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm F. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM in vivo CỦA MẪU COS . ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG CỦA MẪU COS TRÊN MÔ HÌNH CÂY CÀ CHUA . Tác động của COS đối với các enzyme liên quan đến tính kháng . Tác động của COS đối với hoạt độ PAL . Tác động của COS đối với hoạt độ PPO . Tác động của COS đối với hoạt độ LOX . Tác động của COS đối với lượng phenol tổng số . Tác động của COS đối với sự biểu hiện của các PR gen . Lựa chọn gen tham chiếu . Xác định mức độ biểu hiện của các PR gen . 116 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC . 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 132 DANH MỤC HÌNH Hình 1. cinerea trên môi trường PDA (A) và bào tử dưới kính hiển vi (B, C); thể quả (D) và túi bào tử của nấm B. Quả dâu tây (A) và quả mâm xôi (B) bị nhiễm nấm B. cinerea; hoa hồng bình thường (C) và bị nhiễm nấm B. Chu trình sinh trưởng của nấm B. Các hình thái màu sắc sợi nấm F. passiflorae trên các môi trường thạch PDA (A), CMA (B), MALT (C); hình ảnh bào tử của F. lycopersici gây bệnh trên cà chua (A, B); F. cubense gây bệnh trên chuối (C, D) . Chu trình sinh trưởng của Fusarium oxysporum . Cấu trúc một số đại diện phytoalexin . Sự hình thành lớp tế bào cork trong mô lá . Mô hình cơ chế kháng hệ thống (SR) . Cấu trúc phân tử chiti . Cấu trúc phân tử chitosan . Phản ứng chuyển hoá của PAL. Phản ứng chuyển hoá của POD . Phản ứng chuyển hoá của PPO . Phản ứng chuyển hoá của 9-LOX và 13-LOX . Chitin và chitosan đóng vai trò như elicitor đối với thực vật . Sơ đồ tiến trình thí nghiệm trên cây cà chua . Hoạt tính chitinase của các chủng xạ khuẩn (A) và nấm sợi (B) trên đĩa thạch. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự 16S rDNA của chủng VTCC- 940003 với các loài có quan hệ gần gũi . Hình ảnh khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch YS ở 28C (A) và tế bào, bar 5 m (B) của chủng VTCC 940003 . Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự vùng D1/D2 của chủng VN10- F1103 với các loài có quan hệ gần gũi . Hình ảnh khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch PDA ở 28C (A) và cơ quan sinh sản, bar 10 m (B) của chủng B. Hình ảnh điện di gel hoạt tính của chitinase A và chitinase B . Hoạt tính của chủng S. macrosporeus VTCC 940003 và B. bassiana VN10- F1103 trên đĩa thạch. Phổ MS của mẫu COSA (A) và COSB (B). So sánh khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm B. cinerea của COSA, COSB và chitosan sau 72 giờ . Sự nảy mầm của bào tử nấm B. cinerea dưới kính hiển vi sau 16 giờ ở giếng đối chứng và ở giếng xử lý với COSA, COSB hoặc chitosan ở các nồng độ khác nhau. Mức độ ức chế sự phát triển sợi nấm B. cinerea của COSA và COSB . So sánh mức độ ức chế sự phát triển sợi nấm B. cinerea của COSA, COSB và chitosan sau 96 giờ . Hình ảnh sự phát triển sợi nấm B. cinerea trên đĩa PDA đối chứng và PDA chứa COS hoặc chitosan ở các nồng độ khác nhau sau 96 giờ . So sánh khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F. oxysporum của COSA, COSB và chitosan sau 72 giờ . Sự nảy mầm của bào tử nấm F. oxysporum dưới kính hiển vi sau 16 giờ khi không xử lý và xử lý với COS hoặc chitosan ở các nồng độ khác nhau . So sánh khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm F. oxysporum của COSA, COSB và chitosan sau 96 giờ . Hình ảnh sự phát triển sợi nấm F. oxysporum trên đĩa PDA chứa COS hoặc chitosan ở các nồng độ khác nhau . Lá cây cà chua sau 72 giờ trong hộp nhựa . Mức độ bảo vệ lá cây cà chua của COS và chitosan . Hình ảnh vết gây nhiễm ở lá cà chua dưới kính hiển vi . Hình ảnh lá cà chua nhuộm với calcoflour dưới UV . Lá cây cà chua sau 3 ngày gây nhiễm . Hoạt độ PAL ở các mẫu lá số 3, 4, và 5 ngay sau khi xử lý với COSA lần 2 (A) và sau 3 ngày (B) . Hoạt độ PAL ở các mẫu lá số 3, 4 và 5 tại thời điểm T3 .