Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật rt pcr phát hiện vi rút hanta trên chuột tại một số điểm ở hà nội năm 2015 2016

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu hus nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật rt pcr phát hiện vi rút hanta trên chuột tại một số điểm ở hà nội, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên

• Tác giả: Phan Hà Mỵ
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi rút Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội, năm 2015 - 2016
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta
• 1.2. Quá trình nhân lên của vi rút Hanta
• 1.3. Phương thức và khả năng gây bệnh
• 1.4. Đặc điểm lâm sàng của bệnh do vi rút Hanta
• 1.5. Bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS)
• 1.6. Hội chứng phổi do vi rút Hanta (HPS)
• 1.7. Dịch tễ học bệnh do vi rút Hanta
• 1.8. Ổ chứa và nguồn truyền bệnh
• 1.9. Chẩn đoán bệnh do vi rút Hanta trong phòng thí nghiệm
• 1.9.1. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
• 1.9.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu. Sinh phẩm, hóa chất
• 2.3. Trang thiết bị, dụng cụ
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Tối ưu hóa quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta và xác định một số thông số kỹ thuật cơ bản
• 2.4.2. Áp dụng quy trình RT-PCR đã được tối ưu hóa để phát hiện vi rút Hanta trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta và xác nhận một số thông số kỹ thuật của phương pháp
• 3.2. Kết quả tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đoán vi rút Hanta
• 3.3. Một số đặc điểm của quy trình phát hiện vi rút Hanta sử dụng kỹ thuật RT-PCR
• 3.4. Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta trên chuột thu thập ở một số địa điểm tại Hà Nội, năm 2015 - 2017
• 3.4.1. Một số đặc điểm về mẫu nghiên cứu
• 3.4.2. Kết quả chẩn đoán vi rút Hanta trên chuột
• 3.5. Kết quả phân tích đặc điểm di truyền đoạn gen M của 2 chủng phân lập năm 2015 và năm 2016
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tối ưu quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta
• 4.2. Sự lưu hành vi rút Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội, năm 2015 - 2016
• 4.3. Phân loài và đặc điểm phân tử đoạn gen M của một số chủng phân lập tại Hà Nội, năm 2015 - 2016
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát hiện vi rút Hanta

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong việc phát hiện vi rút Hanta trên chuột tại Hà Nội trong giai đoạn 2015-2016 đã mở ra những hiểu biết mới về sự lưu hành của vi rút này trong môi trường sống của chuột. Vi rút Hanta, thuộc họ Bunyaviridae, có khả năng gây ra các bệnh nghiêm trọng cho con người như HFRS và HPS. Việc phát hiện sớm vi rút Hanta là rất quan trọng để kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Lịch sử phát hiện vi rút Hanta và tầm quan trọng của nghiên cứu

Vi rút Hanta được phát hiện lần đầu tiên trong những năm 1950 và đã gây ra nhiều đợt dịch bệnh nghiêm trọng. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về vi rút mà còn cung cấp thông tin cần thiết cho các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu và phương pháp RT PCR

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tối ưu hóa kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi rút Hanta trên chuột. Phương pháp RT-PCR cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của vi rút trong mẫu bệnh phẩm.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phát hiện vi rút Hanta

Việc phát hiện vi rút Hanta gặp nhiều thách thức do sự đa dạng của các chủng vi rút và môi trường sống của chuột. Các yếu tố như điều kiện khí hậu, sự thay đổi môi trường và hành vi của chuột đều ảnh hưởng đến khả năng phát hiện vi rút. Hơn nữa, việc phân lập và xác định các chủng vi rút cũng là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

2.1. Đặc điểm sinh học của vi rút Hanta và chuột

Vi rút Hanta có nhiều chủng khác nhau, mỗi chủng có thể gây ra các triệu chứng lâm sàng khác nhau. Chuột là vật chủ tự nhiên của vi rút, và sự tương tác giữa vi rút và chuột rất phức tạp.

2.2. Khó khăn trong việc thu thập mẫu và phân tích

Việc thu thập mẫu chuột trong môi trường tự nhiên đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị chuyên dụng. Ngoài ra, việc phân tích mẫu cũng cần sự chính xác cao để đảm bảo kết quả đáng tin cậy.

III. Phương pháp tối ưu hóa kỹ thuật RT PCR phát hiện vi rút Hanta

Nghiên cứu đã áp dụng các phương pháp tối ưu hóa quy trình RT-PCR để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phát hiện vi rút Hanta. Các yếu tố như nhiệt độ bắt cặp, thời gian kéo dài và nồng độ các thành phần phản ứng đều được điều chỉnh để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Quy trình RT PCR và các thông số kỹ thuật

Quy trình RT-PCR bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu, khuếch đại và phân tích kết quả. Các thông số kỹ thuật như nhiệt độ và thời gian được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác cao.

3.2. Ứng dụng quy trình RT PCR trong phát hiện vi rút Hanta

Sau khi tối ưu hóa, quy trình RT-PCR đã được áp dụng để phát hiện vi rút Hanta trong các mẫu phổi chuột thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau tại Hà Nội.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ chuột nhiễm vi rút Hanta tại Hà Nội là đáng kể. Việc phát hiện vi rút Hanta không chỉ giúp nâng cao nhận thức về dịch bệnh mà còn hỗ trợ các cơ quan y tế trong việc triển khai các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

4.1. Tỷ lệ nhiễm vi rút Hanta trên chuột

Kết quả cho thấy tỷ lệ chuột dương tính với vi rút Hanta là 14-34%, cho thấy sự lưu hành của vi rút trong môi trường sống của chuột tại Hà Nội.

4.2. Ý nghĩa của kết quả nghiên cứu đối với sức khỏe cộng đồng

Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho các cơ quan y tế trong việc giám sát và phòng ngừa dịch bệnh do vi rút Hanta gây ra.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu vi rút Hanta

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong phát hiện vi rút Hanta trên chuột tại Hà Nội đã đạt được những kết quả khả quan. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự lưu hành của vi rút và phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của việc giám sát vi rút Hanta

Việc giám sát vi rút Hanta là cần thiết để phát hiện sớm các ca bệnh và ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu cần tiếp tục mở rộng để bao quát nhiều khu vực khác nhau và áp dụng các công nghệ mới trong việc phát hiện và giám sát vi rút Hanta.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1. Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta Vi rút Hanta nằm trong họ Bunyaviridae, lịch sử phát hiện ra chúng gắn liền với hai bệnh điển hình mà chúng gây nên là HPS và HFRS. Trong đó, HFRS được nhắc đến trong các tạp chí Y học tại châu Âu và châu Á dưới rất nhiều tên gọi khác nhau như sốt xuất huyết Nam Triều Tiên hay bệnh dịch sốt xuất huyết [54]. Một số ý kiến cho rằng, HFRS đã tồn tại rất lâu khoảng 1.000 năm trước tại Trung Quốc [40] và tại Anh Quốc thời kỳ Trung Cổ [43].

Một số đợt dịch được cho là mắc HFRS xuất hiện lẻ tẻ trong các báo cáo tại Nga vào năm 1913 và 1932, tại Mãn Châu năm 1932, tại Thụy Điển năm 1934 [54]. Trên thực tế, HFRS lần đầu tiên thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu cũng như giới y học là trong khoảng thời gian chiến tranh Triều Tiên (1951 – 1954) khiến khoảng 3.200 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện và 7% bệnh nhân tử vong [37, 54]. Tiếp đó, vào đầu những năm 1940, các nhà nghiên cứu người Nga và Nhật Bản đưa ra những giả thuyết đầu tiên về tác nhân gây bệnh cũng như vật chủ tự nhiên của chúng [13]. Năm 1978, dựa trên kết quả thí nghiệm dương tính trong phản ứng huyết thanh người bệnh với kháng nguyên tách từ phổi của chuột đồng sọc vàng giống Apodemus agrarius và kết quả của các thí nghiệm chứng minh sự lây truyền vi rút giữa các động vật gặm nhấm, các nhà nghiên cứu đã khẳng định vật chủ tự nhiên của vi rút Hanta là động vật gặm nhấm.

Dựa trên tiền đề đó, vi rút gây ra HFRS được phân lập từ loài Apodemus agrarius và đặt tên là Hantaanvirus theo tên con sông Haanta, nơi thu thập mẫu chuột [38, 42]. Năm 1993, sự gia tăng đô ̣t biế n các ca bệnh suy hô hấp bất thường sau này gọi là HPS - Hội chứng phổi do vi rút Hanta ở vùng Tây Nam nước Mỹ với tỉ lệ tử vong cao [40]. Các thí nghiệm nhanh chóng tiến hành và đưa ra kết quả dương tính giữa huyết thanh người bệnh với kháng nguyên của tác nhân gây bê ̣nh. Kháng nguyên này được tách chiế t trong mô của người bệnh cũng như trong các mẫu mô của động vật gặm nhấm thu thập quanh nhà các bệnh nhân.

Trong khoảng thời gian rất ngắn, các nhà nghiên cứu đã phân lập đươ ̣c loại vi rút Hanta mới từ chuột hươu Peromyscus maniculatus 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] và đặt tên là vi rút Sin Nombre [42]. Tính đến thời điểm hiện tại có hơn 21 vi rút Hanta có khả năng gây bệnh cho người đã được phát hiện trên toàn thế giới [18]. Phân loại Vi rút Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae - một họ lớn bao gồm hơn 300 loài vi rút có khả năng gây nhiễm cho động vật, thực vật, con người và các loài chân đốt [27, 66]. Hantavirus bao gồm nhiều loài vi rút khác nhau được phân thành các genotype (kiểu gen) và serotype – týp huyết thanh khác nhau [66].

Mặc dù có rất nhiều vi rút Hanta được phát hiện nhưng tính tới thời điểm hiện tại, chỉ có 24 vi rút Hanta được Ủy ban Quốc tế về Phân loại Vi rút (ICTV) chính thức phân loại, trong đó bao gồm cả những vi rút không gây bệnh cho người. Theo ICTV, có bốn tiêu chuẩn để xác định các týp vi rút Hanta: (1) thuộc về ổ sinh thái duy nhất, ví dụ như tác động đến một loài hoặc phân loài gặm nhấm nhất định như là vật chủ chính; (2) khác biệt ít nhất 7% ở trình tự amino acid của glycoprotein bề mặt thuộc nucleoprotein của vi rút; (3) khác biệt ít nhất bốn lần về mức độ kháng thể trung hòa; (4) không hình thành sự tái sắp xếp tự nhiên với các vi rút Hanta khác [18]. Tuy nhiên các tiêu chuẩn về phân loại còn gặp khá nhiều tranh cãi, thậm chí một số nhà nghiên cứu đưa ra đề nghị nên phân loại các vi rút Hanta không được liệt kê trong danh sách phân loại chính thức của ICTV thành các genotype và đặt tên viết tắt kết thúc bằng các con số [19]. Bên cạnh đó, vi rút Hanta cũng được đề cập đến trong các tài liệu thống kê, dịch tễ và nghiên cứu với 2 nhóm chính: vi rút Hanta trong Cựu Thế Giới (Old World) và vi rút Hanta trong Tân thế giới (New World) [27, 37, 43].

Sự phân chia này tương ứng với thời gian phát hiện ra các vi rút Hanta tương ứng gây bệnh HFRS và HPS [27]. Ví dụ, các vi rút Hanta thuộc nhóm Cựu Thế Giới gây ra bệnh HFRS cho người có thể kể đến vi rút Amur, vi rút Seoul phân bố phổ biến tại Châu Á cũng như vi rút Dobrava, vi rút Tula và vi rút Puumala phân bố chủ yếu tại Châu Âu. Nhóm vi rút Hanta Tân Thế Giới bao gồm các vi rút là tác nhân của gần 300 ca bệnh HPS mỗi năm tại các vùng Bắc và Nam Mỹ [43]. Đặc điểm đặc trưng của vi rút Hanta là mỗi vi rút Hanta gây nhiễm đặc hiệu cho một loài vật chủ chứa nhất định, 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] vật chủ chứa đó phần lớn là các loài động vật gặm nhấm.

Trường hợp điển hình của vi rút Hanta phân lập ở loài ăn sâu bọ là vi rút Thottapalayam (TPMV) phân lập đươ ̣c ở chuột chù Suncus murinus [37, 40, 54, 57]. Chính vì mối quan hệ gần gũi giữa vi rút và vật chủ chứa, vi rút Hanta thường được nhắc đến trong các nghiên cứu theo vật chủ của chúng.2 trình bày các chủng vi rút Hanta phân loại theo động vật chủ. Hình thái Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, hạt vi rút có hình cầu hoặc hình bầu dục với đường kính từ 80 – 120 nm [27, 34, 37, 66]. Tuy nhiên, vi rút Hanta cũng có thể có hình dạng thon dài (170nm), hình thái này ít thấ y ở các vi rút khác trong họ Bunyaviridae [66].

Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét của vi rút Sin Nombre (Vi rút phân lập được từ bê ̣nh nhận tại vụ dịch bệnh HPS năm 1993 ở vùng Tây Nam nước Mỹ). Cấu trúc Cấu trúc của vi rút Hanta bao gồm các ribonucleoprotein đóng gói bởi vỏ ngoài bao gồm 2 lớp lipid gắn với glycoprotein bề mặt [22, 27, 42, 44]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sơ đồ cấu tạo của hạt vi rút Hanta [37].

Các protein cấu trúc của vi rút Hanta Vi rút Hanta có 3 protein cấu trúc [42]  Glycoprotein Glycoprotein tiền thân (GPC) của vi rút Hanta được tổng hợp ở ribosome liên kết với màng lưới nội chất (ER) [42]. Sau đó trong quá trình chuyển tới ER, GPC được protease nội bào phân chia thành glycoprotein trưởng thành G1 và G2 [42], [44]. Các glycoprotein G1 và G2 tạo điều kiện cho vi rút có thể gắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ [27, 42, 44]. Cũng có nghiên cứu cho rằng G1 ức chế tế bào vâ ̣t chủ sản xuấ t IFN-β – yếu tố quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch của tế bào vâ ̣t chủ chống lại sự xâm nhập của vi rút [44].

Protein N tồn tại với mật độ cao trong tế bào chất của tế bào nhiễm vi rút. Có thể phát hiện được protein N khoảng 6 tiếng sau khi tế bào bị nhiễm [42]. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đáp ứng miễn dịch sớm phần lớn tác động đích đến Protein N. Chức năng của Protein N là đóng gói vật liệu di truyề n của vi rút vì vậy chúng đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ nhân lên của vi rút [42, 44].

6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail]  ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp) RdRp là protein lớn với trọng lượng phân tử trong khoảng 250 – 280 KD. Do trọng lượng lớn nên RdRp rất khó để biểu hiện protein này bằ ng các phương pháp tái tổ hơ ̣p trên hệ thống tế bào vi khuẩn dùng để biể u hiê ̣n protein của gen. Vì vậy có thể nói chúng là protein có nhiều đặc điểm chưa được làm rõ nhất ở vi rút Hanta. RdRp thực hiện khá nhiều vai trò: phiên mã, nhân bản, endonuclease, tháo xoắn helix ARN.

Trong quá trình phiên mã RdRp tổng hợp mARN từ khuôn là sợi đơn âm ARN và nhân bản vật liê ̣u di truyền của vi rút qua cARN (ARN bổ sung) [42]. Cấu trúc hệ gen vi rút Hanta Vi rút Hanta mang vật liệu di truyền là sợi ARN đơn âm, chia thành 3 đoạn dựa trên tro ̣ng lượng phân tử [22, 27, 40, 43]. Đoạn lớn L mã hóa cho ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút (RdRp); đoạn trung bình M mã hóa cho glycoprotein vỏ tiền thân (GPC) cho vi rút mà sau đó tạo nên 2 glycoprotein là G1 và G2 hay còn gọi là Gn và Gc; đoạn nhỏ S mã hóa cho protein nucleocapsid (N) [37, 40, 42, 44]. Trình tự nucleotide tại đầu 5’ và 3’ của mỗi đoạn đều bắt cặp bổ sung theo cặp ba zơ tạo nên cấu trúc cán xoong “panhandle” [42].

Sơ đồ cấu trúc hệ gen của vi rút Hanta 1. Quá trình nhân lên của vi rút Hanta Các tế bào đić h của vi rút Hanta trên cơ thể vâ ̣t chủ bao gồ m: các tế bào nội mô, tế bào biểu mô, đại thực bào, các tế bào gai nang và các tế bào bạch cầu. Vi rút xâm nhâ ̣p vào các tế bào đić h thông qua liên kết giữa glycoprotein của vi rút và các thụ thể trên bề mặt tế bào của vật chủ. Vi rút Hanta có thể xâm nhập vào tế bào đích 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thông qua màng tế bào.

Có thể mô tả quá trình này bằng 7 bước cơ bản như sau (1) vi rút gắn glycoprotein của mình vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ; (2) vi rút xâm nhập vào tế bào đích bằng con đường nhập bào qua thụ thể trung gian sau đó giải phóng genome của chúng vào tương bào; (3) phiên mã thành ARN bổ sung (cRNA) từ hệ gen ARN vi rút, tiế p đó là các mARN; (4) sử dụng bộ máy dịch mã của vật chủ dịch mã ta ̣o các protein từ các đoạn mARN mã hóa cho các protein L, M và S; (5) nhân bản ARN của vi rút, kết hợp với protein N và vận chuyển đến mạng bộ máy Golgi; (6) tạo thành cấu trúc cơ bản của vi rút từ các thành phần tại bộ máy Golgi.