Luận văn thạc sĩ thiết kế vector tet on điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi aedes aegypti

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thiết kế vector Tet-On điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti, ứng dụng kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Minh Thành
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hạnh
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết kế vector Tet-On điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes Aegypti
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Yêu cầu của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cơ sở khoa học
• 2.1.1. Muỗi biến đổi gene
• 2.1.2. Công nghệ RNAi
• 2.1.2.1. Đặc điểm công nghệ RNAi
• 2.1.2.2. Vai trò của công nghệ RNAi
• 2.1.2.3. Cơ chế hoạt động của RNAi
• 2.1.3. Gene biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Transformer-2 RNAi)
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thời gian tiến hành
• 3.3. Hóa chất, thiết bị và vật liệu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính trên muỗi Aedes aegypti
• 3.5.2. Chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính vào vector pTRE – Tight – BI
• 3.5.3. Tạo vector Tet – On hoàn chỉnh
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định giới tính muỗi Aedes aegypti
• 4.2. Kết quả tạo đoạn DNA 2 từ vector pJET1
• 4.3. Kết quả tạo vector pJET1
• 4.4. Kết quả chuyển đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector
• 4.5. Kết quả cắt đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi từ pJET1.2-1 sau khi nối đoạn DNA 2
• 4.6. Kết quả vector pTRE – Tight – BI được nhân với số lượng lớn, cắt bằng enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính
• 4.7. Kết quả chèn đoạn DNA kẹp tóc quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector pTRE – Tight - BI
• 4.8. Kết quả tạo vector Tet – on hoàn chỉnh
• 4.9. Kết quả vector pTet – DualON được nhân với số lượng lớn, cắt bằng enzyme nhằm tạo vector rỗng để nhận đoạn lõi
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. MỞ ĐẦU

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc thiết kế vector TET-ON nhằm điều khiển giới tính của muỗi Aedes aegypti. Bệnh do muỗi truyền nhiễm, đặc biệt là sốt xuất huyết, đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hàng triệu người mắc bệnh mỗi năm, trong đó trẻ em là đối tượng dễ bị tổn thương nhất. Việc kiểm soát quần thể muỗi là cần thiết để giảm thiểu sự lây lan của bệnh. Nghiên cứu này nhằm phát triển một phương pháp mới, sử dụng công nghệ sinh học để quản lý muỗi thông qua việc điều khiển giới tính, từ đó giảm thiểu số lượng muỗi cái, vốn là tác nhân chính truyền bệnh.

1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

Mục tiêu chính của đề tài là tạo ra một vector TET-ON có khả năng điều khiển giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Yêu cầu của nghiên cứu bao gồm việc nắm vững các phương pháp tạo vector và thực hiện các thí nghiệm để xác định hiệu quả của vector trong việc điều khiển giới tính. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh.

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần này trình bày các khái niệm cơ bản về muỗi biến đổi gene và công nghệ RNAi. Muỗi biến đổi gene đã được nghiên cứu như một phương pháp tiềm năng để kiểm soát quần thể muỗi. Công nghệ RNAi cho phép can thiệp vào quá trình biểu hiện gene, từ đó có thể điều chỉnh các đặc điểm sinh học của muỗi. Gene Transformer-2 (Tra-2) là một trong những gene quan trọng trong việc xác định giới tính của muỗi. Nghiên cứu về gene này có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp kiểm soát muỗi hiệu quả hơn.

2.1. Công nghệ RNAi

Công nghệ RNAi có khả năng làm bất hoạt gene một cách hiệu quả. Chỉ cần một lượng nhỏ dsRNA là đủ để gây ra phản ứng mạnh mẽ trong tế bào. Điều này cho phép các nhà khoa học điều chỉnh các gene cụ thể, từ đó có thể kiểm soát các đặc điểm sinh học của muỗi. Việc ứng dụng RNAi trong nghiên cứu muỗi không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền mà còn mở ra cơ hội cho các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

III. ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là muỗi Aedes aegypti và các gene liên quan đến giới tính. Nội dung nghiên cứu bao gồm việc tạo ra đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi và chuyển đoạn này vào vector pTRE-Tight-BI. Phương pháp nghiên cứu sẽ sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo ra vector TET-ON hoàn chỉnh. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền mà còn có thể ứng dụng trong việc kiểm soát quần thể muỗi.

3.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, cắt nối DNA và chuyển gene. Các bước này sẽ được thực hiện để tạo ra vector TET-ON có khả năng điều khiển giới tính. Việc áp dụng các phương pháp này sẽ giúp xác định hiệu quả của vector trong việc điều khiển giới tính của muỗi, từ đó mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học.

IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tạo ra vector TET-ON thành công, cho phép điều khiển giới tính của muỗi Aedes aegypti. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng vector này có thể làm giảm số lượng muỗi cái trong quần thể, từ đó giảm thiểu nguy cơ lây lan bệnh. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

4.1. Thảo luận về kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng vector TET-ON có thể là một giải pháp hiệu quả trong việc kiểm soát quần thể muỗi. Việc điều khiển giới tính không chỉ giúp giảm số lượng muỗi cái mà còn có thể ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Luận văn đã đạt được mục tiêu đề ra, tạo ra vector TET-ON có khả năng điều khiển giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh. Cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện công nghệ này và ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn.

5.1. Kiến nghị

Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về hiệu quả lâu dài của vector TET-ON trong tự nhiên. Đồng thời, cần nghiên cứu các biện pháp kết hợp với các phương pháp kiểm soát muỗi khác để đạt hiệu quả tối ưu trong việc giảm thiểu dịch bệnh do muỗi truyền nhiễm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 2,5 đến 3 tỷ người trên toàn cầu nằm trong vùng có nguy cơ mắc các bệnh truyền nhiễm do muỗi truyền như sốt rét, sốt vàng da và sốt xuất huyết Dengue. Trong đó, muỗi vằn Aedes aegypti là trung gian truyền bệnh nguy hiểm, gây nhiễm cho 50 đến 100 triệu người mỗi năm, khiến khoảng 500.000 trường hợp phải nhập viện điều trị với 90% nạn nhân là trẻ em dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong ước tính khoảng 5%. Dịch bệnh lây lan trên 100 quốc gia thuộc khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tại Việt Nam, sốt xuất huyết Dengue là bệnh dịch lưu hành từ những năm 1960 với xu hướng ngày một mở rộng về quy mô và số ca mắc, gây quá tải hệ thống y tế trong các mùa cao điểm. Do chưa có vắc xin phổ biến rộng rãi và thuốc điều trị đặc hiệu (tại thời điểm nghiên cứu năm 2016 đối với Dengue và virus Zika), công tác kiểm soát bệnh dịch phụ thuộc chủ yếu vào các biện pháp hạn chế sự phát triển của quần thể muỗi trung gian.

Các phương pháp can thiệp sinh học truyền thống hoặc kỹ thuật chiếu tia X, tia gamma chuyển vị nhiễm sắc thể đã bộc lộ những hạn chế về tính bền vững. Một số hướng nghiên cứu trên thế giới đã tạo muỗi chuyển gene vô hiệu hóa thụ thể khứu giác orco (tại Đại học Rockefeller, Mỹ) nhằm ngăn muỗi phát hiện mùi cơ thể người, song chưa giải quyết triệt để vấn đề tiêu diệt hoặc giảm thiểu số lượng cá thể trong quần thể tự nhiên. Việc can thiệp vào cơ chế di truyền giới tính bằng công nghệ RNA can thiệp (RNAi) phối hợp hệ thống biểu hiện có điều hòa Tet-On mở ra khả năng tạo dòng muỗi chuyển gene bất hoạt tinh trùng mang nhiễm sắc thể X, chỉ cho phép tinh trùng mang nhiễm sắc thể Y thụ tinh, từ đó sinh ra thế hệ con hoàn toàn là muỗi đực. Do chỉ muỗi cái mới đốt người và truyền bệnh, việc chuyển gene này sẽ dần triệt tiêu quần thể muỗi trong tự nhiên. Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Minh Thành (Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên, thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học) tập trung giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể sau:

• Mục tiêu lâu dài: Tạo được vector Tet-On có khả năng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti.
• Mục tiêu trước mắt:
  1. Nắm được mục đích, ý nghĩa của nghiên cứu điều khiển tính trạng ở côn trùng và làm chủ các kỹ thuật thực nghiệm tạo vector định hướng điều khiển giới tính.
  2. Tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti thông qua việc ghép nối cấu trúc kẹp tóc trên vector dòng hóa pJET1.2.
  3. Bước đầu gắn lõi cấu trúc Tra-2 RNAi vào vector biểu hiện cảm ứng pTRE-Tight-BI để làm vật liệu trung gian chuyển tiếp vào vector đích pTet-DualON.
• Đối tượng nghiên cứu: Các đoạn DNA tương đồng với gene Transformer-2 (Tra-2) của muỗi Aedes aegypti (gồm đoạn DNA 1 kích thước 390 bp và đoạn DNA 2 kích thước 240 bp).
• Phạm vi nghiên cứu: Thiết kế và kiểm tra các cấu trúc vector tái tổ hợp nhân dòng và biểu hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong thời gian từ tháng 11/2015 đến tháng 05/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng cơ sở phân tử của cơ chế làm câm lặng gene sau phiên mã (Posttranscriptional Gene Silencing - PTGS) thông qua công nghệ RNA can thiệp (RNA interference - RNAi) và hệ thống kiểm soát biểu hiện gen cảm ứng Tetracycline (Tet-On System):

• Cơ chế RNAi và chức năng gene Transformer-2 (Tra-2): Phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) khi vào tế bào sẽ bị enzyme Dicer nhận biết và cắt nhỏ thành các đoạn RNA can thiệp kích thước ngắn (siRNA, dài khoảng 21–25 nucleotide). Các siRNA liên kết với phức hệ đa protein RISC (RNA-induced silencing complex) chứa thành viên họ Argonaute, dẫn đường để cắt và phân hủy mRNA đích có trình tự bổ sung. Ở muỗi chi Culicinae, gene Tra-2 đóng vai trò điều hòa biệt hóa giới tính và kiểm soát sự sinh tinh ở con đực. Khi bất hoạt gene Tra-2 bằng cấu trúc kẹp tóc (hairpin dsRNA), các tinh trùng mang nhiễm sắc thể X bị gây chết chọn lọc, chỉ tinh trùng mang nhiễm sắc thể Y phát triển thành công, tạo ra thế hệ con hoàn toàn mang giới tính đực.
• Hệ thống vector biểu hiện Tet-On và plasmid trung gian:
  • Vector pTet-DualON: Plasmid chứa promoter $P_{\text{CMV IE}}$ (nucleotide 7–606), protein hoạt hóa điều hòa ngược Tet-On Advanced (nucleotide 634–1380), vị trí gắn ribosome nội tại IRES2 (nucleotide 1389–1973), gene chỉ thị huỳnh quang màu xanh ZsGreen1 (nucleotide 1979–2674, bước sóng hấp thụ cực đại 493 nm, phát xạ cực đại 505 nm) từ loài san hô Zoanthus sp., tín hiệu polyA SV40, điểm khởi đầu sao chép ColE1 và gene kháng kháng sinh Ampicillin ($Amp^r$). Khi có mặt Doxycycline (DOX) hoặc Tetracycline (Tet), chất cảm ứng gắn với rtTA làm biến đổi cấu hình không gian, cho phép rtTA liên kết với trình tự TRE để kích hoạt promoter phiên mã gene đích.
  • Vector pTRE-Tight-BI: Plasmid biểu hiện hai chiều chứa promoter $P_{\text{Tight}}$ đáp ứng Tet gồm 7 đoạn lặp 36 bp chứa trình tự operator Tet ($TetO$ 19 bp) nằm kẹp giữa hai promoter tối thiểu $P_{\text{minCMV-1}}$ và $P_{\text{minCMV-2}}$, hai vùng nhân dòng đa vị trí MCS I (335–405) và MCS II (2782–2726).
• Phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử:
  • Biến nạp sốc nhiệt: Đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42°C trong 60 giây, ủ phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 37°C trong 1 giờ (lắc 200 vòng/phút), nuôi cấy chọn lọc trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh ampicillin.
  • Tách chiết plasmid: Nhân nuôi sinh khối khuẩn lạc đơn trong 3 ml môi trường LB lỏng chứa ampicillin qua đêm (16 giờ), ly tâm thu tế bào và tinh sạch plasmid bằng bộ kit thương mại GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) hoặc phương pháp dung dịch kiềm (Solution I, Solution II, Solution III).
  • Cắt giới hạn và tinh sạch phân đoạn DNA: Sử dụng các enzyme cắt giới hạn HindIII, Acc65I, BamHI, NsiI, XhoI ủ ở 37°C qua đêm; bất hoạt enzyme ở 65°C hoặc 80°C trong 10–20 phút. Điện di kiểm tra trên gel agarose nồng độ 1,5% (chạy đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 70V, cường độ 400mA trong 40 phút), nhuộm Ethidium Bromide, soi chụp trên máy UVP. Cắt và thu nhận các băng DNA tương ứng bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • Nối ligase và kiểm tra PCR: Phản ứng nối phân đoạn chèn vào vector thực hiện nhờ enzyme T4 DNA Ligase (Thermo Scientific) ở nhiệt độ phòng hoặc 37°C qua đêm, bất hoạt ở 65°C trong 10 phút. Sản phẩm nối được kiểm tra lại bằng phản ứng PCR (DreamTaq Mix, luân nhiệt 30 chu kỳ: biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; biến tính 95°C trong 30 giây, gắn mồi 55°C trong 65 giây, kéo dài 72°C trong 45 giây; kéo dài kết thúc 72°C trong 15 phút).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả phân tích tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ gánh nặng bệnh tật do muỗi trung gian truyền bệnh trên phạm vi toàn cầu và tại Việt Nam. Khóa luận nêu rõ các số liệu dịch tễ, hạn chế của các phương pháp phòng chống hóa học và vật lý hiện hành, từ đó xác định mục tiêu tổng thể và mục tiêu trước mắt về việc thiết kế vector tái tổ hợp mang cấu trúc RNAi kẹp tóc định hướng kiểm soát tính trạng giới tính ở muỗi Aedes aegypti.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu liên quan gồm:

1. Đặc điểm và nguyên lý của muỗi chuyển gene mang gene chỉ thị huỳnh quang và gene gây chết có điều kiện phụ thuộc nồng độ kháng sinh tetracycline.
2. Cơ chế phân tử của hiện tượng can thiệp RNA, vai trò xúc tác của enzyme Dicer và phức hợp RISC trong quá trình phân cắt mRNA mục tiêu.
3. Cơ chế di truyền xác định giới tính qua trục gene transformer (tra), transformer-2 (tra-2) và doublesex (dsx) ở côn trùng hai cánh (Diptera); phân tích tính đặc thù của gene Tra-2 ở muỗi Aedes aegypti trong quá trình tạo tinh trùng.
4. Cấu tạo phân tử, bản đồ vector và nguyên lý đóng/mở phiên mã của hệ thống Tet-On thông qua các plasmid thương mại pTet-DualON và pTRE-Tight-BI.
5. Lịch sử nghiên cứu muỗi biến đổi gene trên thế giới (công trình chèn gene vào Anopheles stephensi năm 2000, muỗi kháng ký sinh trùng sốt rét năm 2002 tại Đại học Case Western Reserve, thử nghiệm thả muỗi biến đổi gene ở Malaysia) và tại Việt Nam (thử nghiệm thả muỗi mang vi khuẩn Wolbachia tại đảo Trí Nguyên, Nha Trang năm 2011).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Tác giả trình bày danh mục chi tiết hóa chất, chủng vi khuẩn chủ, môi trường sinh học, danh mục 18 thiết bị phân tích (máy PCR Eppendorf, bộ điện di Bio-Rad, máy chụp ảnh gel UVP, máy ly tâm lạnh Eppendorf 5424R...) và cấu tạo các đoạn gene ban đầu do Công ty TNHH Sinh hóa Phù Sa tổng hợp trên vector pJET1.2. Nội dung nghiên cứu được chia làm 3 bước tuần tự:

• Nội dung 1: Cắt, tinh sạch và ghép nối đoạn DNA 2 (240/284 bp) vào vector pJET1.2-1 đã loại bỏ đoạn rác để hình thành đoạn DNA cấu trúc kẹp tóc Tra-2 RNAi.
• Nội dung 2: Cắt thu nhận đoạn kẹp tóc Tra-2 RNAi bằng enzyme BamHI và HindIII, mở vòng vector biểu hiện pTRE-Tight-BI và nối đoạn chèn vào vector này.
• Nội dung 3: Tách dòng, mở vòng vector nhận pTet-DualON bằng NsiI và XhoI, cắt thu đoạn lõi từ pTRE-Tight-BI để chuẩn bị tạo vector Tet-On hoàn chỉnh.

Thành phần các phản ứng cắt enzyme giới hạn và phản ứng nối T4 DNA ligase được quy định chuẩn hóa theo bảng sau:

Tên phản ứng	Enzyme / Thành phần chính	Đệm (Buffer)	Thể tích DNA	Tổng thể tích phản ứng	Điều kiện ủ nhiệt
Cắt pJET1.2-1 tạo vector rỗng	HindIII (1 µl), Acc65I (1 µl)	10X Buffer R (4 µl)	20 µl DNA plasmid	40 µl	37°C qua đêm; 80°C trong 20 phút
Cắt pJET1.2-2 tách đoạn DNA 2	HindIII (1 µl), Acc65I (1 µl)	10X Buffer R (4 µl)	20 µl DNA plasmid	40 µl	37°C qua đêm; 80°C trong 20 phút
Nối cấu trúc kẹp tóc trên pJET1.2	T4 DNA Ligase (1 µl)	10X T4 Buffer (2 µl)	4 µl DNA 2 + 13 µl pJET1.2-1	20 µl	Nhiệt độ phòng 10 phút; 65°C 10 phút
Cắt thu đoạn kẹp tóc Tra-2 RNAi	BamHI (1 µl), HindIII (1 µl)	10X Buffer R (4 µl)	20 µl DNA cấu trúc	40 µl	37°C qua đêm; 80°C trong 20 phút
Mở vòng vector pTRE-Tight-BI	BamHI (1 µl), HindIII (1 µl)	10X Buffer R (4 µl)	20 µl DNA plasmid	40 µl	37°C qua đêm; 80°C trong 20 phút
Nối Tra-2 RNAi vào pTRE-Tight-BI	T4 DNA Ligase (2 µl)	10X T4 Buffer (2 µl)	4 µl pTRE + 12 µl đoạn chèn	20 µl	37°C qua đêm; 65°C trong 10 phút
Mở vòng vector pTet-DualON	NsiI (1 µl), XhoI (1 µl)	10X Buffer O (4 µl)	20 µl DNA plasmid	40 µl	37°C qua đêm; 65°C trong 20 phút
Nối hoàn thiện vector Tet-On	T4 DNA Ligase (2 µl)	10X T4 Buffer (2 µl)	4 µl lõi + 13 µl pTet rỗng	20 µl	37°C qua đêm; 65°C trong 10 phút

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này công bố chi tiết hình ảnh điện di và giải thích kết quả thu nhận từng cấu trúc phân tử:

• Tạo đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi: Thủy phân vector pJET1.2-2 cho 2 băng DNA: băng vector kích thước khoảng 3000 bp và băng đoạn chèn DNA 2 kích thước 284 bp. Thủy phân vector pJET1.2-1 cũng thu được băng vector mang đoạn DNA 1 kích thước 3000 bp và loại bỏ băng 284 bp. Kết quả giải trình tự đoạn DNA 1 đối chiếu với ngân hàng dữ liệu cho thấy trình tự tương đồng hoàn toàn với gene Tra-2 tự nhiên của muỗi Aedes aegypti. Nối hai phân đoạn trên vector pJET1.2-1 tạo cấu trúc kẹp tóc hoàn chỉnh; sau khi cắt kiểm tra bằng BamHI và HindIII, kết quả điện di xác nhận xuất hiện 2 băng rõ rệt gồm băng vector 2370 bp và băng cấu trúc Tra-2 RNAi kích thước 630 bp.
• Chuyển đoạn Tra-2 RNAi vào vector pTRE-Tight-BI: Vector pTRE-Tight-BI sau khi cắt bằng BamHI và HindIII cho băng mở vòng đơn kích thước 2800 bp (loại bỏ đoạn trình tự ngắn 44 bp giữa 2 vị trí cắt). Sản phẩm nối giữa vector pTRE-Tight-BI rỗng và đoạn kẹp tóc 630 bp được kiểm tra bằng điện di cắt kép cho ra 2 băng sáng rõ: băng vector 2800 bp và băng đoạn chèn 630 bp, chứng minh đoạn kẹp tóc đã chèn thành công vào plasmid cảm ứng.
• Tạo rỗng vector pTet-DualON: Cắt pTet-DualON bằng NsiI và XhoI thu được 1 băng đơn sắc nét kích thước khoảng 4906 bp. Kích thước plasmid không đổi sau khi cắt do hai điểm nhận biết của NsiI và XhoI nằm sát nhau tại cùng một vị trí trên vector, tạo đầu dính tương thích sẵn sàng tiếp nhận đoạn cassette biểu hiện 3442 bp tách từ plasmid pTRE-Tight-BI tái tổ hợp.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các sản phẩm sinh học phân tử đã chế tạo thành công trong thời gian thực hiện khóa luận và nêu đề xuất cho các bước thử nghiệm chức năng tiếp theo trên tế bào và ấu trùng muỗi.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã hoàn thành toàn bộ các mốc thực nghiệm trong phòng thí nghiệm phục vụ quy trình tạo cấu trúc điều khiển giới tính ở muỗi, đạt được các chỉ số kích thước phân tử cụ thể:

Cấu trúc phân tử / Sản phẩm trung gian	Enzyme xử lý	Kích thước phân đoạn ghi nhận trên gel điện di (bp)
Đoạn DNA 2 (tách từ pJET1.2-2)	HindIII, Acc65I	284 bp (băng vector bỏ đi: 3000 bp)
Vector mang đoạn DNA 1 (từ pJET1.2-1)	HindIII, Acc65I	3000 bp (băng đoạn ngắn loại bỏ: 284 bp)
Đoạn kẹp tóc Tra-2 RNAi tái tổ hợp	BamHI, HindIII	630 bp (băng khung vector pJET: 2370 bp)
Vector pTRE-Tight-BI mở vòng	BamHI, HindIII	2800 bp (đoạn ngắn bị cắt bỏ: 44 bp)
Plasmid pTRE-Tight-BI mang Tra-2 RNAi	BamHI, HindIII	2 băng: 2800 bp (vector) và 630 bp (đoạn kẹp tóc)
Vector đích pTet-DualON mở vòng	NsiI, XhoI	4906 bp
Đoạn lõi mang cassette kẹp tóc chuẩn bị nối đích	NsiI, XhoI	3442 bp

Các đóng góp khoa học và thực tiễn của công trình bao gồm:

• Xác nhận tính chính xác về trình tự nucleotide của phân đoạn gene Tra-2 can thiệp, không xảy ra đột biến sai lệch so với trình tự chuẩn của Aedes aegypti.
• Tạo thành công cấu trúc DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi kích thước 630 bp trên plasmid dòng hóa pJET1.2 và tích hợp chính xác vào vector pTRE-Tight-BI tạo plasmid trung gian kích thước 3442 bp.
• Thiết lập và chuẩn hóa điều kiện phản ứng cắt hạn chế kép và phản ứng nối T4 DNA ligase cho hệ thống vector cảm ứng Tet-On, tạo tiền đề để lắp ráp vector biểu hiện hoàn chỉnh phục vụ nghiên cứu chuyển gene vào muỗi tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Trong khuôn khổ thời gian của khóa luận tốt nghiệp đại học, nghiên cứu dừng lại ở mức độ dòng hóa, cắt tạo rỗng vector pTet-DualON (4906 bp) và chuẩn bị đoạn cassette biểu hiện (3442 bp); công trình chưa tiến hành biến nạp sản phẩm nối cuối cùng vào cơ thể muỗi sống cũng như chưa đánh giá mức độ ức chế phiên mã và tỷ lệ đực hóa trên quần thể muỗi thực nghiệm.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiến hành nối đoạn lõi cassette từ pTRE-Tight-BI vào pTet-DualON, biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α và giải trình tự toàn bộ vector hoàn chỉnh để kiểm tra tính toàn vẹn của khung đọc.
  • Chuyển vector tái tổ hợp vào phôi muỗi Aedes aegypti bằng phương pháp vi tiêm (microinjection).
  • Đánh giá sự kích hoạt biểu hiện của protein huỳnh quang ZsGreen1 và mức độ bất hoạt gene Tra-2 khi bổ sung kháng sinh Doxycycline/Tetracycline ở các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi ấu trùng muỗi.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền học, Côn trùng học y học và Bảo vệ thực vật. Các nội dung thực nghiệm có giá trị ứng dụng cao gồm:

• Phương pháp tính toán và xử lý ghép nối các cấu trúc DNA kẹp tóc (hairpin RNAi) từ các phân đoạn DNA ngược chiều nhằm kích hoạt hiện tượng câm lặng gene.
• Quy trình thao tác chi tiết (thành phần phản ứng, nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ đệm) khi sử dụng đồng thời các enzyme cắt giới hạn hai đầu dính (HindIII, Acc65I, BamHI, NsiI, XhoI) để mở vòng và tinh sạch các plasmid kích thước lớn.
• Quy trình kỹ thuật sử dụng hệ thống vector biểu hiện hai chiều cảm ứng Tetracycline (pTRE-Tight-BI và pTet-DualON) trong điều hòa hoạt động phiên mã có kiểm soát.

Câu hỏi thường gặp

1. Kích thước đoạn DNA 1, đoạn DNA 2 và đoạn kẹp tóc Tra-2 RNAi hoàn chỉnh là bao nhiêu base pair (bp)?
Đoạn DNA 1 ban đầu trên vector pJET1.2-1 có kích thước 390 bp; đoạn DNA 2 trên vector pJET1.2-2 có kích thước khoảng 240–284 bp. Sau khi thực hiện phản ứng nối T4 ligase ghép nối hai đoạn này, đoạn DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi hoàn chỉnh được cắt tách bằng hai enzyme BamHI và HindIII ghi nhận kích thước 630 bp.

2. Enzyme cắt giới hạn nào được sử dụng để mở vòng vector biểu hiện hai chiều pTRE-Tight-BI?
Tác giả sử dụng cặp enzyme cắt giới hạn BamHI và HindIII ủ ở 37°C qua đêm để cắt mở vòng vector pTRE-Tight-BI. Phản ứng loại bỏ đoạn oligonucleotide kích thước 44 bp và tạo ra đoạn vector mở vòng có kích thước 2800 bp mang các đầu dính tương thích với đoạn chèn kẹp tóc Tra-2 RNAi.

3. Vì sao kích thước vector pTet-DualON không đổi (khoảng 4906 bp) sau khi cắt bằng cặp enzyme NsiI và XhoI?
Theo kết quả phân tích điện di và thiết kế plasmid, hai điểm cắt của enzyme NsiI và XhoI được bố trí tại cùng một vị trí nhận biết liền kề nhau trên vector pTet-DualON. Quá trình cắt kép chỉ có mục đích mở vòng plasmid để tạo các đầu dính nhận phân đoạn chèn, không làm mất đi đoạn DNA có kích thước đáng kể, do đó độ di chuyển điện di của vector duy trì ở mức tương đương 4906 bp.

4. Doxycycline (DOX) đóng vai trò gì trong cơ chế hoạt động của vector pTet-DualON?
Doxycycline đóng vai trò là chất cảm ứng (effector). Khi có mặt DOX, chất này sẽ gắn vào protein điều hòa Tet-On Advanced (rtTA), gây biến đổi cấu hình không gian để rtTA có thể liên kết vào trình tự đáp ứng tetracycline (TRE), qua đó kích hoạt promoter $P_{\text{miniCMV}}$ khởi động quá trình phiên mã gene đích. Ngược lại, khi không có DOX, rtTA không gắn được vào TRE, promoter bị bất hoạt và gene đích không được phiên mã.

5. Mục đích của việc tích hợp gene chỉ thị ZsGreen1 trong vector pTet-DualON là gì?
ZsGreen1 mã hóa protein huỳnh quang màu xanh có nguồn gốc từ san hô Zoanthus sp. (bước sóng kích thích 493 nm, phát xạ 505 nm). Nhờ vị trí dịch mã độc lập IRES2, ZsGreen1 được đồng biểu hiện cùng protein Tet-On Advanced từ một phân tử mRNA bicistronic, cho phép người nghiên cứu quan sát tế bào chuyển gene dưới kính hiển vi huỳnh quang hoặc phân loại định lượng bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào (flow cytometry) để xác định hiệu quả chuyển nhiễm.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Minh Thành đã hoàn thành việc thiết kế và tạo dòng thành công cấu trúc DNA kẹp tóc Tra-2 RNAi kích thước 630 bp từ các đoạn gene nhân tạo của muỗi Aedes aegypti. Nghiên cứu đã chèn thành công đoạn kẹp tóc này vào vector cảm ứng hai chiều pTRE-Tight-BI, đồng thời chuẩn bị sẵn sàng vector mở vòng pTet-DualON (4906 bp) cùng đoạn lõi biểu hiện (3442 bp). Kết quả thực nghiệm cung cấp hệ thống vật liệu di truyền chuẩn xác, tạo cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu chuyển gen điều khiển tỷ lệ giới tính nhằm kiểm soát quần thể muỗi truyền bệnh trong thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue). Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lây lan trên 100 nước khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới. Châu Mỹ cao nhất là 42 nước, châu Phi 20 nước, khu vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đông Nam Á 7 nước và Địa Trung Hải 4 nước [1].

Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành. Từ những năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển với số mắc bệnh và chết ngày một tăng. Bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch [4], [5]. Dịch bệnh không có chu kì rõ rệt, giữa các đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch vẫn xảy ra rải rác.

Để giải quyết vấn đề trên nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi biến đổi gene sẽ được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tạo ra thế hệ muỗi con bị khuyếm khuyết và chết trước khi trưởng thành. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu đã biến đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không có khả năng tìm kiếm mục tiêu để hút máu.

Nhóm nghiên cứu cho rằng muỗi có cơ quan thụ cảm khứu giác gọi là orco, được xem là bộ phận cần thiết để phối hợp với n 2 protein đặc biệt liên quan đến việc hình thành cơ chế ngửi mùi. Khi orco bị biến đổi cơ quan thụ cảm mất cân bằng khiến chúng không phân biệt được mùi người với động vật có máu nóng khác, đáng lưu ý là hai loại muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết ở người là Anopheles gambiae và Aedes aegypti rất thích mùi của con người, kết quả biến đổi orco khiến muỗi bị mất cân bằng nghiêm trọng trong việc phân biệt mùi người và mùi khác. Đáng lưu ý là muỗi đã bị biến đổi orco càng không phân biệt được mùi trong môi trường không có khí carbonic (CO2) [16] [22]. Trong nghiên cứu này nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller mới chỉ dừng lại ở vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không tìm kiếm người để hút máu chứ chưa làm giảm hoặc tiêu diệt toàn bộ quần thể muỗi Aedes aegypti.

Hiện nay có một số nghiên cứu về vector điều khiển tính trạng giới tính trong đó có vector Tet – On được các nhà khoa học sử dụng để điều khiển tính trạng giới tính của quần thể sinh vật ví dụ như ruồi giấm [10] [15]. Đến nay, vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và vắc xin phòng bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue cũng như bệnh do virus Zika, nên việc phòng chống bệnh chủ yếu dựa vào việc phòng và diệt muỗi truyền bệnh. Vai trò và khả năng truyền bệnh của một số loài muỗi thuộc giống Aedes mà chủ yếu là Aedes aegypti đã được biết từ lâu, song mỗi vùng, mỗi địa phương với những phong tục tập quán và hoạt động của người dân, nhất là điều kiện sống khác nhau ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng truyền bệnh [3].