I. Tổng quan đề tài định lượng paraquat bằng CE C4D HUS
Luận văn thạc sĩ HUS với mã số 604401 trình bày một công trình nghiên cứu khoa học chuyên sâu về việc phân tích định lượng paraquat trong huyết tương người. Nghiên cứu này ứng dụng một phương pháp phân tích độc chất hiện đại là điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) kết hợp với detector độ dẫn không tiếp xúc (Contactless Conductivity Detection - C4D). Paraquat (PQ) là một loại thuốc diệt cỏ cực độc, gây ra nhiều ca ngộ độc paraquat với tỷ lệ tử vong cao tại Việt Nam. Theo thống kê từ Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai, số ca ngộ độc không ngừng tăng qua các năm, nhấn mạnh sự cấp thiết của việc có một phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác. Các phương pháp truyền thống như HPLC hay LC-MS tuy hiệu quả nhưng chi phí đầu tư cao, gây khó khăn cho các bệnh viện tuyến địa phương. Đề tài nghiên cứu khoa học HUS này ra đời nhằm giải quyết thách thức đó, đề xuất một giải pháp phân tích hiệu quả, chi phí thấp hơn, có khả năng triển khai rộng rãi. Mục tiêu chính của luận văn là xây dựng và tối ưu hóa quy trình từ xử lý mẫu huyết tương đến phân tích, cuối cùng là thẩm định toàn bộ quy trình để đảm bảo độ tin cậy, góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị kịp thời cho bệnh nhân.
1.1. Thực trạng ngộ độc paraquat và sự cần thiết của xét nghiệm
Paraquat là một hợp chất hóa học có độc tính cao, chỉ một lượng nhỏ (khoảng 10ml dung dịch 20%) cũng có thể gây tử vong cho người trưởng thành. Tình hình ngộ độc paraquat tại Việt Nam diễn biến phức tạp, chủ yếu do tự tử. Dù đã có lệnh cấm lưu hành, số ca ngộ độc vẫn còn ở mức báo động. Việc xác định nồng độ paraquat sớm trong máu có ý nghĩa sống còn, giúp bác sĩ tiên lượng mức độ nặng và quyết định phác đồ điều trị, đặc biệt là chỉ định lọc máu hấp phụ. Do đó, một phương pháp xét nghiệm paraquat trong máu nhanh chóng, chính xác và dễ tiếp cận là yêu cầu cấp bách trong thực hành lâm sàng tại các cơ sở y tế.
1.2. Giới thiệu phương pháp điện di mao quản CE C4D
Phương pháp điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích thuộc lĩnh vực hóa học phân tích hiện đại. Kỹ thuật này tách các ion dựa trên sự di chuyển khác nhau của chúng trong một điện trường mạnh bên trong một mao quản nhỏ. Khi kết hợp với detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D), hệ thống có thể phát hiện các ion mà không cần tiếp xúc trực tiếp với dung dịch, giúp giảm nhiễu và tăng độ bền của detector. Phương pháp CE-C4D nổi bật với ưu điểm như tốc độ phân tích nhanh, lượng mẫu tiêu thụ ít, chi phí vận hành thấp và thiết bị tương đối gọn nhẹ, phù hợp để triển khai tại nhiều phòng xét nghiệm khác nhau.
II. Khó khăn trong xét nghiệm paraquat và xử lý mẫu huyết tương
Việc phân tích định lượng paraquat trong mẫu sinh học, đặc biệt là huyết tương người, đối mặt với nhiều thách thức lớn. Huyết tương là một nền mẫu phức tạp, chứa vô số thành phần có thể gây nhiễu tín hiệu phân tích như protein, lipid, muối và các cation vô cơ (Na+, K+, Ca2+). Các phương pháp phân tích truyền thống như quang phổ hay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đòi hỏi quy trình xử lý mẫu huyết tương phức tạp và tốn thời gian để loại bỏ các yếu tố cản trở này. Nếu không được xử lý triệt để, các protein có thể làm tắc cột phân tích, trong khi các ion khác có thể che lấp tín hiệu của paraquat, dẫn đến kết quả không chính xác. Hơn nữa, các thiết bị như LC-MS/MS tuy có độ nhạy và độ chọn lọc cao nhưng chi phí đầu tư và bảo trì rất lớn, vượt quá khả năng của nhiều bệnh viện tuyến dưới. Luận văn này tập trung giải quyết bài toán cốt lõi: làm thế nào để có một quy trình xử lý mẫu hiệu quả, loại bỏ tối đa tạp chất nhưng vẫn giữ được paraquat, đồng thời sử dụng một phương pháp phân tích độc chất vừa chính xác vừa kinh tế như CE-C4D.
2.1. Hạn chế của các phương pháp phân tích độc chất cổ điển
Các phương pháp phân tích độc chất cổ điển như phương pháp so màu tuy đơn giản nhưng chỉ mang tính định tính hoặc bán định lượng, độ nhạy và độ đặc hiệu thấp. Trong khi đó, các phương pháp hiện đại như HPLC và GC-MS đòi hỏi thiết bị đắt tiền, dung môi tiêu tốn và cần chuyên gia có trình độ cao để vận hành. Những hạn chế này làm cho việc triển khai xét nghiệm paraquat thường quy trở nên khó khăn, đặc biệt ở các khu vực xa trung tâm, nơi nhu cầu chẩn đoán nhanh là rất lớn.
2.2. Sự phức tạp của nền mẫu huyết tương người
Nền mẫu huyết tương chứa nồng độ cao các cation như Na+ (khoảng 140 mM) và Ca2+ (khoảng 5 mM). Các ion này có độ linh động điện di cao, có thể tạo ra tín hiệu nền lớn và ảnh hưởng trực tiếp đến tín hiệu của paraquat trong kỹ thuật C4D. Do đó, quy trình xử lý mẫu huyết tương không chỉ cần loại bỏ protein mà còn phải giảm thiểu nồng độ các cation gây nhiễu này. Đây là một trong những thách thức kỹ thuật lớn nhất cần được tối ưu hóa trong nghiên cứu.
III. Hướng dẫn tối ưu phương pháp CE C4D định lượng paraquat
Để đạt được hiệu quả phân tích cao nhất, luận văn đã tiến hành khảo sát và tối ưu hóa toàn diện các điều kiện của phương pháp CE-C4D. Quá trình này là bước quan trọng nhất để xây dựng một quy trình phân tích chuẩn. Các yếu tố chính được nghiên cứu bao gồm thành phần, nồng độ và pH của dung dịch đệm điện di. Dung dịch đệm không chỉ tạo môi trường dẫn điện mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến dòng điện thẩm thấu (EOF) và độ linh động của paraquat, từ đó quyết định thời gian phân tích và khả năng tách paraquat khỏi các ion khác. Nghiên cứu đã thử nghiệm nhiều hệ đệm khác nhau, và kết quả cho thấy hệ đệm Histidine - Axit Acetic mang lại hiệu quả tốt nhất. Việc tinh chỉnh các thông số như thế tách (+20kV), thời gian bơm mẫu (30s bằng phương pháp thủy động lực) và nhiệt độ mao quản cũng được thực hiện cẩn thận. Mục tiêu của quá trình tối ưu hóa này là tìm ra một bộ điều kiện "vàng" cho phép xác định nồng độ paraquat một cách nhanh chóng, với pic tín hiệu rõ nét, đối xứng và tách biệt hoàn toàn khỏi tín hiệu nền, tạo tiền đề cho việc thẩm định phương pháp phân tích sau này.
3.1. Khảo sát thành phần và nồng độ hệ đệm điện di tối ưu
Luận văn đã khảo sát các hệ đệm khác nhau, bao gồm L-Histidine và Arginine. Kết quả cho thấy hệ đệm L-Histidine 5mM kết hợp với Axit Acetic cho tín hiệu paraquat cao và ổn định nhất. Nồng độ đệm cũng được khảo sát, và nồng độ 5mM được chọn vì nó cân bằng giữa việc cung cấp tín hiệu tốt và giảm thiểu dòng điện chạy qua mao quản, tránh hiện tượng quá nhiệt gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích bằng kỹ thuật C4D.
3.2. Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến quá trình phân tách
Giá trị pH của dung dịch đệm là một yếu tố then chốt. Paraquat có pKa ~ 9-9.5, do đó ở môi trường pH axit, nó sẽ tồn tại hoàn toàn dưới dạng cation (PQ2+), thuận lợi cho việc phân tách. Nghiên cứu đã khảo sát dải pH từ 4,0 đến 5,5. Kết quả trong luận văn chỉ ra rằng pH 4,0 là tối ưu nhất, mang lại diện tích pic lớn nhất và thời gian di chuyển hợp lý. Giá trị pH này đảm bảo paraquat được ion hóa hoàn toàn và di chuyển hiệu quả trong điện di mao quản.
IV. Bí quyết xử lý mẫu huyết tương bằng chiết pha rắn SPE
Một trong những đóng góp quan trọng nhất của luận văn là xây dựng thành công quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết pha rắn (Solid Phase Extraction - SPE). Kỹ thuật này được lựa chọn vì khả năng làm sạch và làm giàu mẫu vượt trội so với chiết lỏng-lỏng. Nghiên cứu sử dụng cột chiết C18, một loại cột pha đảo phổ biến. Quy trình xử lý bắt đầu bằng việc loại bỏ protein trong huyết tương bằng Axit Trichloroacetic (TCA). Sau đó, dung dịch được kiềm hóa và cho qua cột C18 đã được hoạt hóa. Điểm mấu chốt của quy trình là sử dụng các chất tạo cặp ion như CTAB và natri heptansulfonate để giữ paraquat (một cation) trên bề mặt không phân cực của cột C18. Các bước rửa tạp được tối ưu hóa để loại bỏ các cation gây nhiễu (Na+, Ca2+) và các tạp chất khác. Cuối cùng, paraquat được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi phù hợp. Đặc biệt, nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của việc thêm EDTA vào mẫu để tạo phức với ion Ca2+, ngăn chặn nó cản trở quá trình phân tích. Quy trình SPE được tối ưu hóa này là chìa khóa để áp dụng thành công phương pháp CE-C4D vào phân tích định lượng paraquat trong nền mẫu phức tạp.
4.1. Quy trình chiết paraquat trên cột C18 sử dụng cặp ion
Quy trình SPE trên cột C18 được xây dựng dựa trên cơ chế tạo cặp ion. Cột C18 được hoạt hóa tuần tự bằng methanol và nước, sau đó được xử lý bằng CTAB và natri heptansulfonate. Các chất này tạo thành một lớp bề mặt tích điện, giúp giữ lại cation paraquat. Mẫu sau khi tiền xử lý được nạp vào cột, các tạp chất không mong muốn sẽ được rửa trôi, còn paraquat được giữ lại và sau đó được rửa giải để tiến hành phân tích.
4.2. Tối ưu hóa dung dịch rửa tạp và vai trò của EDTA
Việc lựa chọn dung dịch rửa tạp và rửa giải là rất quan trọng để đạt hiệu suất thu hồi cao. Luận văn đã khảo sát nhiều loại dung môi và tỷ lệ khác nhau. Kết quả cho thấy hỗn hợp methanol và nước là dung dịch rửa tạp hiệu quả, trong khi methanol chứa axit axetic là dung dịch rửa giải tối ưu. Ngoài ra, việc thêm EDTA nồng độ 10-3 M vào mẫu trước khi chiết đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong việc loại bỏ sự cản trở của ion Ca2+, giúp tín hiệu paraquat trở nên rõ ràng và ổn định hơn đáng kể.
V. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích định lượng paraquat
Sau khi tối ưu hóa toàn bộ quy trình, luận văn đã tiến hành thẩm định phương pháp phân tích một cách nghiêm ngặt để đánh giá độ tin cậy và tính chính xác. Các thông số quan trọng đã được xác định, bao gồm độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, và đặc biệt là giới hạn phát hiện (LOD) paraquat và giới hạn định lượng (LOQ) paraquat. Đường chuẩn được xây dựng trên cả nền dung dịch chuẩn và nền mẫu huyết tương trắng, cho thấy hệ số tương quan (R) rất cao (thường > 0,99), chứng tỏ mối quan hệ tuyến tính tốt giữa nồng độ và tín hiệu phân tích. Độ chính xác của phương pháp, được đánh giá qua độ lặp lại và độ tái lặp, cho kết quả độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) thấp, nằm trong giới hạn chấp nhận được. Một trong những kết quả nổi bật nhất là việc đối chứng phương pháp CE-C4D với phương pháp HPLC đang được sử dụng thường quy tại Bệnh viện Bạch Mai. Kết quả phân tích trên các mẫu bệnh nhân thực tế cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa hai phương pháp, khẳng định rằng phương pháp CE-C4D hoàn toàn đủ độ tin cậy để ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
5.1. Xác định giới hạn phát hiện LOD và định lượng LOQ
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ nhạy rất tốt. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp (MDL) được xác định là 0,05 µg/mL và giới hạn định lượng (LOQ) là 0,15 µg/mL. Các giá trị này đủ thấp để có thể phát hiện và định lượng nồng độ paraquat ở ngưỡng có ý nghĩa lâm sàng trong các ca ngộ độc paraquat, đáp ứng yêu cầu chẩn đoán và theo dõi điều trị.
5.2. So sánh hiệu quả phương pháp CE C4D với HPLC
Để đánh giá tính tương đương, luận văn đã phân tích song song 50 mẫu huyết tương của bệnh nhân bằng cả hai phương pháp. Kết quả cho thấy mối tương quan rất tốt giữa nồng độ paraquat đo bằng CE-C4D và HPLC (hệ số tương quan R = 0.9855). Sự tương đồng này là một bằng chứng mạnh mẽ, khẳng định phương pháp CE-C4D là một sự thay thế đáng tin cậy, hiệu quả và kinh tế hơn cho phương pháp HPLC trong việc xét nghiệm paraquat trong máu.
VI. Tiềm năng ứng dụng kỹ thuật CE C4D trong chẩn đoán
Kết quả từ luận văn hóa phân tích này đã mở ra một hướng đi mới đầy hứa hẹn cho việc chẩn đoán và theo dõi ngộ độc paraquat. Việc xây dựng thành công một quy trình hoàn chỉnh, từ xử lý mẫu huyết tương đến phân tích định lượng paraquat bằng phương pháp CE-C4D, không chỉ là một thành tựu khoa học mà còn mang ý nghĩa thực tiễn to lớn. Với những ưu điểm vượt trội như chi phí đầu tư và vận hành thấp, tốc độ phân tích nhanh, quy trình đơn giản, thiết bị Contactless Conductivity Detection này hoàn toàn có thể được triển khai tại các bệnh viện tuyến tỉnh và tuyến huyện. Điều này sẽ giúp các bác sĩ tại địa phương có thể chẩn đoán sớm và chính xác mức độ ngộ độc, từ đó đưa ra quyết định điều trị kịp thời mà không cần phải gửi mẫu lên tuyến trung ương, rút ngắn thời gian chờ đợi quý báu. Hướng phát triển trong tương lai của đề tài nghiên cứu khoa học HUS này có thể bao gồm việc tự động hóa quy trình xử lý mẫu, phát triển các bộ kit xét nghiệm nhanh dựa trên nền tảng điện di mao quản, và mở rộng ứng dụng phương pháp này để định lượng các độc chất khác.
6.1. Đóng góp của đề tài nghiên cứu khoa học HUS
Nghiên cứu đã lần đầu tiên tại Việt Nam xây dựng thành công và toàn diện quy trình định lượng paraquat trong huyết tương bằng phương pháp CE-C4D. Luận văn đã cung cấp một bộ dữ liệu khoa học chi tiết và đáng tin cậy về việc tối ưu hóa và thẩm định phương pháp. Đây là một tài liệu tham khảo quý giá cho lĩnh vực hóa học phân tích hiện đại và độc chất học lâm sàng, đóng góp trực tiếp vào việc cải thiện năng lực xét nghiệm y tế.
6.2. Khả năng chuyển giao kỹ thuật cho tuyến cơ sở
Với thiết bị nhỏ gọn và chi phí hợp lý, kỹ thuật C4D có tiềm năng rất lớn trong việc chuyển giao công nghệ cho các bệnh viện tuyến cơ sở. Việc áp dụng rộng rãi phương pháp này sẽ giúp cải thiện đáng kể công tác chẩn đoán và điều trị ngộ độc paraquat trên toàn quốc, đặc biệt là tại những vùng sâu, vùng xa, góp phần giảm thiểu tỷ lệ tử vong do loại độc chất nguy hiểm này gây ra.
