Luận văn Thạc sĩ VNUA: Virus LMLM Type O ở lợn tại miền Bắc 2015-2016

Luận văn thạc sĩ phân tích vnua một số đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type o phân lập được ở lợn tại miền bắc, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Hoàng Văn Tờ
• Người hướng dẫn: TS. Lê Văn Phan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Một Số Đặc Tính Sinh Học Của Virus Lở Mồm Long Móng Type O Phân Lập Được Ở Lợn Tại Miền Bắc Việt Nam Năm 2015 - 2016
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Danh sách các chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Trích yếu luận văn
• Thesis abstract
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới và tại Việt Nam
• 2.1.1. Thông tin chung về bệnh lở mồm long móng
• 2.1.2. Tình hình bệnh LMLM và nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới
• 2.1.3. Tình hình bệnh LMLM và nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam
• 2.2. Đặc điểm sinh học của virus LMLM
• 2.2.1. Sự phân bố các chủng virus gây bệnh
• 2.3. Dịch tễ học
• 2.4. Triệu chứng ở lợn
• 2.5. Các phương pháp chẩn đoán
• 2.6. Phòng bệnh
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 3.1.4. Thời gian nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Chẩn đoán các chủng virus LMLM bằng sinh học phân tử
• 3.2.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng virus LMLM type O phân lập được tại miền bắc Việt Nam
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
• 3.3.2. Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
• 3.3.3. Phương pháp One-step RT-PCR
• 3.3.4. Phương pháp phân lập virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21
• 3.3.5. Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào
• 3.3.6. Phương pháp giải trình tự gen
• 3.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả chẩn đoán các chủng virus LMLM bằng sinh học phân tử
• 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu
• 4.1.2. Kết quả RT-PCR chẩn đoán định tính virus LMLM
• 4.1.3. Kết quả chẩn đoán định type virus LMLM
• 4.2. Kết quả phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus LMLM type O phân lập được
• 4.2.1. Kết quả phân lập virus và xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển
• 4.2.2. Kết quả RT-PCR kiểm tra 4 mẫu virus LMLM type O đã phân lập được
• 4.2.3. Kết quả xác định hiệu giá của virus LMLM type O
• 4.2.4. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của virus trên tế bào
• 4.2.5. Thích nghi virus LMLM type O phân lập trên tế bào BHK-21
• 4.3. Kết quả giải trình tự gen VP1
• 4.3.1. Kết quả phân tích trình tự gen VP1 của các chủng virus LMLM phân lập được
• 4.3.2. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan luận văn VNUA về virus lở mồm long móng type O

Bài viết này phân tích chuyên sâu nội dung luận văn Học viện Nông nghiệp Việt Nam của tác giả Hoàng Văn Tờ, tập trung vào việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type O phân lập được ở lợn tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2015 - 2016. Đây là một công trình nghiên cứu khoa học thú y có giá trị, cung cấp dữ liệu quan trọng về chủng virus đang lưu hành, từ đó định hướng cho công tác phòng chống dịch bệnh. Bối cảnh nghiên cứu cho thấy bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi. Đặc biệt, virus FMD type O có sự biến đổi kháng nguyên liên tục, khiến việc kiểm soát bằng vắc-xin trở nên vô cùng phức tạp. Luận văn được thực hiện nhằm mục tiêu chính là phân lập và xác định các đặc tính sinh học, di truyền của các chủng virus FMD type O thu thập từ thực địa. Các kết quả từ việc phân lập và giám định virus, xác định hiệu giá, đường cong sinh trưởng, và đặc biệt là giải trình tự gen virus FMD vùng VP1, đã cung cấp những thông tin khoa học mới mẻ và hữu ích. Những dữ liệu này không chỉ làm rõ đặc điểm của các chủng virus đang gây bệnh mà còn là cơ sở khoa học vững chắc để lựa chọn chủng virus phù hợp cho sản xuất vắc-xin, phát triển bộ kit chẩn đoán và xây dựng chiến lược kiểm soát tình hình dịch FMD tại Việt Nam một cách hiệu quả hơn trong tương lai. Nghiên cứu này là một minh chứng rõ ràng cho vai trò tiên phong của Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong việc giải quyết các vấn đề cấp thiết của ngành thú y nước nhà.

1.1. Bối cảnh tình hình dịch FMD tại Việt Nam giai đoạn 2015 2016

Giai đoạn 2015-2016, tình hình dịch FMD tại Việt Nam diễn biến phức tạp, đặc biệt tại các tỉnh miền Bắc. Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) liên tục xuất hiện, gây ra các ổ dịch trên đàn lợn, trâu, bò, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế và an sinh xã hội. Theo báo cáo của Cục Thú y, các ổ dịch chủ yếu do serotype O FMDV gây ra. Sự lưu hành dai dẳng của virus, cùng với các hoạt động vận chuyển, buôn bán gia súc thiếu kiểm soát đã làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh trên diện rộng. Việc tiêm phòng vắc-xin dù được triển khai nhưng hiệu quả chưa cao do sự biến đổi liên tục của virus, dẫn đến tình trạng vắc-xin không tương đồng hoàn toàn với chủng virus gây bệnh thực địa. Chính bối cảnh này đã đặt ra yêu cầu cấp thiết phải có những nghiên cứu sâu hơn về các chủng virus đang lưu hành để có giải pháp phòng chống phù hợp.

1.2. Mục tiêu chính của luận văn Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Luận văn của tác giả Hoàng Văn Tờ đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu trọng tâm. Thứ nhất, phân lập và xác định các chủng virus FMD type O từ mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc bệnh tại một số tỉnh miền Bắc. Việc phân lập thành công sẽ tạo ra nguồn virus gốc quan trọng cho các nghiên cứu sâu hơn. Thứ hai, nghiên cứu một số đặc tính sinh học và di truyền của các chủng virus đã phân lập được. Cụ thể là xác định khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus, đường cong sinh trưởng, và quan trọng nhất là phân tích di truyền virus FMD thông qua việc giải trình tự gen VP1 virus FMD. Kết quả nghiên cứu được kỳ vọng sẽ cung cấp thông tin khoa học chính xác về đặc điểm của các chủng virus FMD type O đang lưu hành, làm cơ sở cho việc lựa chọn và sản xuất vắc-xin hiệu quả, góp phần vào chiến lược quốc gia phòng chống bệnh LMLM.

II. Giải mã thách thức Bệnh lở mồm long móng trên lợn ở VN

Bệnh Lở mồm long móng (LMLM) là một bài toán kinh tế và khoa học nan giải. Tại Việt Nam, bệnh lở mồm long móng trên lợn không chỉ gây chết ở lợn con với tỷ lệ cao mà còn làm giảm năng suất nghiêm trọng ở lợn trưởng thành, gây thiệt hại kinh tế trực tiếp cho người chăn nuôi. Về mặt dịch tễ học, bệnh có khả năng lây lan cực nhanh qua nhiều con đường, từ tiếp xúc trực tiếp đến gián tiếp qua không khí, thức ăn, dụng cụ chăn nuôi. Điều này khiến việc khoanh vùng, dập dịch gặp vô vàn khó khăn. Một trong những thách thức lớn nhất đến từ chính tác nhân gây bệnh: virus FMD type O. Virus này thuộc họ Picornaviridae, có 7 serotype chính, trong đó type O là phổ biến nhất tại Việt Nam và trên thế giới. Điểm đặc trưng của virus LMLM là hệ gen ARN, có tốc độ đột biến cao, dẫn đến sự đa dạng về mặt di truyền và kháng nguyên. Sự biến đổi này tạo ra nhiều topotype và dòng (lineage) khác nhau trong cùng một serotype, làm giảm hiệu quả bảo hộ của vắc-xin hiện có. Nếu chủng vắc-xin không tương đồng về mặt kháng nguyên với chủng virus đang gây dịch, gia súc đã tiêm phòng vẫn có nguy cơ mắc bệnh. Do đó, việc giám sát, cập nhật liên tục thông tin về đặc điểm sinh học phân tử virus FMD đang lưu hành là yêu cầu bắt buộc để xây dựng chiến lược phòng bệnh bền vững và hiệu quả.

2.1. Phân tích đặc điểm dịch tễ học lở mồm long móng tại miền Bắc

Đặc điểm dịch tễ học lở mồm long móng tại miền Bắc Việt Nam chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Mật độ chăn nuôi cao, phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán và việc vận chuyển gia súc qua biên giới phức tạp là những điều kiện thuận lợi cho virus phát tán. Luận văn chỉ ra rằng các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ nhiều tỉnh có vị trí địa lý khác nhau như Hà Nam, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Dương. Điều này cho thấy sự lưu hành rộng rãi của virus FMD type O. Các ổ dịch thường bùng phát mạnh vào thời điểm giao mùa, thời tiết thay đổi, khi sức đề kháng của vật nuôi giảm. Sự xuất hiện của các chủng virus mới hoặc biến thể di truyền luôn là một nguy cơ tiềm ẩn, đòi hỏi hệ thống giám sát dịch tễ phải hoạt động liên tục và hiệu quả để phát hiện sớm và cảnh báo kịp thời.

2.2. Khó khăn trong chẩn đoán và phòng ngừa serotype O FMDV

Việc chẩn đoán và phòng ngừa serotype O FMDV (Foot-and-Mouth Disease Virus) đối mặt với nhiều trở ngại. Về chẩn đoán, các triệu chứng lâm sàng của LMLM có thể nhầm lẫn với các bệnh mụn nước khác, đòi hỏi phải có xác nhận từ phòng thí nghiệm. Các phương pháp truyền thống như phân lập virus mất nhiều thời gian, trong khi các phương pháp hiện đại như RT-PCR dù nhanh nhưng cần trang thiết bị và chuyên môn cao. Về phòng ngừa, thách thức lớn nhất là sự đa dạng kháng nguyên của virus FMD type O. Các loại vắc-xin nhập khẩu đôi khi không hoàn toàn phù hợp với các topotype virus FMD đang lưu hành tại Việt Nam. Nghiên cứu của Hoàng Văn Tờ đã chứng minh sự tồn tại của ít nhất hai topotype khác nhau (Cathay và SEA) trong cùng một thời điểm, nhấn mạnh sự cần thiết phải có vắc-xin đa giá hoặc vắc-xin được sản xuất từ chính chủng virus bản địa để đạt hiệu quả bảo hộ tối ưu.

III. Phương pháp phân lập và giám định virus FMD type O từ lợn

Để nghiên cứu đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type O, luận văn đã áp dụng một quy trình khoa học chặt chẽ, kết hợp giữa phương pháp virus học cổ điển và sinh học phân tử hiện đại. Quá trình bắt đầu bằng việc thu thập mẫu bệnh phẩm (biểu mô lưỡi, dịch mụn nước) từ lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình tại các ổ dịch. Các mẫu này sau đó được xử lý để tạo huyễn dịch 10%. Bước tiếp theo và quan trọng nhất là phân lập và giám định virus trên môi trường tế bào. Nghiên cứu sử dụng dòng tế bào thận chuột hamster con (Baby Hamster Kidney - BHK-21), một dòng tế bào rất mẫn cảm với virus LMLM. Huyễn dịch mẫu được gây nhiễm vào lớp tế bào BHK-21 đã phát triển ổn định. Sự hiện diện của virus được xác nhận thông qua việc quan sát bệnh tích tế bào (Cytopathic Effect - CPE) dưới kính hiển vi soi ngược. Các dấu hiệu đặc trưng bao gồm tế bào co tròn, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy, tạo thành các đám như chùm nho. Để khẳng định chắc chắn sự có mặt và định type virus, kỹ thuật phiên mã ngược-phản ứng chuỗi polymerase (One-step RT-PCR) được sử dụng. Đây là một công cụ chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác, cho phép phát hiện vật liệu di truyền (ARN) của virus và xác định cụ thể serotype (O, A, hay Asia 1) dựa trên các cặp mồi đặc hiệu. Quy trình này đảm bảo các chủng virus được phân lập là tinh sạch và được định danh chính xác trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn.

3.1. Quy trình phân lập và giám định virus trên tế bào BHK 21

Quy trình phân lập và giám định virus trên tế bào BHK-21 là nền tảng của nghiên cứu. Tế bào BHK-21 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh thai bê (FBS). Khi tế bào phát triển phủ 80-90% bề mặt chai nuôi, môi trường cũ được loại bỏ và huyễn dịch bệnh phẩm được đưa vào. Sau thời gian hấp phụ, môi trường duy trì được bổ sung và chai nuôi được ủ ở 37°C. Bệnh tích tế bào (CPE) được theo dõi hàng ngày. Kết quả cho thấy, virus phân lập được đã gây CPE rõ rệt, với 80-90% tế bào bị phá hủy sau 48-72 giờ ở đời cấy chuyển thứ 3. Virus sau đó được thu hoạch, ly tâm để loại bỏ xác tế bào và bảo quản ở -80°C. Quá trình này được lặp lại qua nhiều đời cấy chuyển để virus thích nghi và đạt hiệu giá cao, sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Kỹ thuật RT PCR trong xác định đặc tính kháng nguyên

Kỹ thuật RT-PCR đóng vai trò then chốt trong việc xác định nhanh và chính xác đặc tính kháng nguyên (serotype) của virus. Sau khi tách chiết tổng số ARN từ mẫu bệnh phẩm, phản ứng One-step RT-PCR được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu. Luận văn sử dụng cặp mồi chung (1F/1R) để sàng lọc sự hiện diện của virus LMLM, sau đó sử dụng các cặp mồi riêng biệt cho từng type O, A và Asia 1 để định type. Kết quả điện di cho thấy 9/15 mẫu dương tính với virus LMLM, và tất cả 9 mẫu này đều cho vạch sản phẩm có kích thước 658 bp, tương ứng với cặp mồi đặc hiệu cho type O. Các phản ứng với mồi type A và Asia 1 đều cho kết quả âm tính. Điều này khẳng định 100% các chủng virus gây dịch trong phạm vi nghiên cứu thuộc serotype O FMDV.

IV. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử virus FMD type O mới

Sau khi phân lập thành công, việc phân tích đặc điểm sinh học phân tử virus FMD là bước đi cốt lõi để hiểu rõ bản chất của các chủng virus mới. Luận văn đã tiến hành một loạt các thí nghiệm để đánh giá các đặc tính quan trọng, bao gồm khả năng gây bệnh, tốc độ nhân lên và hiệu giá virus. Khả năng gây bệnh được thể hiện qua mức độ phá hủy tế bào (CPE) trên dòng tế bào BHK-21. Kết quả cho thấy các chủng virus phân lập được có độc lực khá cao, có khả năng thích nghi tốt và gây bệnh tích rõ rệt chỉ sau vài đời cấy chuyển. Để xác định động học nhân lên của virus, nghiên cứu đã xây dựng đường cong sinh trưởng. Đường cong này cho thấy virus phát triển nhanh nhất trong khoảng từ 12 đến 48 giờ sau khi gây nhiễm, đạt đỉnh và bước vào pha cân bằng. Sau 72 giờ, hiệu giá virus có xu hướng giảm nhẹ. Đây là thông tin cực kỳ quý giá, giúp xác định "thời điểm vàng" để thu hoạch virus với hiệu giá cao nhất, phục vụ cho sản xuất vắc-xin hoặc kháng nguyên. Hiệu giá virus, được xác định bằng phương pháp TCID50 (50% The Tissue Culture Infectious Dose), là một chỉ số định lượng số lượng hạt virus có khả năng gây nhiễm. Kết quả cho thấy các chủng virus phân lập có hiệu giá tương đối cao và ổn định, dao động từ 10^7.0 đến 10^7.38 TCID50/ml. Mức hiệu giá này đáp ứng yêu cầu cơ bản để làm giống sản xuất vắc-xin.

4.1. Kết quả xác định hiệu giá và đường cong sinh trưởng virus

Việc xác định hiệu giá và xây dựng đường cong sinh trưởng cung cấp cái nhìn định lượng về hoạt lực của virus. Luận văn đã sử dụng phương pháp chuẩn độ TCID50 trên đĩa 96 giếng. Kết quả chuẩn độ cho thấy hiệu giá của 4 chủng virus FMD type O phân lập được rất cao và ổn định qua các đời cấy chuyển, đạt ngưỡng trên 10^7.0 TCID50/ml. Về đường cong sinh trưởng, nghiên cứu chỉ ra rằng sau 12 giờ gây nhiễm, virus bắt đầu nhân lên mạnh mẽ. Hiệu giá đạt mức cao nhất vào thời điểm 48 giờ, sau đó đi vào pha ổn định. Thông tin này rất quan trọng trong thực tiễn, giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và thu hoạch virus trong phòng thí nghiệm cũng như trong sản xuất công nghiệp.

4.2. Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus

Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) là một chỉ số quan trọng phản ánh độc lực của virus trên môi trường in vitro. Luận văn ghi nhận chi tiết quá trình này qua 3 đời cấy chuyển. Ở đời đầu tiên, một số chủng virus gây CPE chậm hoặc không rõ ràng. Tuy nhiên, từ đời thứ hai và thứ ba, tất cả các chủng đều cho thấy khả năng thích nghi tốt, gây bệnh tích nhanh và mạnh. Cụ thể, ở đời thứ ba, chỉ sau 24 giờ đã có khoảng 20-40% tế bào bị phá hủy. Tại thời điểm 48 giờ, tỷ lệ này tăng vọt lên 80-90%. Hình ảnh tế bào co tròn, bong tróc thành từng mảng lớn đã khẳng định độc lực cao của các chủng virus FMD type O đang lưu hành trên đàn bệnh lở mồm long móng trên lợn.

V. Bí quyết giải trình tự gen VP1 và phân tích di truyền virus

Điểm sáng giá nhất trong luận văn là việc áp dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen virus FMD, đặc biệt là vùng gen mã hóa cho protein vỏ VP1. Gen VP1 virus FMD được xem là "dấu vân tay di truyền" vì nó chứa các epitope chính quyết định tính kháng nguyên và sự hình thành miễn dịch. Bất kỳ thay đổi nào trên gen này đều có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của vắc-xin. Quy trình thực hiện bao gồm: khuếch đại đoạn gen VP1 từ ARN của virus bằng RT-PCR, sau đó tinh sạch sản phẩm PCR và gửi đi giải trình tự tại một đơn vị chuyên nghiệp (Công ty Marcrogen, Hàn Quốc). Dữ liệu trình tự thu về được xử lý bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng như BioEdit và DNAstar để phân tích và so sánh. Kết quả phân tích di truyền virus FMD đã mang lại những phát hiện đột phá. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng virus LMLM type O phân lập trong giai đoạn 2015-2016 tại miền Bắc Việt Nam không đồng nhất về mặt di truyền. Chúng thuộc về hai topotype hoàn toàn khác nhau: Cathay và SEA (Southeast Asia). Phát hiện này cực kỳ quan trọng, cho thấy sự lưu hành đồng thời của ít nhất hai dòng virus riêng biệt, đòi hỏi một chiến lược vắc-xin phù hợp để có thể bảo hộ chéo cho cả hai dòng.

5.1. Kết quả giải trình tự gen VP1 virus FMD và so sánh tương đồng

Kết quả giải trình tự gen VP1 virus FMD cho thấy sự khác biệt di truyền đáng kể. Khi so sánh chủng O/VN/HD/2016 (thuộc topotype Cathay) với các chủng Cathay tham chiếu khác tại Việt Nam, mức độ tương đồng nucleotide chỉ đạt 81,8% – 86,6%. Tương tự, các chủng thuộc topotype SEA trong nghiên cứu khi so sánh với các chủng SEA lưu hành trước đó (năm 2014) có độ tương đồng cao hơn (97,9 – 98,5%), nhưng lại khác biệt nhiều hơn so với các chủng giai đoạn 2009–2010 (94,0 – 94,6%). Những con số này chứng minh sự tiến hóa và biến đổi không ngừng của virus theo thời gian, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc giám sát di truyền thường xuyên.

5.2. Xây dựng cây phả hệ virus FMD type O và xác định topotype

Dựa trên dữ liệu trình tự nucleotide của gen VP1, luận văn đã tiến hành xây dựng cây phả hệ virus FMD type O. Cây phả hệ (phylogenetic tree) là một sơ đồ biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus. Kết quả phân tích cây phả hệ đã phân nhóm rõ ràng các chủng virus nghiên cứu. Chủng O/VN/HD/2016 được xếp vào một nhánh riêng cùng với các chủng thuộc topotype virus FMD Cathay. Ba chủng còn lại (O/VN/BN/2016, O/VN/BG1/2016, O/VN/BG2/2016) cùng nằm trên một nhánh khác với các chủng thuộc topotype SEA. Việc xác định chính xác topotype giúp truy xuất nguồn gốc dịch tễ và lựa chọn chủng giống vắc-xin tương đồng nhất về mặt di truyền, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh.

VI. Ứng dụng từ luận văn và tương lai nghiên cứu khoa học thú y

Công trình luận văn Học viện Nông nghiệp Việt Nam của tác giả Hoàng Văn Tờ không chỉ dừng lại ở những kết quả học thuật mà còn mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn và định hướng quan trọng cho tương lai. Những phát hiện từ nghiên cứu này có giá trị to lớn trong việc cải thiện chiến lược phòng chống bệnh lở mồm long móng trên lợn và các loài gia súc khác tại Việt Nam. Việc xác định được sự lưu hành đồng thời của hai topotype virus (Cathay và SEA) là một cảnh báo quan trọng, cho thấy chương trình tiêm phòng cần sử dụng các loại vắc-xin có khả năng bảo hộ rộng, bao phủ được cả hai dòng virus này. Các chủng virus đã được phân lập và đặc trưng hóa trở thành nguồn tài nguyên quý giá, có thể được sử dụng làm chủng giống ứng viên để nghiên cứu và sản xuất vắc-xin nội địa, giảm sự phụ thuộc vào vắc-xin nhập khẩu. Hơn nữa, dữ liệu trình tự gen VP1 là cơ sở để thiết kế các bộ mồi, mẫu dò đặc hiệu hơn cho các phương pháp chẩn đoán phân tử, giúp phát hiện sớm và chính xác các biến thể virus mới. Về lâu dài, các kết quả này đóng góp vào ngân hàng dữ liệu gen quốc gia về virus LMLM, hỗ trợ công tác giám sát dịch tễ học phân tử, truy vết nguồn gốc và dự báo sự tiến hóa của virus. Đây là một bước tiến quan trọng, thúc đẩy hướng nghiên cứu khoa học thú y tại Việt Nam tiệm cận với trình độ thế giới.

6.1. Ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất vắc xin và chẩn đoán

Ý nghĩa thực tiễn của luận văn là rất rõ ràng. Đối với sản xuất vắc-xin, việc cung cấp các chủng virus FMD type O đã được đặc trưng hóa về mặt sinh học và di truyền giúp các nhà sản xuất có cơ sở lựa chọn chủng giống phù hợp nhất với tình hình dịch tễ tại Việt Nam. Một vắc-xin sản xuất từ chủng virus bản địa thường cho hiệu quả bảo hộ cao hơn. Đối với công tác chẩn đoán, thông tin về sự đa dạng của topotype virus FMD giúp cải tiến các bộ kit chẩn đoán, đặc biệt là các kit dựa trên kỹ thuật phân tử, để đảm bảo chúng có thể phát hiện tất cả các biến thể đang lưu hành, tránh trường hợp âm tính giả do mồi không bắt cặp được với trình tự gen của virus đã biến đổi.

6.2. Hướng đi mới cho các nghiên cứu khoa học thú y về FMD

Luận văn này đã mở ra những hướng đi mới cho các nghiên cứu khoa học thú y về FMD tại Việt Nam. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào giải trình tự toàn bộ hệ gen của virus thay vì chỉ một đoạn gen VP1, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh và tiến hóa. Thêm vào đó, cần có các nghiên cứu đánh giá hiệu quả bảo hộ chéo giữa các topotype khác nhau để xây dựng công thức vắc-xin tối ưu. Việc giám sát dịch tễ học phân tử cần được thực hiện một cách hệ thống và liên tục trên quy mô toàn quốc để tạo ra một bản đồ di truyền virus LMLM, giúp dự báo và ứng phó kịp thời với các đợt dịch trong tương lai. Đây là con đường tất yếu để tiến tới mục tiêu kiểm soát và thanh toán bệnh Lở mồm long móng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG VĂN TỜ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP ĐƯỢC Ở LỢN TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM NĂM 2015 - 2016 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Phan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng đượccông bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Văn Tờ i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn.

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo khoa Thú y, các thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thầy kính mến TS. Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Công ty TNHH MTV Avac Việt Nam, đặc biệt là các anh chị tại phòng R&D Lab nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp CH24 TYC, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Văn Tờ ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh sách các chữ viết tắt.

vi Danh Mục Bảng. vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích nghiên cứu. Tổng quan tài liệu. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới và tại việt nam.

Thông tin chung về bệnh lở mồm long móng. Tình hình bệnh LMLM và nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới. Tình hình bệnh LMLM và nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam. Đặc điểm sinh học của virus LMLM.

Sự phân bố các chủng virus gây bệnh. Dịch tễ học. Triệu chứng ở lợn. Các phương pháp chẩn đoán.

Phòng bệnh. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu .20 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Vật liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Chẩn đoán các chủng virus LMLM bằng sinh học phân tử. Nghiên cứu đặt tính sinh học của các chủng virus LMLM type O phân lập được tại miền bắc Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu.

Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm. Phương pháp One-step RT-RCR. Phương pháp phân lập virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21. Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào.

Phương pháp giải trình tự gen. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả nghiên cứu và thảo luận. Kết quả chẩn đoán các chủng virus lmlm bằng sinh học phân tử.

Kết quả thu thập mẫu. Kết quả RT- PCR chẩn đoán định tính virus LMLM. Kết quả chẩn đoán định type virus LMLM. Kết quả phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus LMLM Type o phân lập được.

Kết quả phân lập virus và xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. Kết quả RT-PCR kiểm tra 4 mẫu virus LMLM type O đã phân lập được. Kết quả xác định hiệu giá của virus LMLM type O. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của virus trên tế bào.

Thích nghi virus LMLM type O phân lập trên tế bào BHK-21. Kết quả giải trình tự GEN VP1. Kết quả phân tích trình tự gen VP1 của các chủng virus LMLM phân lập được. 43 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại. Kết luận và kiến nghị .54 Tài liệu tham khảo. 59 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Microlit BHK Baby Hamster Kidney DNA Complement Deoxynucleotide Acid CPE Cytopathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FMDV Foot and Mouth Disease Virus LMLM Lở mồm long móng OIE Office International des Epizooties PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleotide Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction SN Serum Neutralizing TBE Tris Borate EDTA TCID50 50% The Tissue Culture Infectious Dose vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 3. Trình tự cặp mồi dùng trong chẩn đoán và định type virus Lở 20 Bảng 3.

Thành phần phản ứng RT-PCR 23 Bảng 3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 24 Bảng 4. Thông tin mẫu bệnh phẩm nghi mắc LMLM 30 Bảng 4. Kết quả chẩn đoán định tính và định type virus LMLM 32 Bảng 4.

Kết quả gây nhiễm 4 mẫu virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21 34 Bảng 4. Kết quả chuẩn độ virus LMLM type O (10x TCID50/ml) 38 Bảng 4. Hiệu giá của chủng virus LMLM type O qua các đời cấy chuyển (10x TCID50/ml) 40 Bảng 4. Thông tin các chủng virus LMLM type O tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu.

Tỷ lệ tương đồng (%) về gen VP1 của chủng virus O/VN/HD/2016 type O topotype Cathay trong nghiên cứu này với các chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác của Việt Nam 45 Bảng 4. Tỷ lệ tương đồng (%) về amino acid của gen VP1 của chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với các chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác ở Việt Nam 46 Bảng 4. Tỷ lệ tương đồng (%) về gen VP1 giữa các chủng virus LMLM type O topotype SEA trong nghiên cứu này với các chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác của Việt Nam 49 Bảng 4. Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự amino acid của gen VP1 giữa các chủng virus LMLM type O topotype SEA trong nghiên cứu này với các chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác của Việt Nam 51 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Hình thái và cấu tạo virus Lở mồm long móng. Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM. Kết quả chẩn đoán định tính virus LMLM đối với 15 mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng RT-PCR. Kết quả định type virus LMLM bằng phản ứng RT-PCR.

Kết quả theo dõi gây nhiễm của 4 chủng LMLM trên tế bào BHK-21. Kết quả RT-PCR kiểm tra 4 chủng virus LMLM phân lập được. Kết quả RT-PCR kiểm tra 4 chủng virus LMLM phân lập được với mồi định type A LMLM. Kết quả RT-PCR kiểm tra 4 chủng virus LMLM phân lập được với mồi định type Asia1 LMLM.

Đường cong sinh trưởng của 4 chủng virus LMLM theo thời gian. Log10 Hiệu giá của chủng virus LMLM type O qua các đời cấy chuyển. Mức độ tương đồng về nucleotide giữa chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 type O topotype Cathay trong nghiên cứu với các chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác ở Việt Nam. Mức độ tương đồng về amino acid của gen VP1 của chủng virus LMLM O/VN/HD/2016 với các chủng virus LMLM type O topotype Cathay tham chiếu khác ở Việt Nam.

Mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus LMLM type O topotype SEA trong nghiên cứu này với các chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác ở Việt Nam. Mức độ tương đồng về amino acid giữa các chủng virus LMLM type O topotype SEA trong nghiên cứu này với các chủng virus LMLM type O topotype SEA tham chiếu khác ở Việt Nam. Cây phát sinh chủng loại của các chủng virus LMLM type O phân lập tại Việt Nam .52 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Văn Tờ Tên luận văn: “Một số đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type O phân lập được ở lợn tại miền bắc Việt Nam năm 2015 - 2016”. Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Các chủng virus LMLM type O phân lập được sẽ là nguồn vi sinh vật quan trọng phục vụ các nghiên cứu khác như nghiên cứu bảo tồn quỹ gen, nghiên cứu sản xuất vắc xin, nghiên cứu tạo kit chẩn đoán… Cung cấp những thông tin hữu ích về các chủng virus LMLM type O ở lợn đang lưu hành tại Việt Nam làm cơ sở để lựa chọn vắc xin phòng bệnh thích hợp và việc định hướng sản xuất vắc xin trong tương lai.

Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm; Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm; Phương pháp One-step RT-RCR; Phương pháp phân lập virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21; Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào; Phương pháp giải trình tự gen; Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả chính và kết luận - Kết quả chẩn đoán cho thấy có 9/15 mẫu bệnh phẩm thu thập được cho kết quả dương tính với virus LMLM, kết quả định type cho thấy cả 9/9 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus Lở mồm long móng type O. - Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào BHK-21 đã thu được 4 chủng virus LMLM, các chủng virus phân lập được đều gây bệnh tích trên tế bào BHK- 21: Kết quả gây nhiễm virus trên môi trường tế bào cho thấy 80-90% tế bào bị phá hủy sau 48h khi gây nhiễm virus. - Kết quả nghiên cứu về đường cong sinh trưởng của virus cho thấy các chủng virus LMLM phân lập được phát triển nhanh nhất là sau từ 12 đến 48 giờ, sau 48 giờ gây ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.