Đặt vấn đề Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây thực phẩm dễ trồng và có hiệu quả kinh tế cao. Hạt đậu tương giàu dinh dưỡng, hàm lượng protein trong hạt đạt từ 30%-52%, hàm lượng lipid từ 12%-25%, có nhiều loại vitamin, khoáng và đặc biệt trong hạt chứa nhiều amino acid thiết yếu cho người và động vật. Hạt đậu tương vừa là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị, vừa là nguồn thức ăn cho người và vật nuôi. Cây đậu tương không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng mà còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác do rễ đậu tương có khả năng cố định đạm.
Chính vì vậy đậu tương được nhiều quốc gia trên thế giới và Việt Nam ưu tiến phát triển. Trong những năm gần đây do biến đổi khí hậu mà hạn hán đã xảy ra ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ở một số vùng ở nước ta như các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên, hạn đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm suy giảm rõ rệt khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng, trong đó có đậu tương. Đậu tương được xem là loại cây trồng rất mẫn cảm với tác động của hạn và hạn là yếu tố phi sinh học nghiêm trọng nhất có thể làm giảm năng suất đậu tương tới 40%.
Câu hỏi đặt ra là, có thể cải thiện được khả năng chịu hạn của cây đậu tương hay không? Và nếu có thì ứng dụng công nghệ nào để tăng cường khả năng kháng hạn của loài cây họ đậu này? Cho đến nay các nghiên cứu đã khẳng định rằng, có thể nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng kỹ thuật chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện đại. Một số phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề này được quan tâm là ứng dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể hoặc lai hữu tính tạo tổ hợp lai đậu tương có khả năng chịu hạn cao và ứng dụng công nghệ gen trong tạo 1 c cây đậu tương chuyển gen có khả năng chịu đựng và chống lại các tác nhân phi sinh học ở ngoại cảnh, trong đó có hạn hán. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen và đến nay, người ta vẫn chưa xác định được một gen cụ thể quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ biết được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương. Các gen liên quan đến tính chịu hạn bao gồm hai nhóm, nhóm gen mà sản phẩm của chúng liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn và nhóm gen mã hóa sản phẩm có chức năng điều hòa các gen có sản phẩm trực tiếp tác động đến khả năng chịu hạn của đậu tương.
Để chống lại tác động bất lợi của hạn hán, cây đậu tương đã tổng hợp nhiều loại protein, trong đó có các loại protein là nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt động phiên mã của các gen chức năng. Protein DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một phân họ thuộc họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, có chức năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn, tạo ra tính chống chịu các stress hạn từ ngoại cảnh. Tăng cường hoạt động biểu hiện gen DREB sẽ kích hoạt mạnh sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn, do vậy việc lựa chọn kỹ thuật biểu hiện mạnh gen DREB sẽ là giải pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương mà khâu đầu tiên là tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen và những thông tin của gen chuyển được lựa chọn. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã chọn và thực hiện đề tài: “Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB6 từ cây đậu tương phục vụ thiết kế vector chuyển gen thực vật”.
Mục tiêu nghiên cứu Phân tích được đặc điểm trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 (cDNA) phân lập từ cây đậu tương. Nội dung nghiên cứu 3. Nghiên cứu thông tin về trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB6 từ cây đậu tương, thiết kế cặp mồi PCR và khuếch đại gen GmDREB6. Tách dòng phân tử và xác định trình tự gen GmDREB6 3.
Phân tích đặc điểm của trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ cây đậu tương. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Về mặt khoa học, kết quả nghiên cứu góp phân làm rõ đặc điểm về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ cây đậu tương. Bổ sung dẫn liệu về gen GmDREB6 của giống đậu tương DT2008 trong phân họ gen DREB của câu đậu tương. Về mặt thực tiễn, trình tự cDNA của gen GmDREB6 làm nguyên liệu cho thiết kế vector chuyển gen phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cây đậu tương 1. Cây đậu tương Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, thuộc chi Glycine, họ Đậu (Fabaceae), có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 40. Đậu tương là loại cây trồng thu hạt, loại cây bụi nhỏ có lông toàn thân, cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt.
Cây đậu tương có bộ rễ phát triển là loại rễ cọc gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30 – 50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, tập trung nhiều ở tầng đất 7 – 8cm rộng 30 – 40cm2. Trên rễ của đậu tương có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm, một nốt sần có khoảng 3 – 4 tỷ vi sinh vật mà ta chỉ có thể nhìn thấy chúng qua kính hiển vi phóng đại 600 – 1000 lần [1].
Đậu tương là cây hai lá mầm thân thảo, ít phân cành, dạng bụi. Cây cao khoảng 0,3 – 1,0m, thân cây mảnh, tròn, thường dài từ 14 – 15 lóng, có nhiều lông tơ có tác dụng giảm thoát hơi nước và chống bệnh. Người ta thường phân biệt các giống đậu tương với nhau dựa vào thân cây đậu tương có mật độ lông ở thân nhiều hay ít, dài hay ngắn. Thân non có thể có màu xanh hoặc màu tím, màu sắc thân non có tương quan chặt chẽ tới màu sắc của hoa, thân xanh hoa trắng, thân tím hoa tím.
Thân có nhiều dạng như đứng, bò, nửa bò và leo. Đường kính thân thay đổi tùy theo giống và có liên quan tới tính chống đổ của cây. Số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào giống và các kỹ thuật canh tác. Có giống chỉ có 1 – 2 cành hoặc thậm chí không có cành.
Cành hướng lên phía trên, lá mọc cách từ các đốt trên thân. Có 3 loại lá chính ở cây đậu tương chính là: lá mầm, lá nguyên và lá kép. Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Lá thường mọc so le, 4 c lá kép thường có 3 lá chét với hình dạng khác nhau tùy loài.
Những lá nhỏ và dài chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao nhưng khả năng chịu hạn thường kém [1], [2]. Hoa đậu tương nhỏ, không mùi, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của hoa thay đổi tùy theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân.
Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 – 10 hoa và thường có 3 – 5 hoa. Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên 80%. Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. Hoa đậu tương thường thụ phấn trước khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp, chiếm trung bình 0,5 – 1% [1], [2].
Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách cành, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi vì nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ, quả thõng, quả đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen. Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: tròn bầu dục, tròn dài, vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen nhưng chủ yếu là màu vàng rơm nhạt [2]. Đậu tương có nguồn gốc ở phía Bắc và Đông Châu Á, là một trong những cây thực phẩm quan trọng [1]. Cây đậu tương là cây trồng ngắn ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ, trồng trong suốt mùa hè và mùa thu.
trồng cây đậu tương rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp. Đối với ngành trồng trọt, đậu tương có khả năng tích luỹ đạm của không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt sần ở bộ rễ và sinh khối thân, cành lá. Các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hoá học và tăng độ phì nhiêu cho đất. Trong hệ thống 5 c thâm canh, trồng đậu tương có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống nạn ô nhiễm do lạm dụng phân bón hoá học và thuốc trừ sâu [2], [9].
Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật… [6]. Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra trong tế bào. Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết. Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng do đó ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của thực vật.