Luận văn thạc sĩ nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

• Tác giả: Đặng Thị Thu Phương
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Quang Huấn
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu, Sàng Lọc Và Thu Nhận Aptamer Đặc Hiệu Kháng Sinh Streptomycin Và Ứng Dụng Để Xác Định Dư Lượng Kháng Sinh Trong Sữa
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về streptomycin
• 1.1.1. Kháng sinh streptomycin
• 1.2. Kháng sinh trong chăn nuôi
• 1.2.1. Tác dụng của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
• 1.2.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia
• 1.3. Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh
• 1.4. Quy định về tồn dư kháng sinh streptomycin trong thực phẩm

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Aptamer Streptomycin Ứng Dụng Trong Sữa

Bài viết này tập trung vào nghiên cứu aptamer streptomycin và ứng dụng của nó trong việc xác định dư lượng streptomycin trong sữa. Streptomycin là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để phòng và điều trị bệnh cho gia súc. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh streptomycin có thể dẫn đến tồn dư trong sữa, gây nguy cơ cho sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, việc phát triển các phương pháp phát hiện streptomycin nhanh chóng và hiệu quả là vô cùng quan trọng. Aptamer nổi lên như một giải pháp tiềm năng, thay thế cho kháng thể trong các xét nghiệm phát hiện.

1.1. Aptamer Là Gì Tổng Quan Về Công Nghệ Aptamer

Aptamer là các đoạn oligonucleotide (DNA hoặc RNA) hoặc peptide có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử đích, tương tự như kháng thể. Điểm khác biệt là aptamer có kích thước nhỏ hơn, dễ tổng hợp và biến đổi, ổn định hơn và ít gây ra phản ứng miễn dịch hơn so với kháng thể. Công nghệ aptamer đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm y sinh, môi trường và đặc biệt là trong phân tích thực phẩm.

1.2. Vì Sao Cần Xác Định Dư Lượng Kháng Sinh Streptomycin

Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, đặc biệt là streptomycin, có thể dẫn đến tình trạng dư lượng kháng sinh trong sữa. Điều này gây ra nhiều nguy cơ tiềm ẩn cho sức khỏe người tiêu dùng, bao gồm dị ứng, rối loạn tiêu hóa và đặc biệt là sự phát triển của tình trạng kháng kháng sinh. Nguy cơ kháng kháng sinh là một vấn đề toàn cầu, đe dọa hiệu quả của các loại thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn. Do đó, việc kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là sữa, là vô cùng quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn Đề Dư Lượng Kháng Sinh Streptomycin Trong Sữa

Việc sử dụng streptomycin trong chăn nuôi nhằm tăng hiệu quả và phòng bệnh cho gia súc, nhưng lại tạo ra vấn đề dư lượng kháng sinh trong sữa. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ cho sức khỏe người tiêu dùng. Các phương pháp truyền thống để xác định dư lượng streptomycin trong sữa thường đòi hỏi thiết bị đắt tiền và kỹ thuật phức tạp, gây khó khăn cho việc kiểm soát chất lượng ở quy mô nhỏ và địa phương.

2.1. Tác Hại Của Dư Lượng Kháng Sinh Streptomycin Với Sức Khỏe

Độc tính streptomycin và dư lượng kháng sinh trong sữa có thể gây ra các phản ứng dị ứng ở người nhạy cảm. Nghiêm trọng hơn, nó góp phần làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh, một mối đe dọa lớn đối với y tế cộng đồng. Các yếu tố kháng thuốc có thể truyền sang người, làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh. Trong ngành công nghiệp sữa, dư lượng kháng sinh có thể ức chế các vi khuẩn có lợi trong quá trình lên men, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.

2.2. Các Phương Pháp Xác Định Dư Lượng Streptomycin Hiện Nay

Hiện nay, có nhiều phương pháp để xác định dư lượng kháng sinh. Các phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS, LC-MS) có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi chi phí đầu tư lớn và kỹ năng chuyên môn. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) được sử dụng rộng rãi để sàng lọc, nhưng vẫn còn những hạn chế về độ nhạy và độ đặc hiệu. Do đó, cần có những phương pháp phát hiện nhanh và hiệu quả hơn, đặc biệt là cho các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ.

2.3. Quy Định Về Dư Lượng Kháng Sinh Trong Sữa

Các quốc gia và tổ chức quốc tế đã ban hành các quy định về dư lượng kháng sinh trong thực phẩm để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Các tiêu chuẩn về dư lượng kháng sinh trong sữa được thiết lập dựa trên các nghiên cứu về độc tính streptomycin và nguy cơ kháng kháng sinh. Việc tuân thủ các quy định này là bắt buộc đối với các nhà sản xuất và chế biến sữa để đảm bảo an toàn thực phẩm.

III. Giải Pháp Aptamer Phát Hiện Nhanh Streptomycin Trong Sữa

Nghiên cứu và ứng dụng aptamer mở ra một hướng đi mới trong việc phân tích dư lượng kháng sinh streptomycin trong sữa. Aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với streptomycin, cho phép phát triển các phương pháp phát hiện nhanh, độ nhạy cao và chi phí thấp. Ứng dụng aptamer hứa hẹn sẽ cải thiện hiệu quả kiểm soát an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

3.1. Ưu Điểm Của Aptamer So Với Các Phương Pháp Truyền Thống

Ưu điểm của aptamer so với kháng thể và các phương pháp truyền thống là rất lớn. Aptamer dễ dàng tổng hợp và biến đổi, có độ ổn định cao, ít gây phản ứng miễn dịch và có chi phí sản xuất thấp hơn. Điều này giúp cho việc phát triển các bộ kit kiểm tra streptomycin dựa trên aptamer trở nên khả thi và kinh tế hơn.

3.2. Quy Trình Sàng Lọc Và Thu Nhận Aptamer Đặc Hiệu

Quy trình sàng lọc aptamer thường bắt đầu bằng việc tạo ra một thư viện DNA hoặc RNA có độ đa dạng cao. Sau đó, thư viện này được sàng lọc bằng kỹ thuật SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) để chọn ra các aptamer có khả năng liên kết mạnh và đặc hiệu với streptomycin. Các aptamer được chọn sẽ được nhân dòng, giải trình tự và đánh giá khả năng ứng dụng.

3.3. Ứng Dụng Aptamer Trong Phát Triển Biosensor

Aptamer-based biosensor là một thiết bị phân tích sử dụng aptamer làm phần tử nhận diện sinh học để phát hiện và định lượng các chất. Trong trường hợp streptomycin, aptamer sẽ liên kết với kháng sinh, tạo ra một tín hiệu có thể đo được bằng các phương pháp điện hóa, quang học hoặc cơ học. Ứng dụng aptamer trong y sinh và ứng dụng aptamer trong môi trường cũng đang được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ.

IV. Nghiên Cứu Ứng Dụng Aptamer Xác Định Streptomycin Trong Sữa

Nghiên cứu về ứng dụng aptamer trong xác định dư lượng streptomycin trong sữa đã đạt được những kết quả đáng khích lệ. Các nhà khoa học đã thành công trong việc phát triển aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với streptomycin và xây dựng các quy trình phân tích streptomycin bằng aptamer có độ nhạy và độ chính xác cao. Điều này mở ra triển vọng lớn cho việc ứng dụng công nghệ aptamer trong kiểm soát an toàn thực phẩm.

4.1. Xây Dựng Quy Trình ELISA Sử Dụng Aptamer

Một trong những ứng dụng tiềm năng của aptamer là thay thế kháng thể trong phương pháp ELISA. Quy trình ELISA sử dụng aptamer có thể được thiết kế để phát hiện streptomycin một cách nhanh chóng và hiệu quả. Độ chính xác của phương pháp aptamer và độ tin cậy của phương pháp aptamer đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu.

4.2. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Phương Pháp Aptamer

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu quả của một phương pháp phân tích dư lượng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp aptamer có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương đương hoặc tốt hơn so với các phương pháp truyền thống.

4.3. Ứng Dụng Thực Tế Của Aptamer Trong Kiểm Nghiệm Sữa

Ứng dụng thực tế của aptamer trong kiểm nghiệm sữa bao gồm việc kiểm tra streptomycin trong sữa tại các trang trại, nhà máy chế biến và các cơ quan kiểm soát chất lượng. Phương pháp kiểm tra streptomycin dựa trên aptamer có thể được sử dụng để sàng lọc nhanh các mẫu sữa nghi ngờ, giúp phát hiện sớm các trường hợp vi phạm quy định về dư lượng kháng sinh.

V. Kết Luận Và Triển Vọng Của Nghiên Cứu Aptamer Streptomycin

Nghiên cứu về aptamer streptomycin và ứng dụng của nó trong xác định dư lượng trong sữa đã mang lại những kết quả đầy hứa hẹn. Công nghệ aptamer có tiềm năng to lớn trong việc cải thiện hiệu quả kiểm soát an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các aptamer có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, đồng thời tối ưu hóa các quy trình phân tích streptomycin bằng aptamer để ứng dụng rộng rãi trong thực tế.

5.1. Hướng Phát Triển Của Công Nghệ Aptamer Trong Tương Lai

Trong tương lai, công nghệ aptamer sẽ tiếp tục phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm y học, môi trường và phân tích thực phẩm. Các nghiên cứu sẽ tập trung vào việc cải thiện độ ổn định aptamer, giảm chi phí aptamer và phát triển các aptamer-based biosensor có khả năng phát hiện nhanh và chính xác nhiều loại chất khác nhau.

5.2. So Sánh Aptamer Với Kháng Thể Lựa Chọn Tối Ưu

So sánh aptamer và kháng thể cho thấy mỗi loại đều có những ưu và nhược điểm riêng. Ưu điểm của aptamer so với kháng thể là chi phí thấp, độ ổn định cao và dễ dàng biến đổi. Tuy nhiên, nhược điểm của aptamer so với kháng thể là ái lực liên kết có thể thấp hơn trong một số trường hợp. Việc lựa chọn aptamer hay kháng thể phụ thuộc vào yêu cầu cụ thể của từng ứng dụng.

5.3. Thị Trường Aptamer Và Tiềm Năng Phát Triển

Thị trường aptamer đang ngày càng phát triển, với nhiều công ty và tổ chức nghiên cứu tham gia vào việc nghiên cứu và phát triển aptamer. Tiềm năng phát triển của công nghệ aptamer là rất lớn, đặc biệt là trong lĩnh vực phân tích dư lượng kháng sinh trong nông sản và phân tích dư lượng kháng sinh trong thủy sản.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Kháng sinh đóng vai trò thiết yếu trong chăn nuôi, giúp tăng hiệu quả sinh trưởng và phòng ngừa bệnh tật. Streptomycin, một kháng sinh nhóm aminoglycoside, được sử dụng phổ biến trong thức ăn chăn nuôi để kiểm soát vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương. Tuy nhiên, việc sử dụng streptomycin không kiểm soát dẫn đến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là sữa, gây nguy cơ dị ứng, rối loạn chức năng thần kinh và phát triển vi khuẩn kháng thuốc. Theo báo cáo, tại Mỹ, khoảng 2730 tấn kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi hàng năm, trong đó nhiều loại kháng sinh tồn dư trong sản phẩm động vật vượt mức cho phép. Tại Việt Nam, khảo sát tại các trang trại chăn nuôi cho thấy 100% trang trại sử dụng kháng sinh, với tỷ lệ mẫu thức ăn chăn nuôi phát hiện kháng sinh lên đến 70,3% ở gà thịt.

Mục tiêu nghiên cứu là sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu với kháng sinh streptomycin, xây dựng aptasensor điện hóa để phát hiện nhanh dư lượng streptomycin trong sữa, góp phần kiểm soát an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Nghiên cứu thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, với mẫu sữa thu thập từ thị trường, trong giai đoạn 2014-2015. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong phát triển công nghệ sinh học ứng dụng kiểm soát dư lượng kháng sinh, giảm thiểu rủi ro sức khỏe và thiệt hại kinh tế do tồn dư kháng sinh trong sản phẩm sữa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Kháng sinh streptomycin: Là aminoglycoside có cơ chế diệt khuẩn bằng cách gắn vào tiểu phần 30S ribosome, ức chế tổng hợp protein vi khuẩn, đặc hiệu với vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số Gram dương. Streptomycin có phổ tác dụng rộng nhưng tồn dư trong thực phẩm gây nguy cơ dị ứng và kháng thuốc.

• Aptamer: Là các oligonucleotide đơn sợi DNA hoặc RNA có cấu trúc không gian đặc trưng, có khả năng gắn kết đặc hiệu với phân tử đích tương tự kháng thể đơn dòng. Aptamer có ưu điểm ổn định, dễ tổng hợp in vitro, có thể biến đổi hóa học mà không ảnh hưởng ái lực, được ứng dụng trong cảm biến sinh học và chẩn đoán.

• Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment): Quy trình chọn lọc aptamer từ thư viện DNA đa dạng khoảng 10^15 phân tử, qua nhiều vòng chọn lọc và khuếch đại PCR để thu nhận aptamer có ái lực cao với streptomycin.

• Aptasensor điện hóa: Thiết bị cảm biến sinh học sử dụng aptamer làm phần nhận biết sinh học, chuyển đổi tín hiệu gắn kết thành tín hiệu điện hóa định lượng. Phương pháp này có ưu điểm nhạy, nhanh, chi phí thấp, phù hợp với kiểm nghiệm thực phẩm quy mô nhỏ.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Thư viện ssDNA đa dạng 10^15 phân tử tổng hợp in vitro; mẫu sữa thu thập từ thị trường được xử lý bằng trichloroacetic acid để loại bỏ lipid và điều chỉnh pH.

• Quy trình nghiên cứu: Sàng lọc aptamer đặc hiệu streptomycin bằng SELEX trên cột agarose-streptomycin, loại trừ aptamer không đặc hiệu, khuếch đại PCR, tách dòng trong vi khuẩn E.coli DH5α, xác định trình tự và cấu trúc aptamer. Thiết kế aptasensor điện hóa gắn aptamer trên điện cực vàng nano, đo tín hiệu điện hóa EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy) để xây dựng đường chuẩn phát hiện streptomycin.

• Phân tích dữ liệu: Đo nồng độ aptamer bằng NanoDrop, đánh giá ái lực bằng ELISA, xác định giới hạn phát hiện (LOD) dựa trên độ lệch chuẩn tín hiệu nền, kiểm tra tính đặc hiệu bằng so sánh với các kháng sinh khác như neomycin, penicillin, tetracycline.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện trong vòng 12 tháng, bao gồm tổng hợp thư viện, sàng lọc aptamer, xây dựng aptasensor, thử nghiệm trên mẫu sữa thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Sàng lọc aptamer đặc hiệu streptomycin: Qua 7 vòng SELEX và 1 vòng loại trừ, thu nhận được aptamer có kích thước 59 bp, có ái lực cao với streptomycin, thể hiện qua giá trị OD450 nm đạt 0,356 trong phản ứng ELISA, vượt trội so với các dòng aptamer khác.

2. Xây dựng aptasensor điện hóa: Aptamer được gắn lên điện cực vàng nano, đo EIS cho thấy trở kháng (Ret) giảm tuyến tính khi nồng độ streptomycin tăng từ 50 ng/ml đến 3000 ng/ml, với phương trình tuyến tính Ret (Ω) = a - b × [Streptomycin], giới hạn phát hiện LOD đạt 45 ng/ml.

3. Tính đặc hiệu aptasensor: Khi thử nghiệm với hỗn hợp kháng sinh gồm neomycin (150 ng/ml), penicillin (0,4 ng/ml), tetracycline (10 ng/ml), tín hiệu điện hóa không thay đổi đáng kể. Chỉ khi bổ sung streptomycin (200 ng/ml), trở kháng giảm rõ rệt, chứng tỏ aptasensor có độ đặc hiệu cao.

4. Phát hiện streptomycin trong mẫu sữa: Mẫu sữa được bổ sung streptomycin với nồng độ 150, 700 và 2000 ng/ml, sau xử lý thu hồi được 82,67%, 91,57% và 93,8% kháng sinh tương ứng, cho thấy aptasensor có khả năng phát hiện hiệu quả trong ma trận phức tạp như sữa.

Thảo luận kết quả

Kết quả sàng lọc aptamer cho thấy aptamer số 4 có cấu trúc bậc 2 chứa nhiều stem-loop với motif đặc trưng tương tự các aptamer streptomycin trong nghiên cứu quốc tế, đảm bảo tính đặc hiệu và ái lực cao. Aptasensor điện hóa dựa trên aptamer này cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu streptomycin trong khoảng nồng độ thực tế tồn dư trong sữa, phù hợp với quy chuẩn kỹ thuật quốc gia và quốc tế.

So sánh với các phương pháp sắc ký khối phổ đắt tiền và phức tạp, aptasensor điện hóa có ưu điểm chi phí thấp, thao tác đơn giản, phù hợp với phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ và kiểm tra sàng lọc nhanh. Tín hiệu điện hóa EIS được thể hiện qua giản đồ Nyquist giúp trực quan hóa sự thay đổi trở kháng khi aptamer gắn streptomycin, có thể trình bày qua biểu đồ đường chuẩn để định lượng chính xác.

Tuy nhiên, việc thu hồi kháng sinh trong mẫu sữa chưa đạt 100% do ảnh hưởng của ma trận phức tạp, cần tối ưu quy trình xử lý mẫu để nâng cao độ chính xác. Ngoài ra, cần đánh giá thêm tính ổn định và tái sử dụng của aptasensor trong điều kiện thực tế.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Hoàn thiện và đánh giá aptasensor trong điều kiện thực tế: Tiến hành thử nghiệm trên đa dạng mẫu sữa và sản phẩm sữa khác nhau, đánh giá độ ổn định, độ lặp lại và khả năng tái sử dụng của aptasensor trong vòng 12 tháng, do Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật phối hợp với các phòng kiểm nghiệm thực phẩm thực hiện.

2. Phát triển sản phẩm thương mại KIT phát hiện streptomycin: Thiết kế bộ KIT dựa trên aptasensor điện hóa, đơn giản hóa thao tác, giảm chi phí sản xuất, hướng tới ứng dụng rộng rãi tại các cơ sở kiểm nghiệm quy mô nhỏ và địa phương trong 2 năm tới, do các doanh nghiệp công nghệ sinh học trong nước đảm nhận.

3. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật sử dụng aptasensor cho cán bộ kiểm nghiệm, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm, nâng cao năng lực phát hiện dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, thực hiện liên tục hàng năm.

4. Tăng cường quản lý và giám sát sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi: Cơ quan quản lý nhà nước cần xây dựng quy định chặt chẽ về sử dụng streptomycin, kiểm soát chặt chẽ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm động vật, phối hợp với các tổ chức nghiên cứu để áp dụng công nghệ aptasensor trong giám sát định kỳ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học: Nghiên cứu về aptamer, aptasensor, ứng dụng công nghệ sinh học trong phát hiện dư lượng kháng sinh.

2. Cán bộ kiểm nghiệm thực phẩm và thú y: Áp dụng phương pháp aptasensor điện hóa để phát hiện nhanh dư lượng streptomycin trong sữa và sản phẩm động vật, nâng cao hiệu quả kiểm soát an toàn thực phẩm.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và sản xuất KIT xét nghiệm: Phát triển sản phẩm thương mại dựa trên aptamer và aptasensor, mở rộng thị trường kiểm nghiệm thực phẩm.

4. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và thú y: Xây dựng chính sách, quy chuẩn kỹ thuật, giám sát việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và tồn dư trong sản phẩm, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Aptamer là gì và ưu điểm so với kháng thể?
   Aptamer là các đoạn oligonucleotide đơn sợi có cấu trúc không gian đặc trưng, gắn kết đặc hiệu với phân tử đích tương tự kháng thể. Ưu điểm gồm độ ổn định cao, dễ tổng hợp in vitro, không cần động vật, có thể biến đổi hóa học mà không ảnh hưởng ái lực, phù hợp cho cảm biến sinh học.

2. Phương pháp SELEX hoạt động như thế nào?
   SELEX là quy trình chọn lọc aptamer từ thư viện DNA đa dạng khoảng 10^15 phân tử, qua nhiều vòng chọn lọc gắn kết với phân tử đích, loại bỏ không đặc hiệu, khuếch đại PCR, nhằm thu nhận aptamer có ái lực và độ đặc hiệu cao.

3. Aptasensor điện hóa có ưu điểm gì trong phát hiện dư lượng kháng sinh?
   Aptasensor điện hóa cho phép phát hiện nhanh, nhạy, chi phí thấp, thao tác đơn giản, phù hợp với phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ, có thể định lượng chính xác dựa trên tín hiệu điện hóa, không cần thiết bị đắt tiền như sắc ký khối phổ.

4. Giới hạn phát hiện (LOD) của aptasensor trong nghiên cứu là bao nhiêu?
   Giới hạn phát hiện của aptasensor streptomycin trong nghiên cứu đạt 45 ng/ml, phù hợp với mức dư lượng kháng sinh tồn dư trong sữa theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia.

5. Khả năng thu hồi kháng sinh trong mẫu sữa sau xử lý là bao nhiêu?
   Khả năng thu hồi streptomycin trong mẫu sữa sau xử lý dao động từ 82,67% đến 93,8% tùy theo nồng độ bổ sung, cho thấy aptasensor có hiệu quả phát hiện trong ma trận phức tạp như sữa.

Kết luận

• Đã sàng lọc thành công aptamer đặc hiệu streptomycin có kích thước 59 bp, có ái lực cao được xác định bằng ELISA.
• Xây dựng quy trình chế tạo aptasensor điện hóa sử dụng aptamer đặc hiệu, có độ đặc hiệu cao với streptomycin.
• Aptasensor có giới hạn phát hiện LOD đạt 45 ng/ml, đáp ứng yêu cầu phát hiện dư lượng kháng sinh trong sữa.
• Đã thử nghiệm thành công aptasensor trên mẫu sữa thực tế với khả năng thu hồi kháng sinh từ 82,67% đến 93,8%.
• Đề xuất hoàn thiện sản phẩm thương mại và đánh giá ứng dụng thực tế để phục vụ kiểm soát an toàn thực phẩm.

Hành động tiếp theo: Tiến hành đánh giá giá trị sử dụng aptasensor trong điều kiện thực tế, phát triển KIT thương mại, đào tạo chuyển giao công nghệ và phối hợp quản lý sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học được khuyến khích ứng dụng kết quả nghiên cứu để nâng cao hiệu quả kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU *** Kháng sinh có vai trò quan trọng trong chăn nuôi giúp tăng hiệu quả, thúc đẩy tăng trưởng, ngăn ngừa bệnh tật. Streptomycin là một kháng sinh aminoglycoside có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn, thường xuyên được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để phòng chống bệnh cho gia súc. Phổ kháng khuẩn của streptomycin bao gồm vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương; streptomycin không có tác dụng với vi khuẩn yếm khí. Streptomycin có hoạt tính đặc biệt chống M.

Streptomycin cũng có hoạt tính chống một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm hiếu khí như : Brucella, Francisellatularensis, Yersinia pestis, Escherichia coli,… Tuy nhiên bên cạnh những mặt có lợi, streptomycin cũng gây ra nhiều tác hại như gây dị ứng, rối loạn cơ quan chức năng thần kinh, thính giác, tạo máu,…Thêm vào đó, việc sử dụng streptomycin trong nông nghiệp có liên quan đến sự gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh nguy cơ tiềm tàng tác động đến sức khỏe con người. Do đó, tồn dư kháng sinh trong môi trường và thực phẩm hiện nay đang là vấn đề rất được quan tâm Hiện nay, có ba phương pháp chủ yếu để xác định dư lượng kháng sinh. Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC- MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên, những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên.

Do vậy, nó không phù hợp với các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gần đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (enzyme linked immunosorbent assay ELISA) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (quyết định Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 2 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c GVHD: PGS. Lê Quang Huấn 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư lượng các chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo, các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm.

Một trong các phương pháp hiện nay đang được tập trung nghiên cứu để xác định dư lượng kháng sinh là phương pháp aptasensor (sử dụng aptamer tham gia cấu tạo sensor) điện hóa. Aptamer là các oligonucleotide (các acid ribonucleoic, RNA và các sợi đơn của acid deoxyribonucleic, ssDNA) hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng nhận biết và gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng. Aptamer đã trở thành lớp chất có nhiều tiềm năng và hy vọng nhất để tạo KIT chẩn đoán và thuốc điều trị hướng đích,. Với những ưu điểm vượt trội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin nhằm tạo KIT xác định nhanh kháng sinh này trong thực phẩm.

Aptasensor là một Biosensor, một thiết bị phân tích có khả năng chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu quang hoặc tín hiệu điện. Đối với aptasensor điện hóa bao gồm các yếu tố thành phần: (1) Phần nhận biết sinh học đối với aptasensor là aptamer; (2) Phần chuyển đổi và khuếch đại tín hiệu nhận biết thành tín hiệu điện có thể định lượng; (3) Phần xác định cường độ tín hiệu điện. Từ kết quả liên quan tới tín hiệu điện có thể suy ra lượng chất phân tích cần xác định. Biosensor theo nguyên lý điện hóa hoạt động theo nguyên lý chuyển hóa trực tiếp một hiện tượng sinh học thành tín hiệu điện để có thể đo được bằng các thiết bị điện.

Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tiến hành đề tài: “nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa” Mục tiêu đề tài : Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 3 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c GVHD: PGS. Lê Quang Huấn - Xây dựng được quy trình sàng lọc các aptamer (có bản chất DNA) có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin. - Tách dòng và chọn dòng các aptamer gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Xác định trình tự và xây dựng cấu trúc bậc 2 của các aptamer thu nhận được - Xây dựng quy trình ELISA phát hiện dư lượng streptomycin trong sữa Nội dung nghiên cứu: - Chuẩn bị thư viện DNA có độ đa dạng khoảng 1015 phân tử - Sàng lọc Aptamer đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Tách dòng và chọn dòng các aptamer thu được có ái lực cao với kháng sinh đích - Sử dụng phương pháp ELISA để phát hiện dư lượng kháng sinh streptomycin CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU *** Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 4 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c GVHD: PGS. Lê Quang Huấn 1.Tổng quan về streptomycin 1.

Kháng sinh streptomycin Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Từ “antibiotics” (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ “antibiosis”. “anti” có nghĩa là “chống lại” và “biosis” có nghĩa là “cuộc sống”.

Chất kháng sinh tác động, chống lại một số loại vi khuẩn. Thật vậy, chất kháng sinh là chất hoá học lấy từ cơ thể các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, hoặc một vài thực vật. Streptomycin là aminoglycoside đầu tiên được sản xuất thương mại và được phân lập từ chủng Streptomyces griseus năm 1944 và sử dụng rất hiệu quả trong điều trị bệnh lao. Các streptomycin đều tạo muối với acid vô cơ.

Các loại muối kháng sinh thường gặp là sunfat, clohydrat, photphat và có cả phức canxi clorua của streptomycin clohydrat. Các muối này hoà tan trong nước, hầu như không tan trong clorofooc, cồn và ethel. Tên quốc tế : Streptomycine Loại thuốc: kháng sinh nhóm aminoglycoside Streptomycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 5 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c GVHD: PGS. Lê Quang Huấn Hình 1.

Cấu trúc streptomycin và dihydrostreptomycin Họ thuốc Chất hoạt động n Họ thuốc Chất hoạt động n amoxicillin 7 chlortetracycline 6 tetracyclines ampicillin 4 oxytetracycline 6 benzylpenicillin 9 dihydrostreptomycin 3 penicillins cloxacillin 7 gentamycin 1 nafcillin 2 aminoglycosides kanamycin 1 penethamate 2 neomycin 3 streptomycin 2 Bảng 1.1 Phân loại (n : loại nhóm) các hợp chất hoạt động có trong thuốc thú y được đăng ký ở Bỉ áp dụng để quản lý quá trình sản xuất sữa bò.) Trong thú y thường dùng streptomycin sulfat. Trong đó hàm lượng Dihydro streptomycin chiếm 79,87%.  Tác dụng: Tác dụng trên các cầu khuẩn gram (+) kháng penicilin, tụ cầu khuẩn, đóng dấu, nhiệt thán, phế cầu, liên cầu (có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh nhóm β lactam) Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 6 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c GVHD: PGS. Lê Quang Huấn Tác dụng chủ yếu đối với vi khuẩn gram (-).

Đặc biệt nhạy cảm là: vi khuẩn tụ huyết trùng, E.coli, shigella (lỵ), pseudomonas, salmonella (vi khuẩn thương hàn), Haemophilus, Brucella. Đặc biệt tác dụng đối với trực khuẩn lao, brucella và các xoắn khuẩn (leptospira) Vi khuẩn kháng streptomycin: khuẩn kỵ khí, trực khuẩn mủ xanh và 1 số nấm bệnh. Hấp thu nhanh qua mao mạch và thải trừ qua thận sau khi tiêm nồng độ streptomycin cao nhất trong máu vào giờ thứ 2. Thải trừ nhanh qua thận 50-70% và sau 12 giờ thải trừ hết.

Ứng dụng điều trị: Người ta thường kết hợp streptomycin với các sulfamid hay với các thuốc khác để trị các bệnh viêm nhiễm do vi khuẩn gây ra. Theo chỉ thị mới nhất của bộ Y tế, hiện nay không dùng streptomycin cho đường tiêu hóa. Streptomycin gây ra phản ứng mẫn cảm ở da thường xuất hiện vào tuần thứ 2 và 3. Hết sức thận trọng để chọn liều thích hợp với người bệnh suy thận.

Với người tăng ure huyết trầm trọng, một liều đơn có thể tạo nồng độ thuốc cao trong máu vài ngày và có thể tích luỹ gây độc trên tai. Khi điều trị dài ngày bằng Streptomycin, kiềm hoá nước tiểu có thể giảm thiểu hoặc ngăn ngừa kích ứng thận. Trẻ em không được dùng Streptomycin vượt quá liều đã khuyến cáo vì đã gặp hội chứng ức chế thần kinh trung ương ở trẻ dùng quá liều.[2,3,12,13] Kháng sinh streptomycin và đồng phân của nó, dihydrostreptomycin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở gia súc, cừu, lợn và gia cầm. Chúng là nhóm aminoglycoside chủ yếu hoạt động chống lại các vi khuẩn gram âm và tác động chủ yếu vào quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn qua việc gắn vào các ribosome nhân sơ.

Các chủng mẫn cảm gồm Actinomyces bovis, Pasturella spp.coli, Salmonella spp., Campylobacter fetus, Leptospira spp., và Brucella spp. Streptomycin cũng được sử dụng để trị các bệnh do vi khuẩn ở ong mật, như bệnh European foulbrood gây ra bởi Melissococcus pluton, Streptococcus apis và Bacillus olvei. Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 7 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn c GVHD: PGS. Lê Quang Huấn Mục đích sử dụng khác của streptomycin là kiểm soát Fireblight, một bệnh tàn phá do vi khuẩn, gây ra bởi Erwina amylovora, ảnh hưởng đến cây ăn quả trong mùa ra hoa.

Cơ chế tác động của kháng sinh streptomycin lên vi khuẩn Streptomycin là thuốc diệt khuẩn, ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosom. Streptomycin gắn đặc hiệu vào tiểu phần 30s của ribosom ở vị trí P10. Do vậy, mã bị đọc sai, gây tổng hợp và tích lũy protein sai lạc, kìm hãm vi khuẩn phát triển. Streptomycin gây rối loạn cả quá trình tổng hợp khâu khởi đầu, kéo dài đến kết thúc, do có thể những P8 và P11.

cũng gắn vào Streptomycin. Ngoài ra còn có cơ chế khác như: thay đổi tính thấm màng, hô hấp tế bào, đến DNA của vi khuẩn. Kháng sinh tác động đến sự tổng hợp protein 1. Kháng sinh trong chăn nuôi 1.