Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue). Trong 50 – 100 triệu người mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lây lan trên 100 nước khu vực có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới. Châu Mỹ cao nhất là 42 nước, châu Phi 20 nước, khu vực Tây Thái Bình Dương 29 nước, Đông Nam Á 7 nước và Địa Trung Hải 4 nước [1].
Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành. Từ những năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển với số mắc bệnh và chết ngày một tăng. Bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch [4], [5]. Dịch bệnh không có chu kì rõ rệt, giữa các đợt dịch lớn hàng năm bệnh dịch vẫn xảy ra rải rác.
Để giải quyết vấn đề trên nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi biến đổi gene sẽ được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tạo ra thế hệ muỗi con bị khuyếm khuyết và chết trước khi trưởng thành. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu đã biến đổi gene muỗi, vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không có khả năng tìm kiếm mục tiêu để hút máu.
Nhóm nghiên cứu cho rằng muỗi có cơ quan thụ cảm khứu giác gọi là orco, được xem là bộ phận cần thiết để phối hợp với n 2 protein đặc biệt liên quan đến việc hình thành cơ chế ngửi mùi. Khi orco bị biến đổi cơ quan thụ cảm mất cân bằng khiến chúng không phân biệt được mùi người với động vật có máu nóng khác, đáng lưu ý là hai loại muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết ở người là Anopheles gambiae và Aedes aegypti rất thích mùi của con người, kết quả biến đổi orco khiến muỗi bị mất cân bằng nghiêm trọng trong việc phân biệt mùi người và mùi khác. Đáng lưu ý là muỗi đã bị biến đổi orco càng không phân biệt được mùi trong môi trường không có khí carbonic (CO2) [16] [22]. Trong nghiên cứu này nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller mới chỉ dừng lại ở vô hiệu hóa sự nhạy bén khứu giác của chúng đối với người, khiến chúng không tìm kiếm người để hút máu chứ chưa làm giảm hoặc tiêu diệt toàn bộ quần thể muỗi Aedes aegypti.
Hiện nay có một số nghiên cứu về vector điều khiển tính trạng giới tính trong đó có vector Tet – On được các nhà khoa học sử dụng để điều khiển tính trạng giới tính của quần thể sinh vật ví dụ như ruồi giấm [10] [15]. Đến nay, vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và vắc xin phòng bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue cũng như bệnh do virus Zika, nên việc phòng chống bệnh chủ yếu dựa vào việc phòng và diệt muỗi truyền bệnh. Vai trò và khả năng truyền bệnh của một số loài muỗi thuộc giống Aedes mà chủ yếu là Aedes aegypti đã được biết từ lâu, song mỗi vùng, mỗi địa phương với những phong tục tập quán và hoạt động của người dân, nhất là điều kiện sống khác nhau ảnh hưởng không nhỏ đến khả năng truyền bệnh [3]. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhằm giảm sự truyền nhiễm của muỗi và sinh sản của chúng trên thế giới như các phương pháp sử dụng tia X tia gamma để dời một đoạn nhiễm sắc thể hay phương pháp đưa DNA ngoại lai vào côn trùng tạo côn trùng biến đổi gene [9].
Nhưng các biện pháp này chỉ giảm thiểu phần nào quần thể muỗi bằng cách tác động vào hệ gene của chúng. Cụ thể hơn là tác động vào hệ gene giới tính của nó. Một khi chúng ta n 3 điều khiển được hệ gene giới tính của muỗi, chúng ta có thể tạo ra được một quần thể mới toàn cá thể muỗi đực hoặc toàn cá thể muỗi cái. Từ đó chúng ta có thể ứng dụng trong việc tạo ra các dòng muỗi triệt sản hoặc mang các gene giới tính có khả năng ức chế, gây chết tế bào trứng của muỗi cái trong quần thể tự nhiên.
Xuất phát từ mục tiêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector TET – ON điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti”. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1. Mục tiêu của đề tài * Mục tiêu lâu dài của đề tài Tạo được vector TET – ON có khả năng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. * Mục tiêu trƣớc mắt Mục tiêu cần đạt trong khuôn khổ thời gian thực hiện khóa luận là nắm được mục đích, ý nghĩa của việc nghiên cứu điều khiển tính trạng ở côn trùng và thực hiện các thí nghiệm để nắm được các phương pháp để tạo vector định hướng điều khiển giới tính.
- Tạo đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti thông qua vector pJET1. - Bước đầu gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTRE-Tight-BI để chuẩn bị gắn vào vector đích Tet-On. Yêu cầu của đề tài Có thông tin về khả năng tạo được vector TET – ON có khả năng hoạt động định hướng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Ý nghĩa của đề tài 1.
Ý nghĩa khoa học Điều khiển chủ động tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti, tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sự biểu hiện tính trạng trên muỗi Aedes aegypti. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới giúp tiêu diệt hoặc làm giảm số lượng quần thể muỗi Aedes aegypti trong tự nhiên n 5 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Cơ sở khoa học 2.1 Muỗi biến đổi gene Thành công ban đầu từ những cuộc thử nghiệm trên muỗi biến đổi gene đã đặt ra kì vọng biến chúng thành phương pháp tiêu diệt hoặc làm giảm tác hại của loài muỗi gây bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất châu Á và châu Mỹ La Tinh hiện nay. Sự lạc quan dường như cũng thể hiện rõ ở nhiều nhà khoa học, nhưng sự thành công chưa trọn vẹn của phương án này cũng đặt ra không ít lo ngại.
Muỗi chuyển gene được bổ sung hai đặc điểm mới so với loại muỗi thường là chúng chứa gene phát huỳnh quang và gene gây chết có điều kiện (còn gọi là gene làm giảm sức đề kháng). Đặc điểm phát huỳnh quang hoạt động như một dấu hiệu để nhận diện muỗi biến đổi gene trong khi gene gây chết sẽ làm muỗi và các ấu trùng chết trong những điều kiện nhất định. Khi muỗi biến đổi gene đực giao phối với muỗi cái trong tự nhiên, gene gây chết sẽ được truyền lại cho thế hệ con cháu và các ấu trùng, kết quả là chúng sẽ chết trong điều kiện thiếu vắng kháng sinh tetracycline [9]. Sở dĩ “công nghệ” muỗi chuyển gene nhận được nhiều sự đồng tình là do việc sử dụng loại muỗi này - theo đánh giá của những người ủng hộ quan điểm muỗi chuyển gene - là an toàn và thân thiện hơn nhiều so với việc dùng hóa chất.
Các nhà khoa học thậm chí còn dự tính sẽ tạo ra hàng loạt các thế hệ côn trùng, ong, sâu, ruồi mang “thương hiệu” biến đổi gene, nhằm chống lại những căn bệnh có tính chất đại dịch vốn lây lan qua côn trùng, đồng thời tạo điều kiện cho việc tăng năng suất cây trồng và các sản phẩm nông nghiệp, giúp ổn định an ninh lương thực. Muỗi chuyển gene được kì vọng là phương án sẽ tạo nên bước đột phá trong ngành y học và nông nghiệp [20]. Thời gian n 6 gần đây có nhiều báo cáo cho rằng có thể tạo ra muỗi chuyển gene nhờ công nghệ tiên tiến mới, là công nghệ RNAi. Công nghệ RNAi 2.
Đặc điểm công nghệ RNAi Công nghệ RNAi có tính đặc thù cao, đầy sức mạnh và hiệu quả, chỉ cần một lượng nhỏ phân tử ARN sợi kép (dsRNA) trong một tế bào là đủ để gây bất hoạt gene. Rất nhạy cảm (phản ứng nhanh và mạnh đối với các RNA xâm nhiễm như virus), có thể làm bất hoạt gene ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cá thể ở mức độ nhất định có thể truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, từ mô này sang mô khác như kiểu “di căn” [2] [6]. Vai trò của công nghệ RNAi RNAi có khả năng hoạt động như một chất xúc tác (catalyst) và các enzyme có bản chất RNA được gọi là ribozyme. Quan điểm trước đó cho rằng RNAi chỉ đóng vai trò trung gian giữa DNA và protein.
Các nghiên cứu sau đó cho thấy RNA có thể tự xúc tác để tự sao chép và tổng hợp các phân tử RNA khác. Hiện nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng ribosomal RNA xúc tác tạo liên kết peptide giữa các amino acid trong quá trình dịch mã, phát hiện sau đó còn cho thấy RNA không chỉ như chất xúc tác, mà còn đóng vai trò quan trọng hơn nữa trong biểu hiện gene. Một số lượng lớn các phân tử RNA nhỏ không đóng vai trò như mã di truyền mà liên kết với protein để tạo ra phức hợp ribonucleoprotein (RNP). Trong những năm đầu của thập kỷ 1980, người ta đã phát hiện thấy các phân tử nhỏ (dài khoảng 100 nucleotide) trong vi khuẩn Escherichia coli có thể bám vào trình tự tương đồng trong n 7 mRNA và ức chế phiên mã.
Một loạt các nghiên cứu về RNAi được công bố và đã chỉ ra rằng ARNi có thể là chiến lược để chống lại virus [2]. Sự bất hoạt gene có thể xảy ra ở mức độ phiên mã và sau phiên mã. Kết quả nghiên cứu vào những năm 1990 cho thấy một gene biến nạp (gene chuyển) vào hệ gene có thể kìm hãm biểu hiện gene tương tự của nó trong cây [2]. Ứng dụng RNAi có giá trị cả trong nuôi cấy tế bào và trong các sinh vật sống, vì tổng hợp RNA mạch kép đưa vào tế bào chọn lọc, có thể gây ức chế gene cụ thể cần quan tâm.
RNAi có thể được sử dụng cho các mô hình có quy mô lớn có thể giúp xác định các thành phần cần thiết cho một quá trình tế bào cụ thể hoặc một sự kiện như phân chia tế bào.