ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý về tim mạch, trong đó có bệnh về van tim đang gia tăng trên thế giới.000 ngƣời cần thay van tim, dự báo lên tới 850.000 ngƣời trƣớc năm 2050 [89]. Có 2 loại van tim đƣợc sử dụng thay thế van bệnh lý hiện nay đó là: van cơ học và van sinh học bao gồm: van nhân tạo sinh học từ động vật và van đồng loài (homograft). Thực tế, van sinh học đƣợc ƣu tiên sử dụng ở các trung tâm phẫu thuật tim mạch trên thế giới [79]. Ví dụ tại Đức, năm 2008 trong tổng số 12000 bệnh nhân có tới 78% bệnh nhân ghép van sinh học, 21% là ghép van cơ học và chỉ 1% van đƣợc sửa [27].
Van nhân tạo sinh học có nguồn gốc từ động vật nhƣ lợn, bò., đã qua các khâu xử lý, có ƣu điểm là ít phải sử dụng thuốc chống đông, nhƣng lại có thời gian sử dụng rất ngắn, chỉ khoảng 6-8 năm ở ngƣời trẻ tuổi. Để giải quyết tình trạng này, nhiều nhà khoa học đã sử dụng van tim từ ngƣời cho chết não, còn tế bào sống để ghép đồng loài. Trong giai đoạn đầu là kỹ thuật ghép van tim tƣơi – tức là lấy van + bảo quản tƣơi + sử dụng trong vòng 2 tuần. Tuy nhiên, việc lấy và ghép van tim tƣơi từ ngƣời cho chết não thƣờng bị động, mô van tim chỉ sống đƣợc trong một thời gian rất ngắn.
Vì vậy việc chuẩn bị bệnh nhân để ghép phải hết sức khẩn trƣơng. Trong nhiều trƣờng hợp kích thƣớc van tim của ngƣời cho và ngƣời nhận không phù hợp. Để khắc phục hiện tƣợng này, nhằm chủ động đƣợc nguồn cho và nguồn nhận, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu quy trình bảo quản van tim phục vụ cấy ghép đồng loài. Việc bảo quản van tim, mạch máu nhằm giúp cho các bác sỹ lâm sàng luôn có đƣợc nguồn van tim dự trữ để có thể sử dụng một cách chủ động và phù hợp với kích cỡ, chủng loại của từng bệnh nhân cần thay thế.
Van tim lấy từ đồng loài vừa không cần dùng thuốc chống đông, lại có thể sử dụng đƣợc tới trên 20 năm mới thoái hóa, có ƣu thế vƣợt trội các van tim nhân tạo khác. 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Trên thế giới hiện có nhiều qui trình bảo quản van tim, mạch máu cho nhiều mục đích khác nhau. Để có thể sử dụng trên lâm sàng, van tim sau bảo quản lạnh cần phải đảm bảo yêu cầu không biến đổi cấu trúc hình thái cũng nhƣ khả năng sống của tế bào. Nhằm nghiên cứu, ứng dụng qui trình bảo quản lạnh van tim và đánh giá hiệu quả của nó thông qua chất lƣợng van tim sau bảo quản giúp các đơn vị, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim trên thực nghiệm” với hai mục tiêu: 1.
Đánh giá hiệu quả xử lý van tim về khía cạnh vi sinh để ứng dụng làm mô ghép y tế. Đánh giá hình thái cấu trúc mô, siêu cấu trúc và khả năng sống của nguyên bào sợi trong mô van tim lợn sau bảo quản lạnh sâu làm mô ghép y tế. Đây là một phần của đề tài cấp Bộ y tế đã phê duyệt : “Nghiên cứu xây dựng quy trình lấy, bảo quản và ghép van tim đồng loại”. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.
LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN MÔ, TỔ CHỨC VAN TIM Van tim ngƣời tự thân (homograft) đã đƣợc sử dụng trong phẫu thuật cách đây hơn 50 năm. Ca cấy ghép đầu tiên thực hiện bởi Gordon Murray bằng việc sử van động mạch chủ tƣơi tại Toronto đƣợc báo cáo năm 1956 [19]. Bắt đầu từ đó, homograft hay van tim đồng loại đƣợc sử dụng trong ghép van tim. Điều này đƣợc thiết lập rõ ràng bằng việc ghép van động mạch chủ đầu tiên trên lâm sàng của Donald Ross năm 1962 và Barratt Boyes năm 1965 [10, 15].
Vào thời điểm đó, họ là những ngƣời duy nhất thành công trong việc ghép van tim sinh học bên cạnh ghép van cơ học. Những năm sau đó việc xử lý van tim đã có nhiều thay đổi lớn, những van tim ngƣời đầu tiên đƣợc bảo quản sử dụng các tác nhân hóa học nhƣ formalin, glutaraldehyde, betapropriolactone và sau đó là decade ethylene oxide. Van tim nhân tạo đƣợc giới thiệu và sử dụng vào những năm 1960 trƣớc khi mô ghép dị loài ra đời vào những năm 1970 [63]. Tuy nhiên, do kém độ bền lâm sàng và khả năng sống tế bào của mô ghép đồng loại đã qua xử lý hóa học mà việc sử dụng mô ghép loại này ngày càng giảm [20] cho đến khi sử dụng kháng sinh khử trùng liều thấp và sau đó là bảo quản lạnh sâu và bảo quản trong nitơ lỏng ra đời.
Năm 1987, O’Brien đã báo cáo ca ghép van đồng loài bảo quản lạnh sâu cho kết quả sau ghép rất tốt đã mở ra kỷ nguyên mới cho việc sử dụng van đồng loài bảo quản lạnh sâu trên toàn thế giới [62].M và cộng sự đã nghiên cứu trên thực nghiệm bảo quản 15 van tim cừu bằng kỹ thuật bảo quản lạnh không hình thành tinh thể đá. Các van tim đƣợc bảo quản trong dung dịch chứa 12,6 mol/l chất bảo vệ 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com lạnh (4,65 và 3,31 mol/l dimethylsulfoxide, formamide and 1,2-propanediol) và bảo quản ở - 80°C. Trƣớc khi đƣa vào bảo quản lạnh, các van tim đƣợc làm lạnh theo chƣơng trình trong thiết bị đặc biệt. Sau ba tháng, một số van đƣợc lấy ra khỏi môi trƣờng để đánh giá chất lƣợng trên hình ảnh đại thể, vi thể và siêu vi thể.
Kết quả cho thấy không có biểu hiện tổn thƣơng cấu trúc do các tinh thể đá. Các van còn lại đƣợc ghép đồng loại trên cừu. Sau ba và sáu tháng sau ghép, kiểm tra bằng siêu âm doppler cho thấy các van tim hoạt động tốt. Các tác giả nhận xét đây là phƣơng pháp bảo quản lạnh không hình thành tinh thể đá.
Van tim đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp này không bị tổn thƣơng, chức năng hoạt động tốt khi kiểm tra ở hai thời điểm 6 và 12 tháng sau ghép trên cừu [38]. Hiện nay nhiều công trình tập trung nghiên cứu khả năng sống của tế bào sau khi van tim đƣợc bảo quản lạnh. Niwaya K nghiên cứu khả năng sống của tế bào van tim ngƣời ghép đồng loại sau khi đƣợc bảo quản lạnh, Gall KL nghiên cứu khả năng sống của tế bào và quy trình xử lí van tim ghép đồng loại, O'Brien MF nghiên cứu các tế bào trong các van tim ghép đồng loại bảo quản lạnh sâu, Wassenaar C nghiên cứu sự đứt gẫy các mô trong trong van động mạch chủ bảo quản lạnh sâu rã đông nhanh [21, 59, 85]. Tại Việt Nam, từ những năm 1997, Tôn Thất Bách, Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Hữu Ƣớc và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng quy trình lấy và bảo quản van tim từ 21 ngƣời cho chết não.
Tuy nhiên công trình mới chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá khả năng nhiễm khuẩn và biến đổi đại thể sau bảo quản ở các thời điểm khác nhau, tối đa là 118 ngày, chƣa đƣợc ứng dụng trên lâm sàng [3]. Năm 2010, khoa phẫu thuật tim mạch và lồng ngực, Bệnh viện Việt Đức đã cấy ghép thành công hai van tim, một bệnh nhân đƣợc thay van là nam, 35 tuổi, ngƣời Hà Giang, bị hỏng van động mạch chủ, trƣờng hợp còn lại là một 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com cháu bé 11 tuổi, bị dị tật bẩm sinh ở tim và phải ghép van động mạch phổi. Hai van tim này đƣợc lấy từ một bệnh nhân tử vong do chết não - đƣợc ngƣời nhà hiến nội tạng cho bệnh viện. Cho đến nay, đã có hàng chục bệnh nhân đƣợc cấy ghép van tim, mạch máu tƣơi đồng loài lấy từ ngƣời cho chết não tại Bệnh viện Việt Đức.
MỘT SỐ VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN PHƢƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠNH SÂU MÔ VAN TIM Nguyên lý của việc trữ lạnh là khi ở nhiệt độ thấp thì chuyển hóa tế bào giảm, sự tiêu thụ oxy và các chất dinh dƣỡng cũng giảm. Nhờ đó, tế bào sống ở “trạng thái ngủ” và có thể bảo quản trong một thời gian dài. Nhiệt độ của mẫu mô sẽ đƣợc giảm đến mức âm sâu -135OC với hơi nitơ lỏng hay -196OC trong nitơ lỏng. Tuy nhiên, điểm bất lợi đầu tiên gặp phải là các mô, tế bào khi bảo quản ở nhiệt độ âm sâu sẽ có hiện tƣợng hình thành tinh thể đá bên trong và ngoài tế bào gây hậu quả phá hủy màng tế bào, làm giảm khả năng sống của tế bào sau rã đông (hình 1.
Mô hình hình thành tinh thể đá ngoài tế bào [17]. A: Tế bào bình thường; B: Tinh thế đá hình thành khiến tế bào co lại; C: Các tế bào đã bị đè bẹp bởi các những tinh thế đá lớn. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Mô hình hình thành tinh thể đá trong tế bào [17].
A: Nước ở trạng thái lỏng di chuyển tự do trong tế bào; B: Nước hình thành tinh thể đá có thể phá vỡ màng tế bào và dịch chuyển các thành phần trong tế bào. Ngoài ra, bảo quản lạnh mô còn gặp một số khó khăn nhƣ: Mỗi mô là một hỗn hợp của các loại tế bào khác nhau. Một mặt, chúng thể hiện sự nhạy cảm khác nhau với các tổn thƣơng đông lạnh nên việc lựa chọn của một chƣơng trình bảo quản lạnh có thể bảo quản đƣợc một số loại tế bào này, nhƣng có thể gây tổn thƣơng một số loại tế bào khác. Mặt khác, sự không đồng nhất về cấu trúc mô, có thể dẫn đến những nứt, vỡ mô trong quá trình bảo quản lạnh.
Khối lƣợng và hình dạng mô cũng là một yếu tố có thể gây khó khăn nếu mô quá dày hoặc khối lƣợng lớn sẽ ngăn cản cân bằng nhiệt độ ở bề mặt và bên trong mẫu mô, dẫn đến sự không đồng nhất nhiệt độ trong mẫu mô bảo quản lạnh. Quá trình đóng gói ảnh hƣởng đến sự tiếp cận của mô với các chất bảo quản lạnh (CPA) có thể dẫn đến sự trao đổi nƣớc qua màng và hình thành tinh thể đá [93]. Vì vậy, mỗi bƣớc tiến hành trong quy trình bảo quản lạnh sâu đều là những yếu tố tác động đến chất lƣợng của mô sau bảo quản. Cần phải tiến hành các nghiên cứu từng bƣớc giải quyết các vấn đề khó khăn, đem lại kết quả bảo quản tốt nhất, đƣa ra một quy trình bảo quản lạnh sâu phù hợp và thống nhất cho mô van tim.
6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.