Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô

Luận văn nghiên cứu ảnh hưởng chất phân tách tế bào lên tế bào gốc trung mô. Đánh giá sự sống, biểu hiện kháng nguyên, mở ra hướng ứng dụng mới.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Hà
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Trung Nam
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sự Ảnh Hưởng Của Các Chất Phân Tách Tế Bào Tới Sự Sống Và Sự Biểu Hiện Kháng Nguyên Bề Mặt Của Tế Bào Gốc Trung Mô
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
• 1.1.1. Tế bào gốc trung mô
• 1.1.2. Các nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô
• 1.1.3. Đặc điểm chung của tế bào gốc trung mô
• 1.1.4. Khả năng điều hòa miễn dịch và di chuyển của MSC
• 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
• 1.2.1. Nguyên lý sự bám dính của tế bào và các phương pháp phân tách
• 1.2.2. Một số nghiên cứu và các chất phân tách tế bào
• 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu, nguyên vật liệu
• 1.3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2. PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ DÂY RỐN
• 2.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
• 2.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN TÁCH CỦA TRYPSIN VÀ TRYPLE LÊN TẾ BÀO UC-MSC
• 2.2.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VÀ TỶ LỆ SỐNG/CHẤT CỦA TẾ BÀO
• 2.2.2. Đánh giá biểu hiện các marker bề mặt của MSC sau khi xử lý với chất phân tách
• 2.2.3. Thí nghiệm khả năng biệt hóa và nhuộm phát hiện biệt hóa của MSC
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ DÂY RỐN
• 3.2. NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
• 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN TÁCH CỦA TRYPSIN VÀ TRYPLE LÊN TẾ BÀO UC-MSC
• 3.4. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VÀ TỶ LỆ SỐNG/CHẤT CỦA TẾ BÀO
• 3.5. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIẾT HÓA CỦA MSC THÀNH NGUYÊN BÀO XƯƠNG
• 3.6. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN CÁC MARKER BỀ MẶT CỦA TẾ BÀO MSC
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Chất Phân Tách 55

Trong những năm gần đây, liệu pháp tế bào gốc đã phát triển vượt bậc cả trong nghiên cứu in vitro và in vivo. Nhờ các đặc điểm nổi bật của tế bào gốc, như khả năng duy trì đặc tính gốc trong thời gian dài và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau trong điều kiện nhất định, tế bào gốc có khả năng thay thế các tế bào bị tổn thương và điều trị một số bệnh. Đặc điểm này giúp tế bào gốc được sử dụng trong điều trị bỏng sâu, rộng, khôi phục hệ thống máu ở những bệnh nhân bị rối loạn về máu, chữa trị các tổn thương trong gan và não bộ, đồng thời mở ra triển vọng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư [1]. Hiện nay, các loại tế bào gốc không phải là tế bào gốc phôi, bao gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc trung mô (MSC) và tế bào gốc biểu mô, được ứng dụng trong y học thành công hơn cả, mặc dù tiềm năng của chúng ít nhiều bị hạn chế so với tế bào gốc phôi.

1.1. Khái Niệm Về Tế Bào Gốc Trung Mô MSC

Tế bào gốc trung mô (MSC) là một trong những loại tế bào được sử dụng nhiều nhất cho y học tái tạo. Trong những thập kỷ qua, MSC đã được sử dụng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng để điều trị nhiều bệnh lý khác nhau, bao gồm rối loạn thần kinh, thiếu máu cục bộ tim, tiểu đường và các bệnh về xương và sụn [2]. Nhu cầu về MSC ngày càng lớn cho các phương pháp điều trị, nhiệm vụ cấp bách là cần sản xuất một lượng lớn để đáp ứng nhu cầu trên. Lượng tế bào cho một liều điều trị nằm trong khoảng từ 1,5 đến 120 x 10^6 MSC [3].

1.2. Tầm Quan Trọng Của Đánh Giá Ảnh Hưởng Chất Phân Tách

Trong quy trình tăng sinh tế bào gốc, tế bào sản xuất phải được thu hoạch và loại bỏ khỏi bình phản ứng với số lượng lớn và khả năng sống sót cao. Quá trình thu hoạch tế bào có thể ảnh hưởng đến chất lượng các tế bào thu được. Do đó, việc đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp tách đến MSC là điều cần thiết. Hiện nay, mỗi phòng thí nghiệm sử dụng các phương pháp nuôi cấy và phân tách khác nhau, chưa có một quy chuẩn riêng cho quy trình nuôi cấy MSC tiêu chuẩn. Do đó, cần có một quy trình riêng cho từng phòng thí nghiệm để đảm bảo tối ưu cho việc nuôi cấy và thu hoạch MSC [4].

II. Thách Thức Giải Pháp Phân Tách Tế Bào Gốc MSC 58

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của các phương pháp tách khác nhau lên MSC. Tuy nhiên, ở Việt Nam rất ít những nghiên cứu tìm hiểu các ảnh hưởng của các phương tách trên MSC. Hiện này có hai loại enzyme được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào là trypsin và TrypLE. Trong đó, trypsin là một protease serine tuyến tụy với tính đặc hiệu cho các liên kết peptide liên quan đến nhóm carboxyl của các axit amin cơ bản, arginine và lysine, còn TrypLE Express là một protease tái tổ hợp được tạo ra bằng quá trình lên men. Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng của các enzyme lên UC-MSC.

2.1. Mục Tiêu Nghiên Cứu Về Chất Phân Tách Tế Bào

Xuất phát từ những vấn đề trên, tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của trypsin và TrypLE đến đặc điểm của MSC. Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá hiệu quả của hai chất phân tách này trên tế bào gốc trung mô trong các khoảng thời gian khác nhau. Trên cơ sở đó, “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô” được tiến hành với những mục tiêu nghiên cứu cụ thể.

2.2. Các Mục Tiêu Nghiên Cứu Cụ Thể Đặt Ra

Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của hai chất phân tách trong việc tạo thành huyền phù tế bào UC-MSC. Đồng thời, nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng của hai chất phân tách đến khả năng biệt hóa của UC-MSC. Cuối cùng, nghiên cứu sẽ đánh giá ảnh hưởng của hai chất phân tách đến sự biểu hiện các kháng nguyên bề mặt tế bào bằng phương pháp phân tích dòng chảy (flow cytometry).

III. Hướng Dẫn Phân Lập Nuôi Cấy Tế Bào Gốc Trung Mô 59

Tế bào gốc trung mô là một lớp tế bào không đồng nhất có thể được phân lập từ tủy xương, mô mỡ, dây rốn và nhau thai, được phát hiện vào năm 1974 bởi Friedenstein [5]. Năm 1987, Simmon PJ đã đặt tên cho các tế bào này là tế bào nền tủy xương bởi chúng dường như được phát sinh từ những cấu trúc trong tủy xương [6]. Năm 1991, thuật ngữ 'tế bào gốc trung mô' lần đầu tiên sử dụng trong bài báo của Caplan xuất bản năm 1991 [7]. Ngày nay, thuật ngữ 'tế bào gốc trung mô' không chỉ đề cập đến các tế bào mô đệm có nguồn gốc từ tủy xương mà còn dùng để chỉ các tế bào từ nhiều nguồn mô liên kết khác.

3.1. Tiêu Chuẩn Xác Định Tế Bào Gốc Trung Mô Theo ISCT

Theo Hiệp hội trị liệu tế bào quốc tế, các MSC đa năng phải đáp ứng ba tiêu chí sau: có khả năng bám dính nhựa vào bình nuôi cấy; biểu hiện kháng nguyên bề mặt CD105, CD73 và CD90 và thiếu biểu hiện của CD45, CD34, CD14/CD11b, CD79α/CD19 và kháng nguyên bạch cầu người (HLA) lớp II >= 95% và <= 2% quần thể tế bào, tương ứng; và có khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn hoặc tế bào mỡ [10].

3.2. Khả Năng Biệt Hóa Của Tế Bào Gốc Trung Mô

Trong các điều kiện nuôi cấy cụ thể, MSC có thể biệt hóa thành các dòng không thuộc trung bì như tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào tuyến tụy, tế bào cơ tim hoặc tế bào hình sao [11]. Đặc tính này đã được nghiên cứu để phát triển cấy ghép MSC như một liệu pháp tái tạo. Khả năng biệt hóa là một tiêu chí để xác định MSC.

3.3. Đặc Điểm Hình Thái Và Chức Năng Của MSC

Về mặt hình thái, MSC là loại tế bào gốc có hình thái khó phân biệt với nguyên bào sợi hay nguyên bào sao. Ở mức độ vi thể, MSC có hình thoi với kích thước khoảng 10-30 micromet. Đặc điểm siêu cấu trúc của MSC bao gồm [12]: Nhân tế bào lớn, khái niệm sắc thô, bào tương nghèo nàn, lưới nội bào mỏng. Về chức năng, MSC có hai đặc điểm cơ bản của tế bào gốc là khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào.

IV. Bí Quyết Tối Ưu Hóa Khả Năng Sống Tế Bào Gốc MSC 57

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tính điều hòa miễn dịch của MSC. Những tế bào này ảnh hưởng đến phản ứng miễn dịch thông qua tương tác của chúng với các thành phần tế bào của hệ thống miễn dịch: tế bào lympho T, tế bào lympho B, tế bào giết tự nhiên (NK) và tế bào đuôi gai (DC). Điều hòa miễn dịch MSC có thể xảy ra thông qua tiếp xúc với tế bào và/hoặc bằng cách bài tiết các yếu tố khác nhau. Do những đặc tính này, MSC có thể ngăn chặn sự kích hoạt không phù hợp của tế bào lympho T và tạo ra môi trường dung nạp trong quá trình sửa chữa hoặc ngăn chặn phản ứng miễn dịch trong quá trình chữa bệnh, do đó góp phần duy trì cân bằng miễn dịch nội môi [15].

4.1. Khả Năng Di Chuyển Đến Vị Trí Đích Homing Của MSC

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô có khả năng di chuyển đến các vị trí viêm và vi môi trường khối u [17]. Mặc dù cơ chế chính xác vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhưng một số nghiên cứu đã làm rõ các yếu tố có thể chi phối việc di chuyển của MSC. MSC có hai cách di chuyển: cấy cục bộ tại mô đích rồi được dẫn hướng đến vị trí tổn thương qua gradient tín hiệu, hoặc được huy động vào máu rồi trải qua quá trình nhiều bước để thoát khỏi hệ tuần hoàn và di chuyển đến vị trí chấn thương [18].

4.2. Các Nguồn Thu Nhận Tế Bào Gốc Trung Mô

Các nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô bao gồm: tủy xương (BM-MSC), mô mỡ (AD-MSC), tủy răng (DP-MSC). Mỗi nguồn có ưu và nhược điểm riêng liên quan đến quy trình thu thập, số lượng tế bào thu được và khả năng biệt hóa. Việc lựa chọn nguồn thu nhận phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng.

V. Phân Tích Kết Quả Nghiên Cứu Về Chất Phân Tách Tế Bào 56

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của trypsin và TrypLE, hai enzyme phân tách tế bào phổ biến, đối với sự sống sót và biểu hiện kháng nguyên của tế bào gốc trung mô từ dây rốn (UC-MSC). Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tác động của các enzyme này đến chất lượng và chức năng của MSC.

5.1. Ảnh Hưởng Của Trypsin Đến Sự Sống Sót Tế Bào

Phân tích kết quả về sự sống sót của UC-MSC sau khi xử lý bằng trypsin ở các thời điểm khác nhau (5, 30, 60 và 120 phút). Đánh giá xem thời gian xử lý nào mang lại tỷ lệ sống sót tế bào cao nhất, đồng thời xem xét độc tính tiềm ẩn của trypsin đối với UC-MSC.

5.2. Ảnh Hưởng Của TrypLE Đến Sự Biểu Hiện Kháng Nguyên

Phân tích kết quả về biểu hiện kháng nguyên bề mặt của UC-MSC sau khi xử lý bằng TrypLE. Đánh giá xem TrypLE có làm thay đổi biểu hiện của các marker đặc trưng của MSC (CD73, CD90, CD105) hay không, và liệu sự thay đổi này có ảnh hưởng đến khả năng biệt hóa của MSC hay không.

5.3. So Sánh Hiệu Quả Giữa Trypsin Và TrypLE

So sánh trực tiếp hiệu quả của trypsin và TrypLE trong việc phân tách UC-MSC, dựa trên các tiêu chí về sự sống sót, biểu hiện kháng nguyên và khả năng duy trì các đặc tính chức năng của MSC. Xác định enzyme nào phù hợp hơn cho việc thu hoạch MSC trong các ứng dụng nghiên cứu và lâm sàng.

VI. Tương Lai Nghiên Cứu Chất Phân Tách Tế Bào Gốc MSC 52

Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào đến tế bào gốc trung mô, mở ra hướng đi mới cho việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và thu hoạch MSC. Trong tương lai, cần có thêm nhiều nghiên cứu để khám phá các chất phân tách mới và cải tiến quy trình hiện có, nhằm nâng cao chất lượng và hiệu quả của liệu pháp tế bào gốc.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Chất Phân Tách Mới

Nghiên cứu và phát triển các chất phân tách không gây độc hại, bảo tồn tối đa sự sống sót và chức năng của MSC. Tập trung vào các enzyme hoặc phương pháp phân tách không enzyme, giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến tế bào.

6.2. Ứng Dụng Trong Y Học Tái Tạo

Tiếp tục khám phá tiềm năng của tế bào gốc trung mô trong điều trị các bệnh lý khác nhau, từ các bệnh thoái hóa đến các bệnh tự miễn. Phát triển các liệu pháp cá nhân hóa, sử dụng MSC thu được từ chính bệnh nhân để giảm thiểu nguy cơ thải ghép.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong những năm gần đây, tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) đã trở thành đối tượng nghiên cứu trọng tâm trong lĩnh vực y học tái tạo nhờ khả năng tự làm mới và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Theo ước tính, nhu cầu sử dụng MSC trong các liệu pháp điều trị hiện nay nằm trong khoảng 1,5 đến 120 triệu tế bào mỗi liệu trình. Tuy nhiên, việc thu hoạch và phân lập MSC với số lượng lớn, đồng thời duy trì tính sinh học và chức năng của tế bào là một thách thức lớn. Nghiên cứu này tập trung đánh giá ảnh hưởng của hai loại enzyme phân tách tế bào phổ biến là trypsin và TrypLE lên sự sống và biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô lấy từ dây rốn (UC-MSC).

Mục tiêu chính của luận văn là đánh giá hiệu quả phân tách tế bào của hai enzyme trên UC-MSC trong các khoảng thời gian khác nhau (5, 30, 60, 120 phút), đồng thời khảo sát ảnh hưởng của chúng đến khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương và biểu hiện các marker đặc trưng của MSC. Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc và liệu pháp gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2023. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập quy trình chuẩn cho phân lập và nuôi cấy MSC, góp phần nâng cao chất lượng tế bào phục vụ cho các ứng dụng lâm sàng và nghiên cứu sinh học phân tử.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về tế bào gốc trung mô, đặc biệt là:

• Khái niệm tế bào gốc trung mô (MSC): Là loại tế bào không đồng nhất có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành các dòng tế bào trung mô như nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ. MSC được phân lập từ nhiều nguồn mô khác nhau như tủy xương, mô mỡ, dây rốn, nước ối, và mô răng.

• Tiêu chuẩn nhận diện MSC theo Hiệp hội tế bào gốc quốc tế: MSC phải có khả năng bám dính trên bề mặt nhựa trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn, biểu hiện các marker bề mặt CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR.

• Mô hình phân tách tế bào bằng enzyme: Sử dụng enzyme protease như trypsin và TrypLE để phá vỡ các liên kết protein giữa tế bào và bề mặt nuôi cấy, giúp tách tế bào ra khỏi đĩa nuôi cấy mà không làm tổn thương tế bào quá mức.

• Khái niệm biệt hóa tế bào: MSC có khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương, được đánh giá bằng nhuộm Alizarin Red để phát hiện canxi ngoại bào.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu dây rốn được thu thập từ Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, sau đó phân lập tế bào MSC tại phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc và liệu pháp gen.

• Phương pháp phân tích:

  • Phân lập MSC bằng enzym collagenase, nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS.
  • Phân tách tế bào bằng hai enzyme trypsin-EDTA 0,25% và TrypLE trong các khoảng thời gian 5, 30, 60, 120 phút.
  • Đánh giá số lượng tế bào thu được và tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue.
  • Phân tích biểu hiện các marker bề mặt CD73, CD90, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR bằng flow cytometry.
  • Đánh giá khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương bằng nhuộm Alizarin Red sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường biệt hóa.
  • Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2023 với các bước thực hiện tuần tự từ thu thập mẫu, phân lập, nuôi cấy, xử lý enzyme đến phân tích kết quả.

• Cỡ mẫu: Mẫu dây rốn được thu thập từ nhiều trường hợp khác nhau để đảm bảo tính đại diện, mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo độ tin cậy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu quả phân tách tế bào:

   • Trypsin phân tách tế bào UC-MSC nhanh chóng, đạt số lượng tế bào thu được cao nhất ở 5 phút (trung bình 2,45 x 10^6 tế bào), giảm dần còn 1,57 x 10^6 tế bào ở 60 phút.
   • TrypLE cần thời gian lâu hơn để phân tách tế bào, đạt số lượng tối đa ở 30 phút (1,69 x 10^6 tế bào), thấp hơn khoảng 3 lần so với trypsin ở cùng thời điểm 5 phút.

2. Tỷ lệ tế bào sống:

   • Sau xử lý bằng trypsin, tỷ lệ tế bào sống giảm dần theo thời gian, cao nhất là 95,35% ở 5 phút, giảm còn khoảng 84% ở 120 phút.
   • Với TrypLE, tỷ lệ tế bào sống duy trì ổn định trên 90% ở tất cả các khoảng thời gian, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm.

3. Biểu hiện kháng nguyên bề mặt:

   • Cả hai enzyme đều không làm thay đổi biểu hiện âm tính của các marker CD14, CD19, CD34, CD45 và HLA-DR.
   • Marker dương tính CD73 và CD90 giảm nhẹ theo thời gian xử lý enzyme, với trypsin có mức giảm rõ rệt hơn so với TrypLE. Ví dụ, CD73 giảm từ 98,92% (5 phút trypsin) xuống còn 97,92% (120 phút), trong khi TrypLE giảm từ 99,11% xuống 96,28%.

4. Khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương:

   • MSC sau khi xử lý bằng cả hai enzyme đều giữ được khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương, thể hiện qua nhuộm Alizarin Red dương tính rõ ràng sau 14 ngày nuôi cấy biệt hóa.
   • Nhóm đối chứng không xử lý enzyme không có sự nhuộm màu đặc trưng này.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy trypsin có hiệu quả phân tách tế bào nhanh và thu được số lượng tế bào cao hơn so với TrypLE, tuy nhiên lại gây giảm tỷ lệ tế bào sống và ảnh hưởng nhẹ đến biểu hiện các marker bề mặt đặc trưng của MSC khi kéo dài thời gian xử lý. Ngược lại, TrypLE tuy cần thời gian xử lý lâu hơn nhưng duy trì tốt hơn tính toàn vẹn tế bào và biểu hiện marker, đồng thời không ảnh hưởng đến khả năng biệt hóa của tế bào.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả này phù hợp với báo cáo của Tsuji và cộng sự (2017) khi cho thấy TrypLE ít gây tổn thương tế bào hơn trypsin. Tuy nhiên, trypsin vẫn được xem là phương pháp phân tách hiệu quả và phổ biến trong các phòng thí nghiệm do tính nhanh gọn và chi phí thấp. Việc lựa chọn enzyme và thời gian xử lý cần cân nhắc kỹ để tối ưu hóa số lượng tế bào thu được đồng thời bảo toàn chức năng sinh học của MSC.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện số lượng tế bào thu được và tỷ lệ tế bào sống theo từng thời gian xử lý enzyme, cùng biểu đồ đường mô tả sự thay đổi biểu hiện marker CD73 và CD90 theo thời gian. Bảng tổng hợp kết quả nhuộm Alizarin Red cũng giúp minh họa khả năng biệt hóa của các nhóm tế bào.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Lựa chọn enzyme phân tách phù hợp: Khuyến nghị sử dụng trypsin-EDTA 0,25% với thời gian xử lý không quá 5 phút để tối ưu số lượng tế bào thu được và duy trì tỷ lệ tế bào sống cao. Đối với các ứng dụng đòi hỏi bảo toàn tối đa chức năng tế bào, có thể cân nhắc sử dụng TrypLE với thời gian xử lý khoảng 30 phút.

2. Thiết lập quy trình chuẩn cho phân tách MSC: Xây dựng quy trình chuẩn hóa trong phòng thí nghiệm về nồng độ enzyme, thời gian xử lý và điều kiện nuôi cấy nhằm đảm bảo tính đồng nhất và chất lượng tế bào MSC phục vụ nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng trong vòng 6 tháng tới.

3. Đào tạo nhân viên kỹ thuật: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật phân tách tế bào và đánh giá chất lượng tế bào MSC cho cán bộ phòng thí nghiệm nhằm nâng cao kỹ năng và giảm thiểu sai sót trong quy trình.

4. Nghiên cứu mở rộng: Tiến hành các nghiên cứu tiếp theo đánh giá ảnh hưởng của enzyme phân tách lên các chức năng sinh học khác của MSC như khả năng di chuyển, tiết cytokine và tương tác miễn dịch trong vòng 1-2 năm tới để hoàn thiện quy trình ứng dụng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu tế bào gốc và y học tái tạo: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về ảnh hưởng của enzyme phân tách lên MSC, hỗ trợ lựa chọn phương pháp phù hợp trong nghiên cứu và phát triển liệu pháp tế bào.

2. Phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào: Các kỹ thuật viên và quản lý phòng thí nghiệm có thể áp dụng quy trình chuẩn hóa phân tách tế bào để nâng cao hiệu quả thu nhận tế bào và bảo toàn chức năng sinh học.

3. Bác sĩ và chuyên gia điều trị bằng liệu pháp tế bào: Thông tin về chất lượng tế bào sau phân tách giúp đánh giá tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm tế bào trước khi sử dụng trong điều trị lâm sàng.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành Sinh học, Công nghệ sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về phương pháp nghiên cứu tế bào gốc, kỹ thuật phân tách tế bào và đánh giá chức năng tế bào trong môi trường phòng thí nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần phân tách tế bào MSC trước khi sử dụng?
   Phân tách tế bào giúp tách rời các tế bào bám dính trên bề mặt nuôi cấy để thu nhận tế bào đơn lẻ, phục vụ cho các bước nuôi cấy tiếp theo hoặc ứng dụng lâm sàng. Việc này đảm bảo tế bào được đồng nhất và dễ dàng kiểm soát chất lượng.

2. Trypsin và TrypLE khác nhau như thế nào?
   Trypsin là enzyme protease có nguồn gốc từ động vật, hoạt động nhanh nhưng có thể gây tổn thương tế bào nếu xử lý quá lâu. TrypLE là enzyme tái tổ hợp, không chứa nguồn gốc động vật, hoạt động nhẹ nhàng hơn và ít ảnh hưởng đến tế bào nhưng cần thời gian xử lý lâu hơn.

3. Làm thế nào để đánh giá tế bào MSC còn sống sau phân tách?
   Phương pháp nhuộm Trypan Blue được sử dụng phổ biến để phân biệt tế bào sống (không nhuộm màu) và tế bào chết (bắt màu xanh). Tỷ lệ tế bào sống được tính dựa trên số lượng tế bào không nhuộm so với tổng số tế bào.

4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến tế bào MSC là gì?
   Thời gian xử lý enzyme quá dài có thể làm giảm tỷ lệ tế bào sống, làm mất biểu hiện các marker đặc trưng và ảnh hưởng đến chức năng biệt hóa của MSC. Do đó, cần tối ưu thời gian để cân bằng giữa hiệu quả phân tách và bảo toàn tế bào.

5. Tại sao cần đánh giá biểu hiện marker bề mặt của MSC?
   Marker bề mặt như CD73, CD90 là tiêu chuẩn nhận diện MSC theo Hiệp hội tế bào gốc quốc tế. Việc đánh giá giúp xác nhận tính đồng nhất và chất lượng tế bào, đảm bảo tế bào thu được đúng loại và có khả năng ứng dụng trong nghiên cứu và điều trị.

Kết luận

• Nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả và ảnh hưởng của hai enzyme phân tách trypsin và TrypLE lên tế bào gốc trung mô lấy từ dây rốn (UC-MSC) trong các khoảng thời gian xử lý khác nhau.
• Trypsin phân tách tế bào nhanh và thu được số lượng tế bào cao hơn, nhưng ảnh hưởng đến tỷ lệ tế bào sống và biểu hiện marker khi kéo dài thời gian xử lý.
• TrypLE duy trì tốt hơn tính toàn vẹn tế bào và biểu hiện marker, đồng thời không ảnh hưởng đến khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương của MSC.
• Kết quả nghiên cứu góp phần thiết lập quy trình chuẩn cho phân tách và nuôi cấy MSC, nâng cao chất lượng tế bào phục vụ ứng dụng lâm sàng và nghiên cứu.
• Các bước tiếp theo bao gồm chuẩn hóa quy trình, đào tạo nhân sự và mở rộng nghiên cứu đánh giá các chức năng sinh học khác của MSC sau phân tách.

Khuyến nghị: Các phòng thí nghiệm và đơn vị nghiên cứu nên cân nhắc lựa chọn enzyme và thời gian xử lý phù hợp để tối ưu hóa chất lượng tế bào MSC, đồng thời áp dụng quy trình chuẩn hóa nhằm đảm bảo tính đồng nhất và hiệu quả trong ứng dụng y học tái tạo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BÞ GIÁO DĀC VÀ ĐÀO TẠO VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HàC VIàN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà Nguyßn Thß Ngác Hà NGHIÊN CĄU Sþ ¾NH H¯ỞNG CĂA CÁC CHÀT PHÂN TÁCH T¾ BÀO TàI Sþ SÞNG VÀ Sþ BIÂU HIàN KHÁNG NGUYÊN BÀ M¾T CĂA T¾ BÀO GÞC TRUNG MÔ LU¾N VN THẠC SĨ NGÀNH SINH HàC Hà Nßi - 2023 BÞ GIÁO DĀC VÀ ĐÀO TẠO VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HàC VIàN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà Nguyßn Thß Ngác Hà NGHIÊN CĄU Sþ ¾NH H¯ỞNG CĂA CÁC CHÀT PHÂN TÁCH T¾ BÀO TàI Sþ SÞNG VÀ Sþ BIÂU HIàN KHÁNG NGUYÊN BÀ M¾T CĂA T¾ BÀO GÞC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh hãc thực nghiám Mã sá: 8420114 LU¾N VN THẠC SĨ NGÀNH SINH HàC NG¯âI H¯àNG DÀN KHOA HâC: TS. Nguyßn Trung Nam Hà Nßi - 2023 i LâI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm trước phát luật. Tác gi¿ lu¿n vn Nguyßn Thß Ngác Hà ii LâI C¾M ¡N Sau mßt thãi gian tiÁn hành triÅn khai nghiên cću, em cũng đã hoàn thành nßi dung luÃn vn “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất phân tách tế bào tới sự sống và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc trung mô”. LuÃn vn đ°āc hoàn thành không chß là công sćc cąa bÁn thân mà còn có sự giúp đÿ, hỗ trā tích cực cąa nhiÃu cá nhân và tÃp thÅ. Tr°ác hÁt, em xin gÿi lãi cÁm ¢n chân thành và sâu sÅc đÁn TS.

Nguyßn Trung Nam, ng°ãi trực tiÁp h°áng dÁn luÃn vn. Thầy đã dành cho em nhiÃu thãi gian, tâm sćc, cho em nhiÃu ý kiÁn, nhÃn xét quý báu, chßnh sÿa nhāng chi tiÁt nhß trong luÃn vn, giúp luÃn vn cąa em đ°āc hoàn thián h¢n và mÁt nßi dung và hình thćc. Thầy cũng đã luôn quan tâm, đßng viên, nhÅc nhå káp thãi đÅ em có thÅ hoàn thành luÃn vn đúng tiÁn đß. Nghiên cću đ°āc thực hián d°ái sự hỗ trā kinh phí tĉ đà tài: Phát triÅn liáu pháp mái cho bánh não do thiÁu máu căc bß thiÁu oxy sÿ dăng tÁ bào gác t¿o máu kích thích.01/20-22, chą nhiám: TS.

Nguyßn Trung Nam Em xin gÿi lãi cÁm ¢n tái bác sĩ CK2. Trần Trung Kiên và GS. Nguyßn Duy Ánh bánh vián phă sÁn Hà Nßi đã cung cÃp các mÁu nghiên cću đÅ tôi có thÅ hoàn thành luÃn vn này. Em xin trân trãng cÁm ¢n ban Lãnh đ¿o, phòng Đào t¿o, các phòng chćc nng cąa Hãc vián khoa hãc và Công nghá và các thầy cô Khoa Công Nghá Sinh Hãc - Hãc vián Khoa hãc Công nghá - Vián Hàn lâm Khoa hãc và Công nghá Viát Nam và sự d¿y dỗ và chß bÁo tÃn tình trong quá trình em hãc tÃp.

Em xin cÁm ¢n các cán bß Trung tâm nghiên cću ćng dăng tÁ bào gác và liáu pháp gen (STEMREC), Vián Công nghá sinh hãc, đã giúp đÿ và t¿o điÃu kián đÅ em hoàn thián khóa luÃn này. Em cũng xin gÿi lãi cÁm ¢n chân thành đÁn gia đình, b¿n bè vì đã luôn đßng viên, quan tâm giúp đÿ em trong quá trình hãc tÃp và thực hián luÃn vn. iii MĀC LĀC LâI CAM ĐOAN. iii DANH MĂC CÁC CHĀ CÁI VIÀT TÄT .v DANH MĂC HÌNH ÀNH.

vi MỞ ĐÂU. TàNG QUAN NGHIÊN CĄU. TàNG QUAN VÂ TÀ BÀO GàC TRUNG MÔ. TÁ bào gác trung mô.

ĐÁc điÅm chung cąa tÁ bào gác trung mô. Các ngußn thu nhÃn tÁ bào gác trung mô. Y đćc trong các nghiên cću và tÁ bào gác trung mô. CÁC PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÁCH TÀ BÀO GàC TRUNG MÔ.

Nguyên lý sự bám dính cąa tÁ bào. Các ph°¢ng pháp phân tách. Mßt sá nghiên cću và các chÃt phân tách tÁ bào. ĐÞI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU.

ĐàI T¯ĀNG, PH¾M VI NGHIÊN CĆU, NGUYÊN VÂT LIàU. Hóa chÃt, dăng că và vÃt t° tiêu hao. ThiÁt bá sÿ dăng chính. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU.

Phân lÃp tÁ bào gác trung mô tĉ dây rán. Đánh giá khÁ nng phân tách cąa các enzyme lên tÁ bào UC-MSC. Xác đánh sá l°āng và tÿ lá sáng sót cąa UC-MSC sau khi xÿ lý vái chÃt phân tách. Đánh giá biÅu hián các marker bà mÁt cąa MSC sau khi xÿ lý vái chÃt phân tách.

Thí nghiám khÁ nng biát hóa và nhußm phát hián biát hoá cąa MSC.19 iv CH¯¡NG 3. K¾T QU¾ VÀ TH¾O LU¾N. PHÂN LÂP TÀ BÀO GàC TRUNG MÔ TĈ DÂY RàN. NUÔI CÂY TÀ BÀO GàC TRUNG MÔ.

ĐÁNH GIÁ KHÀ NNG PHÂN TÁCH CĄA TRYPSIN VÀ TRYPLE LÊN TÀ BÀO UC-MSC. XÁC ĐàNH Sà L¯ĀNG VÀ Tþ Là SàNG/CHÀT CĄA TÀ BÀO. Sá l°āng và tÿ lá sáng/chÁt cąa tÁ bào sau khi tiÁp xúc vái trypsin. Sá l°āng và tÿ lá sáng/chÁt cąa tÁ bào sau khi tiÁp xúc vái TrypLE.

ĐÁNH GIÁ KHÀ NNG BIàT HÓA CĄA MSC THÀNH NGUYÊN BÀO X¯¡NG. ĐÁNH GIÁ BIÄU HIàN CÁC MARKER B MÀT CĄA TÀ BÀO MSC. Đánh giá biÅu hián các marker bà mÁt cąa tÁ bào MSC sau khi phân tách bằng trypsin. Đánh giá biÅu hián các marker bà mÁt cąa tÁ bào MSC sau khi phân tách bằng TrypLE .44 DANH MĀC TÀI LIàU THAM KH¾O.45 v DANH MĀC CÁC CHĀ CÁI VI¾T TÀT Adipose messenchymal stem cells AD-MSC (TÁ bào gác trung mô tĉ mô mÿ) Amniotic fluid AF (N°ác ái) Amniotic fluid messenchymal stem cells AF-MSC (TÁ bào gác trung mô tĉ n°ác ái) Adipose tissue AT (Mô mÿ) Bone marrow BM (Tąy x°¢ng) Bone marrow messenchymal stem cells BM-MSC TÁ bào gác trung mô tĉ tąy x°¢ng Colony stimulating factor CSF (YÁu tá kích thích b¿ch cầu h¿t) Dendritic cell DC (TÁ bào đuôi gai) Dental pulp DP (Tąy rng) Dental pulp messenchymal stem cells DP-MSC (TÁ bào gác trung mô tĉ tąy rng) Messenchymal stem cells MSC TÁ bào gác trung mô Natural killer NK (TÁ bào giÁt tự nhiên) Umbilical cord UC (Dây rán) Umbilical cord messenchymal stem cells UC-MSC (TÁ bào gác trung mô tĉ dây rán) vi DANH MĀC HÌNH ¾NH Hình 1.

Mßt sá ngußn phân lÃp tÁ bào gác trung mô (Messenchymal Stem Cells). Quá trình phân tách tÁ bào bằng enzyme. Quá trình phân lÃp MSC tĉ dây rán. Quá trình nuôi cÃy tÁ bào gác trung mô.

Hình Ánh tÁ bào đ°āc chăp å đß phóng đ¿i 40X. Hiáu quÁ phân tách tÁ bào cąa trypsin å các thãi gian khác nhau. Hiáu quÁ phân tách tÁ bào cąa trypsin å các thãi gian khác nhau sau 5 ngày nuôi cÃy. Hiáu quÁ phân tách tÁ bào cąa TrypLE å các khoÁng thãi gian khác nhau sau 5 ngày nuôi cÃy.

Hiáu quÁ phân tách tÁ bào cąa TrypLE å các khoÁng thãi gian khác nhau sau 5 ngày nuôi cÃy. Sá l°āng tÁ bào thu đ°āc sau khi sÿ dăng trypsin phân tách å 5, 30, 60 và 120 phút. Sá l°āng tÁ bào UC-MSC sáng (%) sau khi sÿ dăng trypsin phân tách å 5, 30, 60 và 120 phút. Sá l°āng tÁ bào thu đ°āc sau khi sÿ dăng TrypLE phân tách å các khoÁng thãi gian 5, 30, 60 và 120 phút.

Sá tÁ bào UC-MSC sáng (%) sau khi sÿ dăng TrypLE phân tách å các mác thãi gian 5, 30, 60 và 120 phút. Hình Ánh nhußm biát hóa cąa tÁ bào gác trung mô sau khi xÿ lý vái trypsin và TrypLE å các mác thãi gian khác nhau. Mćc đß biÅu hián cąa các kháng nguyên bà mÁt cąa tÁ bào sau khi xÿ lý vái trypsin. Mćc đß biÅu hián cąa các kháng nguyên bà mÁt cąa tÁ bào sau khi xÿ lý vái TrypLE .37 1 MỞ ĐÂU Trong nhāng nm gần đây, nhiÃu nghiên cću đã chćng minh liáu pháp tÁ bào gác có sự phát triÅn v°āt bÃc trong cÁ nghiên cću in vitro và in vivo.

Nhã các đÁc điÅm nái bÃt cąa tÁ bào gác nh° có khÁ nng duy trì đ°āc đÁc tính gác trong thãi gian dài cùng khÁ nng biát hóa thành nhiÃu lo¿i tÁ bào khác nhau trong nhāng điÃu kián nhÃt đánh, nên tÁ bào gác có khÁ nng thay thÁ các tÁ bào bá tán th°¢ng và nhã đó có khÁ nng điÃu trá mßt sá bánh. ĐÁc điÅm này giúp tÁ bào gác có thÅ đ°āc sÿ dăng trong điÃu trá bßng sâu, rßng, khôi phăc há tháng máu å nhāng bánh nhân bá các bánh rái lo¿n và máu, chāa trá các tán th°¢ng trong gan và não bß. Đßng thãi nó må ra triÅn vãng hỗ trā điÃu trá các bánh ung th° [1]. Cho đÁn nay, các lo¿i tÁ bào gác không phÁi là tÁ bào gác phôi bao gßm tÁ bào gác t¿o máu, tÁ bào gác trung mô và tÁ bào gác biÅ mô đ°āc ćng dăng trong y hãc thành công h¢n cÁ mÁc dù tiÃm nng cąa chúng đã ít nhiÃu bá h¿n chÁ h¢n so vái tÁ bào gác phôi.

TÁ bào gác trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) là mßt trong nhāng lo¿i tÁ bào đ°āc sÿ dăng nhiÃu nhÃt cho y hãc tái t¿o. Trong nhāng thÃp kÿ qua, MSC đã đ°āc sÿ dăng trong các nghiên cću tiÃn lâm sàng đÅ điÃu trá nhiÃu bánh lý khác nhau, bao gßm rái lo¿n thần kinh, thiÁu máu căc bß tim, tiÅu đ°ãng và các bánh và x°¢ng và săn [2]. Khi nhu cầu và MSC ngày càng lán cho các ph°¢ng pháp điÃu trá do đó, nhiám vă cÃp bách là cần phÁi sÁn xuÃt mßt l°āng lán đÅ đáp ćng nhu cầu trên. L°āng tÁ bào cho mßt liÃu điÃu trá nằm trong khoÁng tĉ 1,5 đÁn 120 x 106 MSC [3].

Trong quy trình tng sinh tÁ bào gác, tÁ bào sÁn xuÃt phÁi đ°āc thu ho¿ch và lo¿i bß khßi bình phÁn ćng vái sá l°āng lán và khÁ nng sáng sót cao. Quá trình thu ho¿ch tÁ bào có thÅ Ánh h°ång đÁn chÃt l°āng các tÁ bào thu đ°āc. Do đó, viác đánh giá Ánh h°ång cąa các ph°¢ng pháp tách đÁn MSC là điÃu cần thiÁt. Hián nay, mỗi phòng thí nghiám sÿ dăng các ph°¢ng pháp nuôi cÃy và phân tách khác nhau, ch°a có mßt quy chu¿n riêng cho quy trình nuôi cÃy MSC tiêu chu¿n.

Do đó, cần có mßt quy trình riêng cho tĉng phòng thí nghiám đÅ đÁm táin °u cho viác nuôi cÃy và thu ho¿ch MSC [4]. Trên thÁ giái đã có nhāng nghiên cću và Ánh h°ång cąa các ph°¢ng pháp tách khác nhau lên MSC. Tuy nhiên, å Viát Nam rÃt ít nhāng nghiên cću tìm hiÅu các Ánh h°ång cąa các ph°¢ng tách trên MSC. Hián này có hai lo¿i enzyme đ°āc sÿ dăng phá biÁn trong nuôi cÃy tÁ bào là trypsin và 2 TrypLE.