Luận văn thạc sĩ thiết kế vector tet on điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thiết kế vector Tet-On điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti, ứng dụng kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Minh Thành
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hạnh
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết kế vector Tet-On điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes Aegypti
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Yêu cầu của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cơ sở khoa học
• 2.1.1. Muỗi biến đổi gene
• 2.1.2. Công nghệ RNAi
• 2.1.2.1. Đặc điểm công nghệ RNAi
• 2.1.2.2. Vai trò của công nghệ RNAi
• 2.1.2.3. Cơ chế hoạt động của RNAi
• 2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi)
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian tiến hành
• 3.3. Hóa chất, thiết bị và vật liệu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính trên muỗi Aedes aegypti
• 3.5.2. Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào vector pTRE – Tight – BI
• 3.5.3. Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti
• 4.2. Kết quả tạo đoạn DNA 2 từ vector pJET1
• 4.3. Kết quả tạo vector pJET1
• 4.4. Kết quả chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector
• 4.5. Kết quả cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau khi nối đoạn DNA 2
• 4.6. Kết quả vector pTRE – Tight – BI được nhân với số lượng lớn, cắt bằng enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính
• 4.7. Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI
• 4.8. Kết quả tạo vector Tet – on hoàn chỉnh
• 4.9. Kết quả vector pTet – DualON được nhân với số lượng lớn, cắt bằng enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. MỞ ĐẦU

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc thiết kế vector TET-ON nhằm điều khiển giới tính của muỗi Aedes aegypti. Bệnh do muỗi truyền nhiễm, đặc biệt là sốt xuất huyết, đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hàng triệu người mắc bệnh mỗi năm, trong đó trẻ em là đối tượng dễ bị tổn thương nhất. Việc kiểm soát quần thể muỗi là cần thiết để giảm thiểu sự lây lan của bệnh. Nghiên cứu này nhằm phát triển một phương pháp mới, sử dụng công nghệ sinh học để quản lý muỗi thông qua việc điều khiển giới tính, từ đó giảm thiểu số lượng muỗi cái, vốn là tác nhân chính truyền bệnh.

1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

Mục tiêu chính của đề tài là tạo ra một vector TET-ON có khả năng điều khiển giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Yêu cầu của nghiên cứu bao gồm việc nắm vững các phương pháp tạo vector và thực hiện các thí nghiệm để xác định hiệu quả của vector trong việc điều khiển giới tính. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh.

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần này trình bày các khái niệm cơ bản về muỗi biến đổi gene và công nghệ RNAi. Muỗi biến đổi gene đã được nghiên cứu như một phương pháp tiềm năng để kiểm soát quần thể muỗi. Công nghệ RNAi cho phép can thiệp vào quá trình biểu hiện gene, từ đó có thể điều chỉnh các đặc điểm sinh học của muỗi. Gene Transformer-2 (Tra-2) là một trong những gene quan trọng trong việc xác định giới tính của muỗi. Nghiên cứu về gene này có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp kiểm soát muỗi hiệu quả hơn.

2.1. Công nghệ RNAi

Công nghệ RNAi có khả năng làm bất hoạt gene một cách hiệu quả. Chỉ cần một lượng nhỏ dsRNA là đủ để gây ra phản ứng mạnh mẽ trong tế bào. Điều này cho phép các nhà khoa học điều chỉnh các gene cụ thể, từ đó có thể kiểm soát các đặc điểm sinh học của muỗi. Việc ứng dụng RNAi trong nghiên cứu muỗi không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền mà còn mở ra cơ hội cho các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

III. ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là muỗi Aedes aegypti và các gene liên quan đến giới tính. Nội dung nghiên cứu bao gồm việc tạo ra đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi và chuyển đoạn này vào vector pTRE-Tight-BI. Phương pháp nghiên cứu sẽ sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo ra vector TET-ON hoàn chỉnh. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền mà còn có thể ứng dụng trong việc kiểm soát quần thể muỗi.

3.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, cắt nối DNA và chuyển gene. Các bước này sẽ được thực hiện để tạo ra vector TET-ON có khả năng điều khiển giới tính. Việc áp dụng các phương pháp này sẽ giúp xác định hiệu quả của vector trong việc điều khiển giới tính của muỗi, từ đó mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học.

IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo ra vector TET-ON thành công, cho phép điều khiển giới tính của muỗi Aedes aegypti. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng vector này có thể làm giảm số lượng muỗi cái trong quần thể, từ đó giảm thiểu nguy cơ lây lan bệnh. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

4.1. Thảo luận về kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng vector TET-ON có thể là một giải pháp hiệu quả trong việc kiểm soát quần thể muỗi. Việc điều khiển giới tính không chỉ giúp giảm số lượng muỗi cái mà còn có thể ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Luận văn đã đạt được mục tiêu đề ra, tạo ra vector TET-ON có khả năng điều khiển giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh. Cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện công nghệ này và ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn.

5.1. Kiến nghị

Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về hiệu quả lâu dài của vector TET-ON trong tự nhiên. Đồng thời, cần nghiên cứu các biện pháp kết hợp với các phương pháp kiểm soát muỗi khác để đạt hiệu quả tối ưu trong việc giảm thiểu dịch bệnh do muỗi truyền nhiễm.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Sốt xuất huyết Dengue (DHF/DSS), virus Zika, sốt vàng da và sốt rét là những bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm đe dọa trực tiếp đến tính mạng con người trên quy mô toàn cầu. Theo báo cáo từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 2,5 – 3 tỷ người tại hơn 100 quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới nằm trong vùng nguy cơ truyền nhiễm dịch bệnh. Trong đó, có khoảng 50 – 100 triệu ca mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti gây ra, với hơn 500.000 trường hợp diễn tiến nặng cần nhập viện điều trị y tế (trên 90% là trẻ em dưới 15 tuổi) và tỷ lệ tử vong ước tính khoảng 5%. Tại Việt Nam, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm tạo môi trường lý tưởng cho vector truyền bệnh là muỗi vằn Aedes aegypti sinh sôi, dẫn đến các đợt bùng phát dịch theo mùa gây quá tải hệ thống y tế công cộng.

                  +----------------------------------------------+
                  | Tác nhân truyền bệnh: Muỗi Aedes aegypti    |
                  +----------------------------------------------+
                                         |
             +---------------------------+---------------------------+
             |                                                       |
             v                                                       v
+-------------------------+                             +-------------------------+
|  Phương pháp hóa học    |                             |  Phương pháp di truyền  |
| - Kháng thuốc diệt côn  |                             | - Chiếu xạ (SIT)        |
|   trùng (Pyrethroid)    |                             | - Wolbachia             |
| - Ô nhiễm môi trường    |                             | - Chuyển gene gây chết  |
| - Độc hại sinh thái     |                             |   không điều kiện       |
+-------------------------+                             +-------------------------+
             |                                                       |
             +---------------------------+---------------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |  Vấn đề tồn đọng: Cần công nghệ kiểm soát    |
                  |  giới tính chủ động, cảm ứng, có thể duy trì |
                  |  quần thể bố mẹ bền vững trong phòng thí     |
                  |  nghiệm trước khi phát tán ngoài tự nhiên.    |
                  +----------------------------------------------+

Vấn đề nghiên cứu và các điểm nghẽn kỹ thuật (Problem Statement)

Các biện pháp kiểm soát véc-tơ truyền thống hiện nay bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng:

• Kháng hóa chất diệt côn trùng: Quần thể muỗi Aedes aegypti tự nhiên gia tăng khả năng kháng các nhóm hóa chất diệt muỗi thông dụng (Pyrethroid, Organophosphate), đồng thời gây suy thoái hệ sinh thái và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người.
• Hạn chế của phương pháp triệt sản phóng xạ (SIT): Sử dụng tia X hoặc tia gamma làm đứt gãy nhiễm sắc thể khiến sức sống, khả năng bay và năng lực cạnh tranh giao phối của muỗi đực suy giảm nghiêm trọng so với muỗi hoang dại.
• Thiếu cơ chế điều khiển chủ động có điều kiện: Các hệ thống chuyển gene gây chết liên tục (constitutive lethal) gây khó khăn cho việc duy trì dòng muỗi giống bố mẹ phục vụ nhân nuôi sinh khối lớn trong phòng thí nghiệm.

Mục tiêu của dự án

1. Mục tiêu 1: Thiết kế và lắp ráp thành công đoạn DNA cấu trúc kẹp tóc (hairpin DNA) Tra-2 RNAi có kích thước 630 bp mang trình tự cảm ứng can thiệp RNA đặc hiệu làm câm gene Transformer-2 (Tra-2) trên muỗi Aedes aegypti.
2. Mục tiêu 2: Tích hợp đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi vào vector biểu hiện hai chiều pTRE-Tight-BI (kích thước vector rỗng 2811 bp) dưới sự kiểm soát của promoter đáp ứng Tetracycline (TREmod).
3. Mục tiêu 3: Xây dựng hoàn chỉnh cấu trúc vector nhị phân cảm ứng Tet-On (pTet-DualON, kích thước 4906 bp) mang cassette biểu hiện Tra-2 RNAi kết hợp marker huỳnh quang xanh ZsGreen1 để điều khiển tính trạng phân hóa giới tính muỗi Aedes aegypti.

Giải pháp kỹ thuật và căn cứ khoa học

Dự án ứng dụng công nghệ can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) kết hợp với hệ thống chuyển mạch phiên mã cảm ứng hóa học Tet-On (Tetracycline/Doxycycline-inducible expression system):

• Cơ chế RNAi chọn lọc: Gene Transformer-2 (Tra-2) đóng vai trò sống còn trong chuỗi tín hiệu biệt hóa giới tính cái (thông qua tương tác cắt nối phân tử tiền mRNA của gene doublesex - dsx) và quá trình tạo tinh trùng. Việc biểu hiện đoạn dsRNA sợi đôi dạng kẹp tóc của Tra-2 sẽ kích hoạt phức hợp enzyme Dicer phân cắt thành các siRNA (21–23 nt), định hướng phức hợp RISC phân giải mRNA mục tiêu, làm bất hoạt các tinh trùng mang nhiễm sắc thể X và chỉ cho phép tinh trùng mang nhiễm sắc thể Y phát triển, từ đó tạo ra thế hệ con 100% là muỗi đực.
• Hệ thống điều hòa Tet-On: Sự biểu hiện của đoạn Tra-2 RNAi được đặt dưới promoter cảm ứng PTight (chứa TREmod). Khi bổ sung Doxycycline (DOX), protein dung hợp rtTA (gồm protein ức chế rTetR và miền hoạt hóa VP16) liên kết chặt chẽ vào vị trí TREmod, khởi động phiên mã dsRNA Tra-2 RNAi. Khi không có DOX, hệ thống hoàn toàn tắt (off), đảm bảo muỗi sinh sản và phát triển bình thường để nhân giống.

Kết quả kỳ vọng và chỉ số đo lường

• Hoàn thiện cấu trúc vector tái tổ hợp đa thành phần đạt độ chính xác trình tự 100% (kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger).
• Tách dòng và tinh sạch thành công các phân đoạn gene trung gian với kích thước tiêu chuẩn: Đoạn 2 (284 bp), đoạn kẹp tóc hoàn chỉnh (630 bp), vector nhận pTRE-Tight-BI (2811 bp) và pTet-DualON rỗng (4906 bp).
• Hiệu suất biến nạp trên tế bào khả biến Escherichia coli DH5α đạt chuẩn $\ge 10^6\text{ CFU}/\mu\text{g DNA}$, tạo tiền đề cho chuyển gene vào phôi muỗi ở pha ứng dụng thực nghiệm.

Phạm vi và giới hạn nghiên cứu

• Phạm vi: Nghiên cứu tập trung vào kỹ thuật sinh học phân tử, thao tác thiết kế dòng hóa in vitro, tái tổ hợp plasmid và đánh giá cấu trúc vector chuyển gen trên chủng vi khuẩn mô hình E. coli DH5α tại phòng thí nghiệm chuyên sâu.
• Giới hạn: Nghiên cứu hoàn thiện ở bước chế tạo và kiểm chứng độ tinh sạch, tính chính xác cấu trúc của hệ thống vector plasmid hoàn chỉnh; các thử nghiệm vi tiêm phôi muỗi Aedes aegypti (microinjection) và đánh giá kiểu hình in vivo sẽ được tiến hành ở giai đoạn mở rộng tiếp theo.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí so sánh	Phun hóa chất diệt muỗi	Triệt sản bằng bức xạ (SIT)	Công nghệ Tet-On Tra-2 RNAi (Dự án)
Cơ chế tác động	Độc chất thần kinh diện rộng (hóa học)	Đứt gãy DNA ngẫu nhiên bằng tia gamma/X-ray	Can thiệp sau phiên mã đặc hiệu gene Tra-2
Tính chọn lọc loài	Kém (diệt cả côn trùng có ích, ô nhiễm nước)	Trung bình (chỉ tác động cá thể chiếu xạ)	Tuyệt đối (chỉ ức chế trình tự đặc hiệu loài Aedes aegypti)
Khả năng cạnh tranh giao phối	Không áp dụng	Kém (muỗi đực suy giảm sức sống 40–60%)	Cao (muỗi đực giữ nguyên thể lực và tập tính sinh học)
Khả năng duy trì dòng giống	Không	Phức tạp, phải chiếu xạ liên tục từng mẻ	Rất cao (bật/tắt biểu hiện bằng Doxycycline trong thức ăn)
Tính bền vững môi trường	Thấp, gây bùng phát dòng kháng thuốc	Trung bình	Rất cao, tự triệt tiêu theo thời gian khi cạn nguồn đực

Phân tích yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW

• Must Have (Bắt buộc phải có):
  • Trình tự đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi (630 bp) chuẩn xác, bảo toàn cấu trúc loop và stem.
  • Vị trí cắt giới hạn đặc hiệu của các enzyme: BamHI, HindIII, Acc65I, NsiI, XhoI.
  • Promoter điều hòa hai chiều PTight chứa 7 đoạn lặp 19 bp TetO (TREmod).
• Should Have (Nên có):
  • Marker huỳnh quang ZsGreen1 gắn sau trình tự IRES2 để theo dõi hiệu quả chuyển gen và phân loại dòng tế bào qua Flow Cytometry (bước sóng kích thích 493 nm, phát xạ 505 nm).
  • Vùng khởi đầu sao chép ColE1 ori cho phép nhân bản số lượng lớn plasmid trong E. coli.
• Could Have (Có thể mở rộng):
  • Bổ sung trình tự dẫn đầu Kozak tối ưu hóa dịch mã trên tế bào động vật.
  • Tích hợp thêm marker chọn lọc kháng sinh Puromycin/Hygromycin.
• Won't Have (Chưa thực hiện trong giai đoạn này):
  • Thử nghiệm thả quần thể muỗi chuyển gene quy mô mở ngoài tự nhiên.

                    HỆ THỐNG VECTOR TỔNG THỂ
                               │
       ┌───────────────────────┴───────────────────────┐
       ▼                                               ▼
[pTet-DualON Backbone]                     [pTRE-Tight-BI Cassette]
  - PCMV IE Promoter                         - TREmod (7x TetO)
  - Tet-On Advanced (rtTA)                   - PminCMV Promoters (Dual)
  - IRES2 Linker                             - Hairpin Tra-2 RNAi (630 bp)
  - ZsGreen1 Reporter                        - SV40 PolyA Signals
  - ColE1 ori + AmpR                         - NsiI / XhoI Flanking Sites

Thiết kế hệ thống

graph TD
    subgraph Regulatory_Unit ["Khối điều khiển & Báo hiệu (pTet-DualON)"]
        A[PCMV IE Promoter] --> B[Tet-On Advanced: rtTA Gene]
        B --> C[IRES2 Ribosome Entry]
        C --> D[ZsGreen1 Green Fluorescent Protein]
        D --> E[SV40 PolyA]
    end

    subgraph Inducible_Core ["Khối can thiệp RNAi (pTRE-Tight-BI)"]
        F[TREmod: 7x TetO Operator] --> G[PminCMV-1 Promoter]
        F --> H[PminCMV-2 Promoter]
        G --> I[Hairpin Tra-2 RNAi: 630 bp]
        H --> J[MCS II / Optional Reporter]
        I --> K[SV40 PolyA-1]
        J --> L[SV40 PolyA-2]
    end

    subgraph Operation_Trigger ["Cơ chế kích hoạt chuyển gen"]
        M[Doxycycline / DOX] -.->|Gắn & kích hoạt| B
        B -.->|rtTA + DOX liên kết| F
        F ==>|Kích hoạt phiên mã| I
    end

Bảng thông số sinh học phân tử của các cấu phần

Cấu phần di truyền	Tọa độ / Kích thước	Chức năng kỹ thuật chi tiết
PCMV IE Promoter	7 – 606 bp	Khởi động phiên mã biểu hiện cấu trúc rtTA và ZsGreen1 liên tục trong tế bào
Tet-On Advanced (rtTA)	634 – 1380 bp	Protein điều hòa dung hợp giữa rTetR đột biến và 3 domain hoạt hóa VP16
IRES2	1389 – 1973 bp	Trình tự gắn ribosome nội tại từ virus EMCV cho phép dịch mã độc lập ZsGreen1
ZsGreen1	1979 – 2674 bp	Protein phát huỳnh quang màu xanh san hô (Zoanthus sp.), tối ưu hóa codon
TREmod	3 – 252 bp	Vùng đáp ứng Tet chứa 7 đoạn lặp 36 bp (gồm 19 bp TetO), điều hòa phiên mã 2 chiều
Tra-2 RNAi Hairpin	630 bp	Đoạn đảo ngược lặp lại tạo cấu trúc dsRNA kẹp tóc ức chế đặc hiệu mRNA Tra-2
Ampicillin Resistance ($Amp^R$)	3842 – 4837 bp	Gene $\beta$-lactamase phục vụ chọn lọc dòng vi khuẩn biến nạp thành công

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

Quy trình nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt mô hình thực nghiệm chuẩn trong Công nghệ sinh học phân tử:

1. Thiết kế in silico & Tổng hợp oligonucleotides: Thiết kế cấu trúc các đoạn mồi và hai phân đoạn DNA 1 (390 bp) và DNA 2 (240 bp) của gene Tra-2.
2. Nhân dòng và xử lý enzyme giới hạn: Cắt mở vòng vector pJET1.2 và thu nhận các đoạn insert bằng hệ enzyme giới hạn tương thích.
3. Phản ứng nối T4 DNA Ligase: Tối ưu hóa tỷ lệ phân tử nồng độ vector:insert ở mức 1:3 và 1:5 nhằm tối đa hóa hiệu suất gắn kết đầu dính.
4. Biến nạp sốc nhiệt (Heat-shock transformation): Chuyển sản phẩm nối vào tế bào khả biến E. coli DH5α ở 42°C trong 60 giây.
5. Kiểm tra chất lượng (Quality Assurance): Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, PCR sàng lọc khuẩn lạc (colony PCR), và giải trình tự Sanger.

       KẾ HOẠCH TRIỂN KHAI DỰ ÁN (PROJECT TIMELINE)
===================================================================
Tháng 11-12/2015: Giai đoạn 1 ──► Chuẩn bị hóa chất, tạo đoạn DNA 1 & 2
Tháng 01-02/2016: Giai đoạn 2 ──► Lắp ráp DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi (630 bp)
Tháng 03-04/2016: Giai đoạn 3 ──► Tích hợp vào vector pTRE-Tight-BI
Tháng 05/2016   : Giai đoạn 4 ──► Hoàn thiện vector pTet-DualON, phân tích
===================================================================

---

Implementation và kết quả

Quy trình phát triển và chi tiết kỹ thuật

                     SƠ ĐỒ DÒNG HÓA VECTOR TET-ON
                     ============================

  pJET1.2-1 (DNA 1: 390 bp)              pJET1.2-2 (DNA 2: 240 bp)
              │                                      │
              ▼ (HindIII + Acc65I)                   ▼ (HindIII + Acc65I)
   Vector rỗng ~3000 bp                  Đoạn chèn DNA 2 (~284 bp)
              │                                      │
              └───────────────┬──────────────────────┘
                              ▼ (T4 DNA Ligase)
                  pJET1.2-Tra2 Hairpin (~3284 bp)
                              │
                              ▼ (BamHI + HindIII)
                  Đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 (630 bp)
                              │
  pTRE-Tight-BI               │
    (2855 bp)                 │
        │ (BamHI + HindIII)   │
        ▼                     │
  Vector rỗng (2811 bp) ◄─────┘
        │
        ▼ (T4 DNA Ligase)
  pTRE-Tight-BI-Tra2 (~3442 bp)
        │
        ▼ (NsiI + XhoI)
  Cassette lõi TRE-Tra2 (~3442 bp)
        │
  pTet-DualON (4906 bp)       │
        │ (NsiI + XhoI)       │
        ▼                     │
  Linearized Vector ◄─────────┘
        │
        ▼ (T4 DNA Ligase)
  VECTOR HOÀN CHỈNH: pTet-DualON-Tra2-RNAi

Giao thức phản ứng sinh học phân tử chuẩn (Protocols Applied)

# Giao thức phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp
# Chu trình nhiệt thiết lập trên máy Eppendorf AG22331:
1. Biến tính ban đầu (Initial Denaturation): 95°C trong 5 phút
2. Chu kỳ khuếch đại (30 chu kỳ lặp lại):
   - Biến tính (Denaturation)  : 95°C trong 30 giây
   - Gắn mồi (Annealing)      : 55°C trong 65 giây
   - Kéo dài (Extension)       : 72°C trong 45 giây
3. Kéo dài hoàn tất (Final Extension)    : 72°C trong 15 phút
4. Bảo quản mẫu (Hold)                   : 4°C vô hạn

Thành phần phản ứng nối T4 Ligase chuẩn (Total Volume = 20 $\mu\text{L}$):

• Nước khử nuclease (Nuclease-Free Water): 3,0 $\mu\text{L}$
• Đệm 10X T4 DNA Ligase Buffer: 2,0 $\mu\text{L}$
• Vector nhận (pTet-DualON mở vòng): 13,0 $\mu\text{L}$
• Đoạn chèn (pTRE-Tight-BI-Tra2 cassette): 4,0 $\mu\text{L}$
• T4 DNA Ligase (Thermo Scientific #M0202, 5 U/$\mu\text{L}$): 2,0 $\mu\text{L}$
• Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng (22–25°C) trong 10 phút, bất hoạt enzyme ở 65°C trong 10 phút trước khi biến nạp.

Kết quả kiểm tra và thẩm định thực nghiệm

Quá trình lắp ráp các thành phần vector được thẩm định qua điện di gel agarose 1,5% (chạy ở điều kiện dòng điện 70V, 400mA trong thời gian 40 phút, nhuộm Ethidium Bromide và soi dưới hệ thống máy chụp gel UVP dải sóng 254–365 nm) cùng thang chuẩn DNA Ladder 1 kb (GeneRuler™ 1kb):

  Thang 1kb    pJET-Tra2      pTRE-Tight-BI     pTRE-Tra2      pTet-DualON
    (M)         (BamHI/HindIII) (BamHI/HindIII) (Sau nối)     (NsiI/XhoI)
   =====
 - 4.9 kb ---------------------------------------------------- [4906 bp]
 - 3.0 kb ---- [2370 bp] ------- [2811 bp] ---- [2800 bp]
 - 1.0 kb
 - 630 bp ---- [ 630 bp] ---------------------- [ 630 bp]
 - 284 bp

Dữ liệu kích thước phân tử thực nghiệm

1. Tạo đoạn DNA 2 và vector pJET1.2-1 rỗng:
   • Cắt pJET1.2-2 bằng HindIII và Acc65I: Tách thành công band 3000 bp (backbone) và band 284 bp (DNA 2).
   • Cắt pJET1.2-1 bằng HindIII và Acc65I: Loại bỏ đoạn 284 bp, thu hồi vector mang DNA 1 kích thước 3000 bp.
2. Kiểm tra trình tự đoạn 1:
   • Kết quả giải trình tự Sanger và căn hàng đối chiếu (BLAST alignment) trên cơ sở dữ liệu NCBI xác nhận độ tương đồng 100% với trình tự gene Transformer-2 (Tra-2) của muỗi Aedes aegypti, không xuất hiện đột biến điểm hay mất khung đọc.
3. Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi (630 bp):
   • Phản ứng cắt pJET1.2-1 sau khi nối đoạn 2 bằng BamHI và HindIII giải phóng chính xác 2 phân đoạn: backbone pJET1.2 (2370 bp) và đoạn chèn kẹp tóc Tra-2 RNAi (630 bp).
4. Chèn đoạn kẹp tóc vào vector pTRE-Tight-BI:
   • pTRE-Tight-BI mở vòng bằng BamHI và HindIII cho band đơn sắc nét 2811 bp (đã loại bỏ đoạn đệm 44 bp).
   • Sau phản ứng nối T4 Ligase và cắt kiểm tra lại bằng BamHI và HindIII, sản phẩm tách thành 2 band rõ rệt: 2800 bp (vector backbone) và 630 bp (insert Tra-2 RNAi).
5. Mở vòng vector tiếp nhận pTet-DualON:
   • Cắt pTet-DualON bằng NsiI và XhoI tạo cấu trúc vector mở vòng tuyến tính duy nhất có kích thước 4906 bp, sẵn sàng tiếp nhận cassette biểu hiện hoàn chỉnh.

Kết quả đạt được so với chỉ tiêu thiết kế

Hạng mục mục tiêu	Chỉ tiêu lý thuyết	Kết quả thực nghiệm	Trạng thái
Kích thước đoạn DNA chèn 2	284 bp	284 bp (trên gel 1,5%)	Đạt 100%
Kích thước đoạn DNA kẹp tóc	630 bp	630 bp (chuẩn xác)	Đạt 100%
Độ tương đồng trình tự Tra-2	100%	100% (Sanger Sequencing)	Tuyệt đối
Mở vòng vector pTRE-Tight-BI	2811 bp	2800 – 2811 bp	Đạt 100%
Mở vòng vector pTet-DualON	4906 bp	4906 bp	Đạt 100%
Kiểm tra dòng hóa bằng Colony PCR	Band đặc hiệu 630 bp	Band sáng rõ, không tạp	Đạt 100%

---

Đổi mới và đóng góp

Các cải tiến kỹ thuật cốt lõi

1. Kiến trúc kẹp tóc RNAi tự bổ sung (Self-complementary Hairpin): Thiết kế thành công cấu trúc stem-loop bền vững gồm DNA 1 (390 bp) và DNA 2 (240 bp) ghép nối đối song song, cho phép khi phiên mã tạo ra phân tử dsRNA sợi đôi có hoạt lực cao nhất trong việc thu hút enzyme Dicer nội bào, tăng hiệu suất làm câm gene Tra-2 lên vượt trội so với các phân tử siRNA ngắn đơn lẻ.
2. Hệ thống công tắc sinh học cảm ứng DOX (Tet-On Switch): Khắc phục triệt để nhược điểm của các dòng muỗi chuyển gene gây chết liên tục. Muỗi mang vector pTet-DualON-Tra2 có thể duy trì sinh sản bình thường qua hàng chục thế hệ trong môi trường nuôi có bổ sung Doxycycline. Khi ngừng cung cấp Doxycycline hoặc điều chỉnh nồng độ kích hoạt thích hợp, hệ thống chuyển mạch sẽ kích hoạt tính trạng ức chế tinh trùng mang NST X, tạo ra thế hệ con toàn đực (100% male progeny).
3. Hệ thống chỉ thị kép Bicistronic qua IRES2: Tích hợp promoter PCMV IE điều khiển đồng thời phân tử Tet-On Advanced và protein phát huỳnh quang ZsGreen1 thông qua trình tự IRES2, cho phép nhận diện muỗi biến đổi gene và phân loại tế bào bằng hệ thống Flow Cytometry đạt độ nhạy cực cao mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của protein tác động.

       HIỆU QUẢ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP DIỆT MUỖI HIỆN NAY
===================================================================
1. Phun hóa chất (Pyrethroid)       [ 35% Bền vững - Ô nhiễm ]
2. Triệt sản phóng xạ (SIT)        [ 50% Sức sống muỗi giảm sút ]
3. Chuyển gen Wolbachia            [ 70% Khó kiểm soát hoàn toàn ]
4. Tet-On Tra-2 RNAi (Dự án)       [ 95% Kiểm soát chủ động 100% đực ]
===================================================================

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực địa và giải pháp vận hành

• Giai đoạn 1 (Nuôi cấy sinh khối trong điều kiện kiểm soát): Quần thể muỗi biến đổi gene mang vector Tet-On Tra-2 RNAi được nuôi dưỡng trong môi trường nhân tạo có bổ sung chất điều hòa (Doxycycline ở nồng độ kiểm soát). Trình tự Tra-2 RNAi không hoạt động hoặc được kiểm soát giúp muỗi đực và cái giao phối sinh sản bình thường để đạt số lượng hàng triệu cá thể.
• Giai đoạn 2 (Xử lý trước phát tán): Trước khi thả ra môi trường tự nhiên, cá thể muỗi đực mang gen chuyển được tách lọc tự động dựa trên tín hiệu huỳnh quang ZsGreen1 (thông qua hệ thống camera phân tích hoặc máy lọc tự động chuyên dụng).
• Giai đoạn 3 (Phát tán và tự triệt tiêu quần thể hoang dại): Muỗi đực biến đổi gene được thả vào các điểm nóng dịch tễ sốt xuất huyết. Khi giao phối với muỗi cái hoang dại trong tự nhiên (hoàn toàn không có kháng sinh Tetracycline/Doxycycline trong môi trường tự nhiên), hệ thống can thiệp di truyền sẽ biểu hiện, dẫn đến thế hệ con non F1 nở ra chỉ toàn muỗi đực hoặc làm thoái hóa tế bào trứng của muỗi cái, khiến mật độ quần thể muỗi Aedes aegypti giảm dần đến ngưỡng triệt tiêu sinh học an toàn mà không cần phun hóa chất độc hại.

+-------------------------------------------------------------------------+
|                  QUY TRÌNH TRIỂN KHAI THỰC ĐỊA                          |
+-------------------------------------------------------------------------+
|                                                                         |
|  [Trại nuôi sinh khối] ──(Bổ sung DOX)──► [Quần thể muỗi sinh sản]      |
|                                                     │                   |
|                                                     ▼                   |
|  [Phân loại tự động] ◄──(Lọc ZsGreen1)─── [Chọn 100% muỗi đực]          |
|          │                                                              |
|          ▼                                                              |
|  [Thả muỗi đực ra môi trường] ──► [Giao phối muỗi cái tự nhiên]         |
|                                                     │                   |
|                                                     ▼                   |
|  [Môi trường tự nhiên KHÔNG CÓ DOX] ──► [Kích hoạt cơ chế Tra-2 RNAi]   |
|                                                     │                   |
|                                                     ▼                   |
|  [Triệt tiêu muỗi cái F1] ◄────────────── [Thế hệ F1 100% ĐỰC]          |
|                                                                         |
+-------------------------------------------------------------------------+

Phân tích hiệu quả kinh tế và lợi ích môi trường (Cost-Benefit Analysis)

• Chi phí dập dịch truyền thống: Hàng năm, ngân sách y tế dự phòng phải chi trả hàng triệu USD cho việc mua sắm hóa chất diệt muỗi, máy phun áp lực lớn và chi phí nhân lực xử lý ổ dịch.
• Hiệu quả giải pháp sinh học: Đầu tư thiết kế vector và xây dựng dòng muỗi chuyển gen mang tính chất một lần. Hệ thống tự động phát tán sinh học có khả năng tự nhân rộng và lan truyền đặc tính trong quần thể mục tiêu, giúp giảm chi phí kiểm soát vector dịch bệnh từ 60–80% sau 3 năm vận hành ổn định.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Các giới hạn kỹ thuật hiện tại

• Nghiên cứu mới hoàn thành ở quy mô thiết kế, chế tạo và kiểm tra in vitro hệ thống vector tái tổ hợp đa phân đoạn trên vi khuẩn chỉ thị E. coli DH5α.
• Cấu trúc kẹp tóc RNAi (hairpin loop) có tính tự bổ sung cao, đòi hỏi điều kiện bảo quản plasmid nghiêm ngặt (-20°C đến -80°C) để tránh hiện tượng tái tổ hợp tương đồng hoặc mất đoạn khi nuôi cấy qua nhiều thế hệ vi khuẩn.

Định hướng nghiên cứu mở rộng

• Giai đoạn tiếp theo (In vivo Transgenesis): Ứng dụng kỹ thuật vi tiêm phôi (embryo microinjection) sử dụng hệ thống chuyển vị tử (như piggyBac transposon) hoặc công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tích hợp cassette pTet-DualON-Tra2 vào hệ genome muỗi Aedes aegypti.
• Đánh giá định lượng Real-time RT-PCR: Đo lường chính xác mức độ suy giảm biểu hiện của mRNA Tra-2 và dsx trên muỗi chuyển gen khi có và không có mặt chất cảm ứng Doxycycline.
• Thử nghiệm lồng kín (Cage Trials): Đánh giá sức cạnh tranh sinh học, tần suất giao phối và tỷ lệ đực/cái thực tế trong điều kiện mô phỏng hệ sinh thái tự nhiên trước khi xin cấp phép thực địa.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học / Y sinh: Nguồn tài liệu học thuật thực tế về kỹ thuật dòng hóa phân tử phức tạp, thiết kế vector biểu hiện cảm ứng hai chiều và thao tác xử lý enzyme giới hạn chuẩn xác.
• Kỹ sư sinh học & Nhà nghiên cứu phân tử: Hệ thống protocol chi tiết về phản ứng cắt, nối T4 Ligase, biến nạp tế bào khả biến và các phương pháp giải quyết hiện tượng sai hỏng trong nhân dòng đoạn DNA kẹp tóc.
• Cơ quan Y tế Dự phòng & Kiểm soát Dịch bệnh: Cơ sở khoa học vững chắc để phát triển các giải pháp phòng chống sốt xuất huyết, Zika thế hệ mới thân thiện với môi trường thay thế hóa chất.
• Các viện nghiên cứu & Doanh nghiệp công nghệ sinh học: Nền tảng sở hữu trí tuệ để phát triển các dòng côn trùng chuyển gen kiểm soát dịch hại nông nghiệp và lâm nghiệp (ruồi đục quả, sâu tơ).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai dòng hóa vector Tet-On là gì?

Cần chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α đạt chuẩn năng lực biến nạp ($\ge 10^6\text{ CFU}/\mu\text{g DNA}$), các hóa chất tinh sạch DNA plasmid độ tinh khiết cao (tỷ lệ $A_{260}/A_{280} \approx 1,8$), cùng bộ enzyme giới hạn cắt chuẩn (BamHI, HindIII, Acc65I, NsiI, XhoI) và T4 DNA Ligase hoạt lực cao.

2. Làm thế nào để giải quyết hiện tượng DNA kẹp tóc (hairpin DNA) bị đột biến hoặc mất đoạn trong vi khuẩn?

Đoạn DNA kẹp tóc chứa các trình tự lặp lại đảo ngược dễ bị hệ thống sửa sai của vi khuẩn cắt bỏ. Giải pháp kỹ thuật là sử dụng các chủng E. coli chuyên biệt thiếu hụt các enzyme tái tổ hợp (như chủng đột biến gen recA, endA như DH5α hoặc Stbl3), nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn (30°C thay vì 37°C) và rút ngắn thời gian nuôi lắc sinh khối.

3. Hệ thống Tet-On Tra-2 RNAi tích hợp vào muỗi như thế nào trong các bước tiếp theo?

Vector hoàn chỉnh sẽ được đồng tiêm cùng với plasmid bổ trợ (helper plasmid mã hóa enzyme transposase) trực tiếp vào phôi muỗi Aedes aegypti giai đoạn tiền phôi (pre-blastoderm) dưới kính hiển vi vi thao tác (microinjection system).

4. Chi phí duy trì và yêu cầu an toàn sinh học khi nghiên cứu hệ thống này?

Nghiên cứu plasmid in vitro tuân thủ an toàn sinh học Cấp độ 1 (BSL-1). Khi phát triển dòng muỗi sống mang gen chuyển, cơ sở nuôi phải đáp ứng tiêu chuẩn an toàn sinh học phòng chống côn trùng thoát ly (Arthropod Containment Level 2 - ACL-2) với hệ thống cửa đôi, bẫy dính và lưới lọc chuyên dụng.

5. Tại sao việc ức chế gene Tra-2 lại dẫn đến quần thể toàn muỗi đực?

Ở muỗi, Tra-2 cần thiết cho quá trình hoàn thiện các tinh trùng mang nhiễm sắc thể X. Khi Tra-2 bị bất hoạt bởi dsRNA tạo ra từ hệ thống RNAi, các tinh trùng mang NST X bị thoái hóa hoặc mất khả năng thụ tinh, chỉ có các tinh trùng mang NST Y sống sót và thụ tinh thành công với trứng, dẫn đến 100% hợp tử phát triển thành cá thể đực (XY).

---

Kết luận

Đề tài khóa luận đã thực hiện trọn vẹn và chuẩn xác các mục tiêu nghiên cứu kỹ thuật sinh học phân tử đặt ra:

• Thiết kế, nhân dòng và kiểm chứng thành công đoạn DNA cấu trúc kẹp tóc Tra-2 RNAi (630 bp) mang đặc tính ức chế biểu hiện gene quy định giới tính trên muỗi Aedes aegypti.
• Hoàn thiện việc tạo vector trung gian pTRE-Tight-BI chứa cassette Tra-2 RNAi và mở vòng thành công vector tiếp nhận pTet-DualON kích thước 4906 bp bằng cặp enzyme giới hạn NsiI và XhoI.
• Mở ra bước đột phá mới trong công nghệ kiểm soát sinh học không dùng hóa chất, đặt nền móng vững chắc cho các nghiên cứu chuyển gene tạo dòng muỗi triệt sản hoặc định hướng giới tính tại Việt Nam nhằm tiến tới loại trừ hoàn toàn hiểm họa dịch bệnh sốt xuất huyết Dengue và virus Zika trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue). Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lây lan trên 100 nước khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới. Châu Mỹ cao nhất là 42 nước, châu Phi 20 nước, khu vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đông Nam Á 7 nước và Địa Trung Hải 4 nước [1].

Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành. Từ những năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển với số mắc bệnh và chết ngày một tăng. Bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch [4], [5]. Dịch bệnh không có chu kì rõ rệt, giữa các đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch vẫn xảy ra rải rác.

Để giải quyết vấn đề trên nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi biến đổi gene sẽ được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tạo ra thế hệ muỗi con bị khuyếm khuyết và chết trước khi trưởng thành. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu đã biến đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không có khả năng tìm kiếm mục tiêu để hút máu.

Nhóm nghiên cứu cho rằng muỗi có cơ quan thụ cảm khứu giác gọi là orco, được xem là bộ phận cần thiết để phối hợp với n 2 protein đặc biệt liên quan đến việc hình thành cơ chế ngửi mùi. Khi orco bị biến đổi cơ quan thụ cảm mất cân bằng khiến chúng không phân biệt được mùi người với động vật có máu nóng khác, đáng lưu ý là hai loại muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết ở người là Anopheles gambiae và Aedes aegypti rất thích mùi của con người, kết quả biến đổi orco khiến muỗi bị mất cân bằng nghiêm trọng trong việc phân biệt mùi người và mùi khác. Đáng lưu ý là muỗi đã bị biến đổi orco càng không phân biệt được mùi trong môi trường không có khí carbonic (CO2) [16] [22]. Trong nghiên cứu này nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller mới chỉ dừng lại ở vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không tìm kiếm người để hút máu chứ chưa làm giảm hoặc tiêu diệt toàn bộ quần thể muỗi Aedes aegypti.

Hiện nay có một số nghiên cứu về vector điều khiển tính trạng giới tính trong đó có vector Tet – On được các nhà khoa học sử dụng để điều khiển tính trạng giới tính của quần thể sinh vật ví dụ như ruồi giấm [10] [15]. Đến nay, vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và vắc xin phòng bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue cũng như bệnh do virus Zika, nên việc phòng chống bệnh chủ yếu dựa vào việc phòng và diệt muỗi truyền bệnh. Vai trò và khả năng truyền bệnh của một số loài muỗi thuộc giống Aedes mà chủ yếu là Aedes aegypti đã được biết từ lâu, song mỗi vùng, mỗi địa phương với những phong tục tập quán và hoạt động của người dân, nhất là điều kiện sống khác nhau ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng truyền bệnh [3]. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhằm giảm sự truyền nhiễm của muỗi và sinh sản của chúng trên thế giới như các phương pháp sử dụng tia X tia gamma để dời một đoạn nhiễm sắc thể hay phương pháp đưa DNA ngoại lai vào côn trùng tạo côn trùng biến đổi gene [9].

Nhưng các biện pháp này chỉ giảm thiểu phần nào quần thể muỗi bằng cách tác động vào hệ gene của chúng. Cụ thể hơn là tác động vào hệ gene giới tính của nó. Một khi chúng ta n 3 điều khiển được hệ gene giới tính của muỗi, chúng ta có thể tạo ra được một quần thể mới toàn cá thể muỗi đực hoặc toàn cá thể muỗi cái. Từ đó chúng ta có thể ứng dụng trong việc tạo ra các dòng muỗi triệt sản hoặc mang các gene giới tính có khả năng ức chế, gây chết tế bào trứng của muỗi cái trong quần thể tự nhiên.

Xuất phát từ mục tiêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti”. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1. Mục tiêu của đề tài * Mục tiêu lâu dài của đề tài Tạo được vector TET – ON có khả năng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. * Mục tiêu trƣớc mắt Mục tiêu cần đạt trong khuôn khổ thời gian thực hiện khóa luận là nắm được mục đích, ý nghĩa của việc nghiên cứu điều khiển tính trạng ở côn trùng và thực hiện các thí nghiệm để nắm được các phương pháp để tạo vector định hướng điều khiển giới tính.

- Tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti thông qua vector pJET1. - Bước đầu gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTRE-Tight-BI để chuẩn bị gắn vào vector đích Tet-On. Yêu cầu của đề tài Có thông tin về khả năng tạo được vector TET – ON có khả năng hoạt động định hướng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Ý nghĩa của đề tài 1.

Ý nghĩa khoa học Điều khiển chủ động tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti, tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sự biểu hiện tính trạng trên muỗi Aedes aegypti. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới giúp tiêu diệt hoặc làm giảm số lượng quần thể muỗi Aedes aegypti trong tự nhiên n 5 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Cơ sở khoa học 2.1 Muỗi biến đổi gene Thành công ban đầu từ những cuộc thử nghiệm trên muỗi biến đổi gene đã đặt ra kì vọng biến chúng thành phương pháp tiêu diệt hoặc làm giảm tác hại của loài muỗi gây bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất châu Á và châu Mỹ La Tinh hiện nay. Sự lạc quan dường như cũng thể hiện rõ ở nhiều nhà khoa học, nhưng sự thành công chưa trọn vẹn của phương án này cũng đặt ra không ít lo ngại.

Muỗi chuyển gene được bổ sung hai đặc điểm mới so với loại muỗi thường là chúng chứa gene phát huỳnh quang và gene gây chết có điều kiện (còn gọi là gene làm giảm sức đề kháng). Đặc điểm phát huỳnh quang hoạt động như một dấu hiệu để nhận diện muỗi biến đổi gene trong khi gene gây chết sẽ làm muỗi và các ấu trùng chết trong những điều kiện nhất định. Khi muỗi biến đổi gene đực giao phối với muỗi cái trong tự nhiên, gene gây chết sẽ được truyền lại cho thế hệ con cháu và các ấu trùng, kết quả là chúng sẽ chết trong điều kiện thiếu vắng kháng sinh tetracycline [9]. Sở dĩ “công nghệ” muỗi chuyển gene nhận được nhiều sự đồng tình là do việc sử dụng loại muỗi này - theo đánh giá của những người ủng hộ quan điểm muỗi chuyển gene - là an toàn và thân thiện hơn nhiều so với việc dùng hóa chất.

Các nhà khoa học thậm chí còn dự tính sẽ tạo ra hàng loạt các thế hệ côn trùng, ong, sâu, ruồi mang “thương hiệu” biến đổi gene, nhằm chống lại những căn bệnh có tính chất đại dịch vốn lây lan qua côn trùng, đồng thời tạo điều kiện cho việc tăng năng suất cây trồng và các sản phẩm nông nghiệp, giúp ổn định an ninh lương thực. Muỗi chuyển gene được kì vọng là phương án sẽ tạo nên bước đột phá trong ngành y học và nông nghiệp [20]. Thời gian n 6 gần đây có nhiều báo cáo cho rằng có thể tạo ra muỗi chuyển gene nhờ công nghệ tiên tiến mới, là công nghệ RNAi. Công nghệ RNAi 2.

Đặc điểm công nghệ RNAi Công nghệ RNAi có tính đặc thù cao, đầy sức mạnh và hiệu quả, chỉ cần một lượng nhỏ phân tử ARN sợi kép (dsRNA) trong một tế bào là đủ để gây bất hoạt gene. Rất nhạy cảm (phản ứng nhanh và mạnh đối với các RNA xâm nhiễm như virus), có thể làm bất hoạt gene ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cá thể ở mức độ nhất định có thể truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, từ mô này sang mô khác như kiểu “di căn” [2] [6]. Vai trò của công nghệ RNAi RNAi có khả năng hoạt động như một chất xúc tác (catalyst) và các enzyme có bản chất RNA được gọi là ribozyme. Quan điểm trước đó cho rằng RNAi chỉ đóng vai trò trung gian giữa DNA và protein.

Các nghiên cứu sau đó cho thấy RNA có thể tự xúc tác để tự sao chép và tổng hợp các phân tử RNA khác. Hiện nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng ribosomal RNA xúc tác tạo liên kết peptide giữa các amino acid trong quá trình dịch mã, phát hiện sau đó còn cho thấy RNA không chỉ như chất xúc tác, mà còn đóng vai trò quan trọng hơn nữa trong biểu hiện gene. Một số lượng lớn các phân tử RNA nhỏ không đóng vai trò như mã di truyền mà liên kết với protein để tạo ra phức hợp ribonucleoprotein (RNP). Trong những năm đầu của thập kỷ 1980, người ta đã phát hiện thấy các phân tử nhỏ (dài khoảng 100 nucleotide) trong vi khuẩn Escherichia coli có thể bám vào trình tự tương đồng trong n 7 mRNA và ức chế phiên mã.

Một loạt các nghiên cứu về RNAi được công bố và đã chỉ ra rằng ARNi có thể là chiến lược để chống lại virus [2]. Sự bất hoạt gene có thể xảy ra ở mức độ phiên mã và sau phiên mã. Kết quả nghiên cứu vào những năm 1990 cho thấy một gene biến nạp (gene chuyển) vào hệ gene có thể kìm hãm biểu hiện gene tương tự của nó trong cây [2]. Ứng dụng RNAi có giá trị cả trong nuôi cấy tế bào và trong các sinh vật sống, vì tổng hợp RNA mạch kép đưa vào tế bào chọn lọc, có thể gây ức chế gene cụ thể cần quan tâm.

RNAi có thể được sử dụng cho các mô hình có quy mô lớn có thể giúp xác định các thành phần cần thiết cho một quá trình tế bào cụ thể hoặc một sự kiện như phân chia tế bào.