MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thủy sản là ngành quan trọng của Việt Nam, đóng góp vào nền kinh tế khoảng 3 – 4 % tổng GDP hằng năm, đem lại công ăn việc làm cho hàng triệu lao động và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho tiêu dùng [1]. Tuy nhiên, ngành này đang bị đe dọa bởi tình trạng dịch bệnh ngày càng tăng, chủ yếu do các tác nhân là vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Vibrio. Vi khuẩn Vibrio gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng trên động vật thủy sản, chẳng hạn như chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh “hoại tử gan tụy cấp” (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) với tỷ lệ chết lên đến 100 % trên tôm hoặc chủng Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus là tác nhân gây nhiều bệnh nghiêm trọng trên nhuyễn thể, cá, cũng như nhiều loài động vật thủy hải sản khác [2, 3].
Theo nghiên cứu của Trần Thị Hồng Tơ và cộng sự [4], vi khuẩn V. parahaemolyticus được phát hiện trong 86,2 % sản phẩm thủy hải sản và 78,1 % mẫu nước nuôi thủy sản được thu thập khắp vùng sông Mê Kông – nơi tập trung phần lớn diện tích nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Có thể nói, nguy cơ bùng phát trên diện rộng dịch bệnh do Vibrio có thể xảy ra bất cứ lúc nào. Do đó, việc cần thiết có một biện pháp phòng chống Vibrio hữu hiệu nên được ưu tiên, nhằm phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững ở Việt Nam.
Trước đây, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng và điều trị các bệnh ở thủy sản, đặc biệt là bệnh gây ra bởi Vibrio spp. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh trong thời gian dài đã đem lại nhiều hệ lụy khó khắc phục, như: i) tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng và giảm giá trị xuất khẩu; ii) phát sinh các dòng vi khuẩn Vibrio spp. kháng kháng sinh; iii) gây ô nhiễm vùng nuôi do kháng sinh tiêu diệt các hệ vi sinh vật có lợi trong ao nuôi, dẫn đến thất bại triền miên trong nuôi trồng thủy sản [5, 6]. Trên thực tế, các dòng Vibrio kháng thuốc đã được phát hiện và ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều khu vực sản xuất ở Việt Nam, như Sóc Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh, gây tổn thất to lớn cho ngành công nghiệp nuôi tôm trong nước.
Nguyễn Diễm Thư và cộng sự [7] đã công bố tỷ lệ 12,37 % mẫu tôm, nước nuôi và bùn đáy ao thu ở khu vực sông Mê Kông 5 mang Vibrio có gen gây bệnh “hoại tử gan tụy”, trong đó 80,85 % và 78,72 % chủng kháng lại lần lượt 2 kháng sinh là Doxycycline và Enrofloxacin. Đây là con số đáng báo động, là hệ lụy từ việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong nuôi trồng thủy hải sản ở khu vực này trong thời gian dài. Cùng với xu hướng nuôi tôm “sạch”, kháng sinh đang dần bị hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, thay thế bằng việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong xử lý môi trường nước nuôi thủy sản, một trong những chế phẩm đang được quan tâm hiện nay đó là bacteriocin – peptide có phổ kháng khuẩn hẹp, do đó tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu một cách hiệu quả, ít ảnh hưởng đến các vi khuẩn có lợi khác và không gây độc cho động vật. Phương thức này đang gặt hái nhiều ưu điểm, tuy nhiên đa phần các chế phẩm tích hợp các vi sinh vật có nguồn gốc trên cạn.
Do đó, hoạt động vẫn chưa tối ưu trong môi trường đặc trưng nuôi tôm nước mặn. Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy nhiên số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được công bố thuộc chi Bacillus và nhóm xạ khuẩn (Actinobacteria).
subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K đã được nhóm tác giả thuộc Viện Công nghệ Sinh học công bố có hoạt tính đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn không có bản chất protein, mà là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha loãng trong nước nuôi hoặc trong pH kiềm tính của nước nuôi. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus amyloliquefaciens B4 từ mẫu nước và bùn đáy ao nuôi ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] đã thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố Vibrio trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) bị ức chế khi bổ sung vi khuẩn B. subtilis và xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào mẫu nước nuôi [11]. Có thể thấy hầu hết các công bố chỉ dừng lại ở việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các chủng vi sinh vật có khả năng kháng Vibrio nhằm kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp.
gây ra hoặc tìm kiếm các hợp chất có khả năng 6 kháng Vibrio phân lập từ nguồn vi sinh vật trên cạn và ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản. Do đó, các chế phẩm có hiệu quả diệt khuẩn không cao, chưa được tối ưu trong môi trường nuôi nước mặn. Vì vậy “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin” là cách tiếp cận hiệu quả, có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn nhằm đánh giá tiềm năng và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính từ vi sinh vật (VSV) biển trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Sàng lọc và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn biển (VKB) có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng với VSV gây bệnh trên các đối tượng thủy hải sản (chủ yếu đối kháng với Vibrio).
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Phạm vi nghiên cứu: khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh trên thủy, hải sản của các chủng vi khuẩn biển thu được. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ VSV biển nhằm ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản là cách tiếp cận mới, có ý nghĩa khoa học. Thành công của đề tài sẽ định hướng khả năng sử dụng VSV biển trong nghiên cứu thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học, góp phần giảm thiểu lượng thuốc kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản, nâng cao chất lượng sản phẩm.
Chế phẩm sinh học có lợi thế thân thiện môi trường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và góp phần phát triển bền vững. CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH Thu nhận mẫu sinh vật biển (tôm, cá, rong biển, bọt biển …) và phân lập vi khuẩn biển. 7 Khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển phân lập được. Xác định phổ kháng khuẩn và bản chất của hợp chất kháng khuẩn.
Tuyển chọn và định danh bằng gene 16s rRNA của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Nghiên cứu độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn và khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của ít nhất 01 chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN 1.
Đặc điểm vi khuẩn Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân hoàn chỉnh, vi khuẩn có các đặc điểm đặc trưng: kích thước nhỏ bé, hấp thụ nhiều và chuyển hóa nhanh, sinh trưởng nhanh và phát triển mạnh, thích ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị, nhiều chủng loại và phân bố rộng [12]. Vi khuẩn có kích thước rất nhỏ, thay đổi tùy từng loài, đường kính từ 0,2 – 2,0 µm, chiều dài từ 2 – 10 µm, một số vi khuẩn có kích thước dài đến vài chục micromet. Vi khuẩn có hình thái riêng, đặc tính sinh vật riêng, chúng có khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật, một số có khả năng tiết chất kháng khuẩn. Phương thức dinh dưỡng đa dạng, đa số vi khuẩn sống hoại sinh trong tự nhiên [13].
Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định. Các hình dạng và kích thước này là do vách tế bào của vi khuẩn quyết định. Hình thái là một tiêu chuẩn rất quan trọng để xác định vi khuẩn [12]. Về hình thái, có thể chia vi khuẩn thành 3 nhóm lớn sau: i) Cầu khuẩn (Cocci): Là những vi khuẩn có hình cầu, mặt cắt của chúng có thể là những hình tròn, nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến.
Đường kính trung bình khoảng 0,5 – 1 µm. Cầu khuẩn lại được chia làm nhiều loại như: đơn cầu khuẩn (Micrococcus), song cầu khuẩn (Diplococcus), tứ cầu khuẩn (Tetracoccus), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), liên cầu khuẩn (Streptococcus). ii) Trực khuẩn (Bacilli): Là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay vuông, kích thước vi khuẩn gây bệnh thường gặp là 0,5 – 1 x 2 – 5 µm. Các trực khuẩn không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn [12].
Một số loại trực khuẩn thường gặp bao gồm: Trực khuẩn Gram dương, sống hiếu khí sinh nha bào: Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, v.; Trực khuẩn Gram âm, sống hiếu khí, không sinh nha bào, thường có tiên mao ở xung quanh thân vi khuẩn: Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus, v. iii) Xoắn khuẩn (Spirillum, Spirochete): Là những vi khuẩn có hình sợi lượn sóng và di động. Chiều dài của các vi khuẩn loại này có thể tới 30 µm. Trong loại này có 3 giống vi khuẩn gây bệnh quan trọng là Treponema, Leptospira và Borrelia [12].
9 Ngoài những vi khuẩn có hình dạng điển hình như trên còn có những loại vi khuẩn có hình thái trung gian: Trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn là cầu – trực khuẩn, như vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis); Trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn mà điển hình là phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) [12]. Việc nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn được thực hiện thông qua sự hỗ trợ của các thiết bị chuyên dụng như kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử. Mỗi loại vi khuẩn đều có cấu trúc tế bào và hình dạng khác nhau. Do đó để nhận diện được vi khuẩn phải thực hiện qua nhiều phương pháp, kỹ thuật.
Một trong số đó là phương pháp nhuộm Gram [14].