Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất từ thực vật và nấm nội sinh, góp phần vào y học và bảo vệ sức khỏe.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Hiếu
• Người hướng dẫn: TS. Dương Ngọc Tú
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập Và Thử Nghiệm Hoạt Tính Sinh Học Của Các Hoạt Chất Từ Một Số Loài Thực Vật Và Nấm Nội Sinh Thực Vật
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC SƠ ĐỒ
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật
• 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học
• 1.2.1. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật
• 1.2.1.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu
• 1.2.1.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh
• 1.2.1.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam
• 1.2.2. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới
• 1.2.2.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật
• 1.2.2.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật
• 1.3. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.)
• 1.3.1. Thực vật học
• 1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Mẫu thực vật
• 2.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học, lập hồ sơ lưu trữ
• 2.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật
• 2.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật
• 2.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS
• 2.6. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu
• 2.6.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 2.7. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
• 2.8. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm
• 2.8.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm
• 2.8.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm
• 2.9. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật
• 2.10. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật
• 2.10.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.)
• 2.10.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana)
• 2.10.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L.)
• 2.11. Thực nghiệm phân lập thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật
• 2.11.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana)
• 2.11.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla)
• 2.11.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa)
• 2.11.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)
• 2.11.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M.)
• 2.11.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F.)
• 2.11.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F.)
• 2.12. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân đoạn và chất sạch
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật
• 3.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch chiết tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh thực vật
• 3.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh thực vật
• 3.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A. oligophylla)
• 3.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.)
• 3.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.)
• 3.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu
• 3.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng
• 3.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không
• 3.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học thực vật và nấm nội sinh thực vật
• 3.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu
• 3.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng
• 3.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Từ Thực Vật

Nâng cao chất lượng cuộc sống đòi hỏi sản phẩm nông nghiệp an toàn. Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), chủ yếu là hóa chất độc hại, tạo ra vòng luẩn quẩn. Cần tìm kiếm giải pháp phòng trừ sâu bệnh hiệu quả, thân thiện với môi trường. Các biện pháp sinh học, như thuốc BVTV gốc sinh học, đang trở thành hướng đi chủ đạo. Ưu điểm của chúng là ít độc hại, bảo vệ cân bằng sinh học, và mau phân hủy. Nguyên liệu thường có sẵn, chi phí sản xuất thấp, mang lại hiệu quả cao cho người dân. Nấm nội sinh thực vật (NSTV) sống trong tế bào thực vật mà không gây hại, thậm chí còn thúc đẩy tăng trưởng. Chúng bảo vệ cây khỏi yếu tố bất lợi và mầm bệnh. Nghiên cứu đặt ra câu hỏi về nguồn gốc các hoạt chất quý giá: do cây, do nấm, hay do mối quan hệ tương sinh? Nhiều nghiên cứu cho thấy chất biến dưỡng của nấm NSTV có khả năng trị liệu trên nhiều loại mầm bệnh. Nấm NSTV được coi là nguồn tài nguyên vô tận cho công nghệ sinh học - dược phẩm.

1.1. Vai Trò Của Thuốc Bảo Vệ Thực Vật Sinh Học

Thuốc BVTV sinh học (BVTVSH) có nhiều ưu điểm vượt trội so với thuốc BVTV hóa học. Chúng ít độc hại với người và sinh vật có ích, bảo vệ cân bằng sinh học tự nhiên. Thuốc BVTVSH mau phân hủy, ít để lại dư lượng độc trên nông sản, phù hợp với nông sản yêu cầu độ sạch cao. Nguyên liệu tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn, chi phí sản xuất thấp, giúp tiết kiệm chi phí cho người dân. Với những lợi ích này, thuốc BVTVSH giúp người nông dân canh tác bền vững hơn. Theo tài liệu gốc, việc sử dụng thuốc BVTVSH giúp bảo vệ sự cân bằng sinh học và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

1.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Nấm Nội Sinh Thực Vật

Nấm nội sinh thực vật (NSTV) là nguồn tài nguyên vô tận chưa được khai thác hết. Thống kê cho thấy 51% hợp chất có hoạt tính phân lập từ nấm NSTV là hợp chất mới. Các hợp chất này có tiềm năng lớn trong y tế và nông nghiệp, với giá thành sản xuất rẻ và cấu trúc đa dạng. Khai thác nấm NSTV giúp tránh khai thác cạn kiệt tài nguyên thực vật, bảo tồn đa dạng sinh học. Việt Nam có tiềm năng đa dạng sinh học lớn, với nhiều loài thực vật đặc hữu. Cần khai thác nguồn tài nguyên này kết hợp với công nghệ hiện đại để tạo ra sản phẩm giá trị cao. Theo tài liệu gốc, nấm NSTV có khả năng sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Thực Vật

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc nghiên cứu và ứng dụng hoạt tính sinh học từ thực vật và nấm nội sinh vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Cần có quy trình sàng lọc, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hiệu quả. Việc thử nghiệm hoạt tính sinh học cần được thực hiện một cách bài bản, từ in vitro đến in vivo. Quan trọng là phải đảm bảo an toàn sinh học và tuân thủ đạo đức nghiên cứu. Cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học, doanh nghiệp và nhà quản lý để đưa kết quả nghiên cứu vào thực tiễn. Việc bảo tồn đa dạng sinh học và khai thác bền vững nguồn tài nguyên thực vật và nấm cũng là một thách thức lớn. Theo tài liệu gốc, việc nghiên cứu hoạt tính sinh học đòi hỏi sự đầu tư về cơ sở vật chất, trang thiết bị và nguồn nhân lực.

2.1. Vấn Đề Về Phân Lập Và Định Danh Nấm Nội Sinh

Việc phân lập và định danh nấm nội sinh đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn cao. Cần có phương pháp phân lập hiệu quả để thu được các chủng nấm thuần khiết. Định danh nấm nội sinh cần dựa trên cả đặc điểm hình thái và phân tích gene. Việc xây dựng bộ gene tham khảo cho các loài nấm nội sinh ở Việt Nam còn hạn chế. Cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học trong và ngoài nước để giải quyết vấn đề này. Theo tài liệu gốc, việc định danh nấm nội sinh bằng phương pháp PCR giải trình tự gene vùng ITS là một phương pháp hiệu quả.

2.2. Khó Khăn Trong Thử Nghiệm Hoạt Tính Sinh Học

Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất từ thực vật và nấm nội sinh đòi hỏi quy trình chuẩn hóa. Cần có các mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo phù hợp. Việc đánh giá độc tính tế bào và an toàn sinh học là rất quan trọng. Cần có sự phối hợp giữa các nhà sinh học, hóa học và dược học để đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học của các hợp chất. Theo tài liệu gốc, việc thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm cần được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Hoạt Chất Từ Thực Vật Nấm

Để khai thác hoạt tính sinh học từ thực vật và nấm nội sinh, cần có phương pháp chiết xuất hiệu quả. Các phương pháp chiết xuất truyền thống như ngâm, sắc, chiết Soxhlet vẫn được sử dụng. Tuy nhiên, các phương pháp chiết xuất hiện đại như chiết xuất bằng siêu âm, vi sóng, CO2 siêu tới hạn đang ngày càng được ưa chuộng. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của thực vật, nấm và hợp chất mục tiêu. Cần tối ưu hóa các thông số chiết xuất để thu được hiệu suất cao nhất. Theo tài liệu gốc, phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật ảnh hưởng lớn đến thành phần và hoạt tính sinh học của dịch chiết.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất Hợp Chất Từ Thực Vật

Quy trình chiết xuất hợp chất từ thực vật thường bao gồm các bước: thu hái mẫu, xử lý mẫu, chiết xuất, cô đặc, phân đoạn và tinh chế. Việc lựa chọn dung môi chiết xuất phù hợp là rất quan trọng. Các dung môi thường được sử dụng bao gồm: nước, ethanol, methanol, ethyl acetate, chloroform. Cần sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC) để phân đoạn và tinh chế các hợp chất. Theo tài liệu gốc, sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta bao gồm nhiều bước sắc ký khác nhau.

3.2. Phương Pháp Chiết Sinh Khối Nấm Nội Sinh Hiệu Quả

Chiết sinh khối nấm nội sinh đòi hỏi quy trình nuôi cấy và chiết xuất đặc biệt. Nấm nội sinh được nuôi cấy trên môi trường phù hợp, sau đó sinh khối được thu hoạch và chiết xuất bằng dung môi hữu cơ. Cần tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tăng sinh khối và sản lượng hợp chất mục tiêu. Các phương pháp chiết xuất tương tự như chiết xuất thực vật có thể được áp dụng. Theo tài liệu gốc, các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật cần được thực hiện cẩn thận để tránh nhiễm tạp.

IV. Ứng Dụng Hoạt Tính Sinh Học Trong Nông Nghiệp Bền Vững

Hoạt tính sinh học từ thực vật và nấm nội sinh có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp bền vững. Các hợp chất có hoạt tính trừ sâu, kháng nấm, kháng khuẩn có thể được sử dụng để thay thế thuốc BVTV hóa học. Các hợp chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng có thể được sử dụng để tăng năng suất cây trồng. Việc sử dụng các chế phẩm sinh học từ thực vật và nấm nội sinh giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe con người. Theo tài liệu gốc, xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học đang ngày càng được quan tâm.

4.1. Phát Triển Thuốc Trừ Sâu Sinh Học Từ Thực Vật

Nhiều loài thực vật chứa các hợp chất có hoạt tính trừ sâu tiềm năng. Các hợp chất này có thể tác động lên hệ thần kinh, hệ tiêu hóa hoặc quá trình sinh trưởng của côn trùng. Việc nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học từ thực vật giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Cần có quy trình đánh giá hiệu quả và an toàn của thuốc trừ sâu sinh học trước khi đưa vào sử dụng. Theo tài liệu gốc, thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu là một hướng đi đầy triển vọng.

4.2. Ứng Dụng Nấm Nội Sinh Trong Bảo Vệ Thực Vật

Nấm nội sinh có thể bảo vệ thực vật khỏi bệnh tật và côn trùng gây hại. Một số loài nấm nội sinh sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, giúp ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh. Một số loài nấm nội sinh có thể kích thích hệ miễn dịch của thực vật, giúp cây trồng chống chịu tốt hơn với các điều kiện bất lợi. Việc sử dụng nấm nội sinh trong bảo vệ thực vật là một giải pháp thân thiện với môi trường và bền vững. Theo tài liệu gốc, nấm nội sinh thực vật có triển vọng lớn trong việc tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Từ Ngâu Nghệ Trầu

Nghiên cứu đã phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất từ Ngâu ta, Nghệ vàng, Trầu không và nấm nội sinh của chúng. Kết quả cho thấy các loài thực vật này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa. Các nấm nội sinh cũng sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự. Nghiên cứu đã xác định được cấu trúc của một số hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp. Theo tài liệu gốc, nghiên cứu đã phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật.

5.1. Thành Phần Hóa Học Của Ngâu Ta Và Nấm Nội Sinh

Nghiên cứu đã xác định thành phần hóa học của cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) và nấm nội sinh của nó. Các hợp chất chính được phân lập từ Ngâu ta bao gồm các dẫn xuất của benzophenone, flavonoid và steroid. Nấm nội sinh từ Ngâu ta cũng sản sinh ra các hợp chất tương tự, cho thấy mối quan hệ cộng sinh giữa thực vật và nấm. Theo tài liệu gốc, thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A. oligophylla) đã được nghiên cứu.

5.2. Hoạt Tính Sinh Học Của Nghệ Vàng Và Nấm Nội Sinh

Nghệ vàng (Curcuma longa) nổi tiếng với hoạt chất curcumin có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, chống ung thư. Nghiên cứu đã phân lập và xác định các hợp chất khác từ Nghệ vàng, cũng như từ nấm nội sinh của nó. Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh và bảo vệ sức khỏe. Theo tài liệu gốc, thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) đã được nghiên cứu.

VI. Triển Vọng Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Thực Vật Tương Lai

Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ thực vật và nấm nội sinh vẫn còn nhiều tiềm năng chưa được khai thác. Cần tiếp tục tìm kiếm và phân lập các hợp chất mới có hoạt tính sinh học độc đáo. Việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của các hợp chất này là rất quan trọng. Cần có sự đầu tư vào công nghệ và trang thiết bị hiện đại để đẩy mạnh nghiên cứu. Việc hợp tác quốc tế và chia sẻ dữ liệu sẽ giúp tăng tốc quá trình khám phá và ứng dụng hoạt tính sinh học. Theo tài liệu gốc, cần hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm NSTV.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Về Biến Đổi Sinh Học Hợp Chất Tự Nhiên

Biến đổi sinh học (biotransformation) là một hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn. Bằng cách sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật, các hợp chất tự nhiên có thể được biến đổi thành các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn hoặc có độc tính thấp hơn. Biến đổi sinh học có thể giúp tạo ra các sản phẩm mới có giá trị cao trong y học và nông nghiệp. Theo tài liệu gốc, cần mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm nội sinh thực vật.

6.2. Phát Triển Sản Phẩm Tự Nhiên An Toàn Và Hiệu Quả

Mục tiêu cuối cùng của nghiên cứu hoạt tính sinh học là phát triển các sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả. Các sản phẩm này có thể được sử dụng trong y học, nông nghiệp, thực phẩm và mỹ phẩm. Cần có quy trình kiểm tra chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn và hiệu quả của sản phẩm. Việc quảng bá và thương mại hóa các sản phẩm tự nhiên cần được thực hiện một cách có trách nhiệm. Theo tài liệu gốc, cần tạo ra các sản phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm cao mới.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Nhu cầu nâng cao chất lượng nông sản và bảo vệ môi trường sinh thái đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc giảm thiểu sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học độc hại. Theo các số liệu được tác giả tổng hợp, côn trùng và nấm bệnh gây thiệt hại khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực toàn cầu hàng năm; riêng Viện Lúa quốc tế (IRRI) ước tính sâu bệnh làm thất thoát 37% sản lượng lúa thu hoạch. Mặc dù thuốc bảo vệ thực vật hóa học đóng góp lớn vào việc duy trì năng suất cây trồng, việc lạm dụng chúng đã dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng như ô nhiễm môi trường đất và nước, tích lũy dư lượng độc tính trong nông sản, tiêu diệt các loài thiên địch có ích và làm phát sinh hiện tượng kháng thuốc ở dịch hại.

Trước thực tế đó, xu hướng nghiên cứu các chế phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (bio-pesticides) từ thực vật và vi sinh vật ngày càng được chú trọng nhờ tính an toàn đối với con người, phổ tác động chọn lọc, khả năng phân hủy nhanh và ít gây áp lực kháng thuốc. Tuy nhiên, việc khai thác hoạt chất trực tiếp từ thực vật thường gặp trở ngại do nguồn sinh khối tự nhiên có hạn, nguy cơ làm cạn kiệt tài nguyên rừng và phụ thuộc vào mùa vụ. Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là việc tìm kiếm nguồn hoạt chất sinh học mới từ nấm nội sinh thực vật (endophytic fungi) – nhóm vi sinh vật sống trong các mô thực vật mà không gây triệu chứng bệnh cho cây chủ. Các nghiên cứu quốc tế chỉ ra rằng khoảng 51% hợp chất có hoạt tính phân lập từ nấm nội sinh là chất mới, đồng thời nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất tương tự cây chủ hoặc các chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học cao (kháng khuẩn, kháng nấm, trừ sâu). Tại Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm nội sinh trên các loài cây bản địa còn hạn chế, đặc biệt là hướng tiếp cận đối chiếu tương quan giữa hoạt chất của cây chủ và nấm nội sinh tương ứng.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là sàng lọc, phát hiện, chiết xuất, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ từ bốn loài thực vật và ba chủng nấm nội sinh phân lập từ các loài thực vật này, đồng thời thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm bệnh hại cây trồng của các phân đoạn dịch chiết và hợp chất sạch.

Nhiệm vụ nghiên cứu được văn bản xác định cụ thể gồm bốn nội dung:

1. Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây.
2. Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần.
3. Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và các hợp chất hữu cơ thành phần.
4. Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm nội sinh thực vật như một hướng đi để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học.

Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm:

• Bốn mẫu thực vật: Vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre, họ Meliaceae), lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq., họ Meliaceae), lá cây Trầu không (Piper betle L., họ Piperaceae), và củ rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L., họ Zingiberaceae).
• Ba chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ các cây trên: Chủng nấm nội sinh từ cây Ngâu ta (Microdiplodia hawaiiensis), chủng nấm nội sinh từ cây Nghệ vàng (Fusarium oxysporum), và chủng nấm nội sinh từ cây Trầu không (Fusarium solani). Bên cạnh đó, luận án còn khảo sát các chủng nấm phân lập khác như Trichoderma atroviride và Colletotrichum sp.
• Đối tượng thử nghiệm hoạt tính sinh học: Sâu khoang (Spodoptera litura) và nấm sợi gây bệnh thực vật Botrytis cinerea.

Phạm vi nghiên cứu:

• Không gian thu mẫu: Vườn quốc gia Cúc Phương (tỉnh Ninh Bình) đối với cây Ngâu ta và Gội ổi; Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh (tỉnh Vĩnh Phúc) đối với cây Trầu không và Nghệ vàng.
• Thời gian thu mẫu và thực hiện: Các mẫu thực vật được thu hái thực địa vào tháng 12 năm 2012; các thực nghiệm hóa học, sinh học phân tử và khảo nghiệm sinh học được hoàn thành và bảo vệ trong giai đoạn đến năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng thuật có hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến thuốc bảo vệ thực vật sinh học, nấm nội sinh và bốn loài thực vật nghiên cứu:

Về vai trò và hiện trạng thuốc bảo vệ thực vật:

• Tác giả dẫn số liệu của N. Kuznetsov về sự tồn tại của hơn 10.000 loài côn trùng có hại; các báo cáo của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) cho thấy mức tăng 1% sản lượng lương thực tương ứng với mức tăng 1,8% lượng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật.
• Dẫn chứng lịch sử về dịch hại kinh điển do nấm Fusarium cubense (gây bệnh Panama trên cây chuối) làm suy thoái nghiêm trọng ngành trồng chuối tại Mỹ Latinh vào đầu thế kỷ 20.
• Các hợp chất bảo vệ thực vật nguồn gốc thảo mộc thông dụng được điểm lại gồm: Pyrethrin (chiết xuất từ hoa Chrysanthemum leucanthemum), Rotenon và rotenoid (từ rễ cây Derris elliptica), Azadirachtin (từ cây neem Azadirachta indica), Matrine (từ cây khổ sâm), Artemisinin (từ Artemisia annua L.), Cnidiadin và Eucalyptol. Về thuốc trừ nấm thảo mộc, tác giả ghi nhận các hoạt chất như Acide acrylic, Acide ginkgoic, Eugenol (từ dầu đinh hương, quế, hương nhu) và hỗn hợp TP-Zep.
• Tại Việt Nam, theo số liệu Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2009, có 344 sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học được đăng ký lưu hành (221 thuốc trừ sâu, 66 thuốc trừ nấm), dù số lượng tăng gấp 150 lần so với năm 2000 nhưng doanh thu hàng năm chỉ chiếm dưới 5% tổng doanh thu thuốc bảo vệ thực vật. Một số chế phẩm thảo mộc lưu hành gồm VINEEM 1500 EC, Neemaza, Neemcide 3000 SP, Đầu trâu Bihopper và Olicide.

Về tình hình nghiên cứu nấm nội sinh trên thế giới:

• Sự kiện phát hiện nấm nội sinh Taxomyces andreanae từ cây Taxus brevifolia (thập niên 1990) có khả năng sinh tổng hợp paclitaxel (taxol). Tiếp theo là các nghiên cứu phát hiện taxol từ Pestalotiopsis microspora, Penicillium sp., Truncatella sp.
• Strobel và cộng sự (2000) phát hiện Streptomyces sp. NRRL 30562 từ cây Kennedia nigriscans sinh kháng sinh munumbicin; từ Grevillea pteridifolia sinh kakadumicin và echinomycin (kháng Plasmodium falciparum với giá trị LD50 = 7–10 ng/mL).
• Strobel và cộng sự (2003) nghiên cứu chủng Cryptosporiopsis quercina từ Tripterygium wilfordii sinh cryptocandin (kháng Candida albicans, Trichophyton sp., Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea) và cryptocin (kháng Pyricularia oryzae).
• Taechowisan và cộng sự (2003) công bố các chủng endophyte kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga.
• Raviraja (2005) phân lập 18 loài nấm nội sinh từ 5 loài cây thuốc ở Tây Ghats (Ấn Độ), bao gồm Curvularia clavata, C. pallescens, Fusarium oxysporum.
• Li và cộng sự (2007) tìm thấy nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrata có khả năng sinh huperzine A (ức chế acetylcholinesterase).
• Kusari và cộng sự (2009) phân lập Fusarium solani từ cây Camptotheca acuminata có khả năng sinh camptothecin cùng hai dẫn xuất 9-methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin.
• Agnes Joseph Aswathy và cộng sự (2012) phân lập vi khuẩn nội sinh Paenibacillus sp. từ thân rễ củ nghệ (Curcuma longa) có khả năng sản xuất Indole-3-acetic acid (xác định bằng HPLC).
• Cui và cộng sự (2012) phát hiện Fusarium oxysporum từ cây Ginkgo biloba sinh ginkgolid B.
• Lena Hammerschmidt và cộng sự (2014) thuộc Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại học Heinrich-Heine Duesseldorf, Đức) phối hợp nghiên cứu mẫu nấm nội ký sinh Acremonium strictum Gams từ cây Đước đôi (Rhizophora apiculata) tại Việt Nam, phân lập 5 dẫn xuất polyketide mới (60-hydroxypestalotiopsone C, acropyrone, bicytosporone D, waol acid, pestalotiopene C) và 7 hợp chất đã biết; trong đó có chất kháng Staphylococcus aureus với MIC 14,3 µM.
• Các dẫn chứng khác về nấm nội sinh: Bionectria ochroleuca sinh bionectriamides A–C; Fusarium incarnatum sinh equisetin; Alternaria sp. R6 sinh resverratrodehydes A và C; Penicillium chermesinum sinh dẫn xuất terphenyl ức chế α-glucosidase; Sporothrix sp. sinh Sporothrin A; Fusarium sp. DZ-27 sinh axit fusaric; Muscodor albus sinh chất bay hơi kháng nấm; nấm nội sinh từ Bontia daphnoides sinh hợp chất nodulisporic diệt ấu trùng ruồi.

Về nghiên cứu nấm nội sinh tại Việt Nam:

• Từ năm 1994, phân lập 6 chủng nấm từ vỏ cây thông đỏ, tiêu biểu là Pestalotiopsis maculans.
• Lê Mai Hương và cộng sự (2005) khảo sát 45 mẫu cây (Yên Tử, Hà Nội, Mê Linh), thu được 89 chủng nấm nội sinh (32 chủng có hoạt tính kháng sinh, chủng N2 kháng Bacillus subtilis và Fusarium oxysporum).
• Trần Thị Như Hằng và cộng sự (2009) nghiên cứu nấm Trichoderma konilangbra KS14 từ cây khổ sâm (Croton tonkinensis) và bùm bụp (Mallotus apelta), phân lập ergosterol, ergosterol peroxide và sorbicillin (kháng S. aureus với MIC 25 mg/mL).
• Phạm Quang Thu và cộng sự (2009) phân lập 8 chủng vi khuẩn và 13 chủng nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tượng tại Thừa Thiên Huế, ghi nhận khả năng ức chế nấm Ceratocystis sp. và Corticium salmonicolor.
• Nguyễn Đinh Nga và cộng sự (2010) sàng lọc nấm nội sinh trên ngũ sắc (Pseudeurotium NS-T1), mã đề (Fusarium MĐ-TR1, MĐ-TR3), tía tô (Trichoderma TT-L1) và trầu không (Fusarium TR-T1) có hoạt tính kháng C. albicans và MRSA.
• Nghiên cứu của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên (2010) phân lập nấm nội sinh (nhiều nhất ở lá với 50 chủng, thân 43 chủng), định danh Trichoderma aureoviride SHT06, Daldinia fissa SHT46 (chất SHT46.1 ức chế tế bào ung thư cơ vân IC50 4,19 µg/mL), Eupenicillium ehrlichii SHT101 (chất SHT101.1 kháng S. aureus MIC 25 µg/mL, chất SHT101.2 có IC50 4,0 và 3,06 µg/mL).
• Đàm Sao Mai và cộng sự (2014) tìm ra môi trường nuôi cấy Fusarium oxysporum từ Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại Lâm Đồng, thu nhận taxol với hàm lượng 250,98 mg/kg khối lượng khô.

Về bốn loài thực vật nghiên cứu:

• Aglaia duperreana: Bo-Jun Xie và cộng sự (2007) phân lập agladupol A–E; Heng Zhang và cộng sự (2012) phân lập 16 hợp chất từ cặn ethyl acetate, ghi nhận naringenin trimethyl ether có hoạt tính diệt ốc bươu vàng với LC50 3,9 µg/mL (cao hơn đối chứng saponin trà xanh có LC50 4,5 µg/mL).
• Aglaia oligophylla: Gerhard Bringmann và cộng sự (2003) phân lập 4 hợp chất dẫn xuất rocaglamide (trong đó có chất ức chế sâu Spodoptera littoralis với LC50 2,5 ppm); Nantiya Joycharat và cộng sự (2006) phân lập 10 hợp chất (dipterocarpol, ocotillone, cabraleone, ocotillol, rocaglaol, odorine...); các nghiên cứu khác tách được stigmasterol, β-sitosterol, oligophyllic acid, foveolin B.
• Piper betle: D. Pradhan và cộng sự (2013) tổng hợp thành phần lá trầu không gồm terpenoid (chavibetol, eugenol, carvacrol, safrole...), flavonoid (quercetin, luteolin), alkaloid (cepharadione A, aristololactame A-II), cùng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và bảo vệ tim mạch.
• Curcuma longa: Ting Yuan và cộng sự (2017) phân lập turmerone Q, bisacurone A, cyclocurcumin...; Kamran Ashraf và Sadia Sultan (2017) phân lập curcumin (IC50 41,69 µg/mL trên dòng HepG2), demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Triển khai chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (VAST) và Đại học Heinrich-Heine Duesseldorf (Đức), luận án kết hợp song song việc phân lập hóa thực vật truyền thống với phân lập, nuôi cấy và khai thác các hợp chất từ nấm nội sinh thực vật của các loài cây bản địa Việt Nam (A. duperreana, A. oligophylla, P. betle, C. longa), đồng thời khảo sát trực tiếp mối tương quan về chất và hoạt tính sinh học (trừ sâu khoang, kháng nấm bệnh) giữa cây chủ và nấm nội sinh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh lý học tương tác giữa nấm nội sinh và thực vật chủ (quan hệ cộng sinh/tương sinh, cân bằng hệ vi sinh, tổng hợp chất kháng dịch hại), nguyên lý hóa học các hợp chất thiên nhiên (chiết xuất phân đoạn, sắc ký tách chất, giải mã cấu trúc bằng phổ học) và phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học phòng trừ dịch hại nông nghiệp.

Mẫu thực vật và lưu trữ tiêu bản

Bốn mẫu thực vật được thu hái thực địa vào tháng 12 năm 2012, được định danh khoa học bởi chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - VAST), lập hồ sơ lưu trữ tiêu bản tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học (VAST):

Tên loài thực vật	Tên khoa học	Họ thực vật	Bộ phận thu hái	Địa điểm thu mẫu	Mã số tiêu bản
Ngâu ta	Aglaia duperreana Pierre	Meliaceae (Xoan)	Vỏ cây	VQG Cúc Phương, Ninh Bình	AD1212
Gội ổi	Aglaia oligophylla Miq.	Meliaceae (Xoan)	Lá cây	VQG Cúc Phương, Ninh Bình	AO1212
Trầu không	Piper betle L.	Piperaceae (Hồ tiêu)	Lá cây	Trạm ĐDSH Mê Linh, Vĩnh Phúc	PB1212
Nghệ vàng	Curcuma longa L.	Zingiberaceae (Gừng)	Củ rễ	Trạm ĐDSH Mê Linh, Vĩnh Phúc	CL1212

Phương pháp xử lý, chiết xuất và phân lập hợp chất

• Chiết xuất mẫu thực vật: Mẫu khô được băm nhỏ, ngâm chiết ba lần với methanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết gộp được cô quay cất đuổi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50 °C thu cặn cô methanol. Cặn này được phân tán vào nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), thu được các cặn chiết tương ứng.
• Chiết xuất sinh khối nấm nội sinh: Sau khi phân lập và định danh, các chủng nấm nội sinh được nuôi cấy quy mô lớn trên môi trường gạo xốp trong thời gian 35 ngày. Khi hệ sợi nấm phát triển kín môi trường, nấm được diệt bằng chiếu xạ tia cực tím (UV) trong tủ cấy vô trùng. Sinh khối được ngâm chiết trong dung môi hữu cơ ba lần (mỗi lần khoảng 12 giờ), lọc qua giấy lọc, cô quay thu cặn chiết thô, sau đó chiết phân lớp với n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước.
• Kỹ thuật phân lập sắc ký:
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và RP-18 F254S (độ dày 0,25 mm, Merck). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365/366 nm, hoặc phun thuốc thử Anisaldehyde/H2SO4 (5 mL anisaldehyde, 100 mL acid acetic băng, 85 mL methanol, 5 mL acid sulfuric đậm đặc) rồi nung nóng ở 110 °C.
  • Sắc ký cột thường (CC): Dùng pha tĩnh silica gel 60, cỡ hạt 0,040–0,063 mm (230–400 mesh, Merck).
  • Sắc ký cột rây phân tử: Dùng gel Sephadex LH-20 (Merck).
  • Sắc ký cột pha đảo: Dùng chất hấp phụ YMC RP-18, kích thước hạt 30–50 µm (Fujisilica Chemical Ltd.).
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (HPLC-Preparative): Cột nhồi sẵn Eurospher C-18 (125 × 4 mm) hoặc Dynmax (250 × 21,4 mm), rửa giải bằng hệ dung môi methanol hoặc acetonitrile phối hợp nước siêu lọc (nanopure) chứa 0,1% TFA hoặc không đệm, tốc độ dòng 5 mL/phút, đầu dò mảng diode (UV-VIS Diode Array Detector).
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích (HPLC): Sử dụng hệ gradient MeOH : Nước (nanopure) đệm acid phosphoric (pH = 2), tăng dần nồng độ MeOH lên 100% trong 45 phút, phát hiện bằng UV-VIS Diode Array Detector.

Phương pháp định danh sinh học phân tử chủng nấm

• Tách chiết ADN tổng số: Áp dụng phương pháp CTAB theo J. Doyle (1987).
• Phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS: Thể tích phản ứng 20 µL gồm đệm 2 mM MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (Thermo Scientific), 0,2 µM cặp mồi chuyên biệt ITS1/ITS4 và khoảng 30 ng khuôn mẫu ADN. Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu ở 94 °C trong 5 phút; 35 chu kỳ tiếp nối gồm [94 °C trong 1 phút, 59 °C trong 45 giây, 72 °C trong 50 giây]; giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72 °C trong 5 phút.
• Điện di và thôi gel: Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, xuất hiện băng đơn hình kích thước khoảng 750 bp. Đoạn gel chứa ADN được cắt và tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Spin Columns (Qiagen).
• Giải trình tự và phân tích: Trình tự vùng gen ITS được giải mã tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội). Dữ liệu được đối chiếu độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI, sau đó xử lý bằng phần mềm MEGA phiên bản 6.02 để thiết lập cây phát sinh loài.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

• Điểm nóng chảy (mp): Đo trên thiết bị Kofler micro-hotstage tại Viện Hóa học (VAST).
• Phổ khối lượng: Phổ ESI-MS đo trên hệ thống Agilent 1200 TRAP; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS dùng xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Ghi nhận phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) trên các dung môi thích hợp (như CDCl3, DMSO-d6) có sử dụng chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).
• Phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) dùng để định danh các thành phần bay hơi.

Phương pháp khảo nghiệm hoạt tính sinh học

• Thử nghiệm trừ sâu trong phòng thí nghiệm: Đánh giá hiệu lực gây độc đối với ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura) bằng phương pháp cho ăn hoặc tiếp xúc đối với các dịch chiết tổng và phân đoạn.
• Thử nghiệm kháng nấm hại thực vật: Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm và đường kính tản nấm của chủng sợi gây bệnh Botrytis cinerea trên đĩa thạch trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan nghiên cứu

Chương 1 trình bày cơ sở lý luận và tổng thuật tư liệu về ba nội dung chính:

1. Thiệt hại nông nghiệp do sâu bệnh và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật; phân tích các giới hạn của thuốc hóa học (tồn dư, độc hại, gây kháng thuốc) và xu thế tất yếu của việc phát triển thuốc sinh học (bio-pesticides) với các nhóm hoạt chất từ thảo mộc (pyrethrin, rotenoid, azadirachtin, matrine...).
2. Khái niệm, tiềm năng sinh học và dược lý của nấm nội sinh thực vật; tổng kết lịch sử nghiên cứu quốc tế từ phát hiện taxol đến các chất biến dưỡng thứ cấp mới có hoạt tính kháng sinh, độc tế bào và diệt côn trùng; điểm lại các kết quả nghiên cứu nấm nội sinh tại Việt Nam trên cây thông đỏ, keo tai tượng, ngũ sắc, mã đề, trầu không và cây rừng ngập mặn.
3. Đặc điểm thực vật học, phân bố, công dụng dân gian và thành phần hóa học đã công bố của bốn loài đối tượng: Ngâu ta (A. duperreana), Gội ổi (A. oligophylla), Trầu không (P. betle) và Nghệ vàng (C. longa).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm từ khâu thu thập mẫu đến phân tích cấu trúc và khảo nghiệm hoạt tính:

• Cung cấp địa điểm, tọa độ, thời gian thu hái thực địa (tháng 12/2012) tại Cúc Phương và Mê Linh cùng mã số tiêu bản lưu trữ của bốn loài cây.
• Trình bày quy trình phân lập nấm nội sinh từ mô lá, vỏ, củ của cây chủ trên môi trường PDA và MEA; quy trình nhân nuôi sinh khối trên môi trường gạo trong 35 ngày; phương pháp chiếu tia UV vô hoạt nấm trước khi chiết.
• Mô tả chi tiết kỹ thuật tách chiết ADN bằng CTAB (J. Doyle, 1987), chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 (khuếch đại đoạn gen ~750 bp), quy trình thôi gel bằng kit QIAquick và phân tích phát sinh loài bằng phần mềm MEGA v6.02.
• Trình bày quy trình chiết xuất ngâm siêu âm methanol, phân bố lỏng - lỏng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần; các hệ sắc ký TLC, CC, Sephadex LH-20, RP-18 và HPLC-Preparative (cột Eurospher C-18 và Dynmax).
• Hệ thống hóa toàn bộ quy trình thực nghiệm bằng 7 sơ đồ tách chiết (Sơ đồ 3.1 đến 3.7 trong văn bản): Chiết tách từ vỏ Ngâu ta (Sơ đồ 3.1), lá Gội ổi (Sơ đồ 3.2), củ Nghệ vàng (Sơ đồ 3.3), lá Trầu không (Sơ đồ 3.4), nấm nội sinh cây Ngâu (Sơ đồ 3.5), nấm nội sinh cây Nghệ vàng (Sơ đồ 3.6) và nấm nội sinh cây Trầu không (Sơ đồ 3.7).
• Chi tiết hóa các phương pháp đo điểm nóng chảy Kofler, ghi phổ Agilent 1200 TRAP ESI-MS, HR-ESI-MS, NMR (1D và 2D), IR, GC-MS và phương pháp bố trí thử nghiệm sinh học đối với Spodoptera litura và Botrytis cinerea.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

(Lưu ý: Trong mục lục văn bản, chương này mang tiêu đề KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN, được chia thành các mục 4.1, 4.2, 4.3, 4.4)

1. Phân lập và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật (Mục 4.1):

   • Phân lập thành công nhiều chủng nấm nội sinh từ các bộ phận thực vật nghiên cứu.
   • Quan sát hình thái học khuẩn lạc và cuống sinh bào tử kết hợp giải trình tự vùng gen ITS (~750 bp) và phân tích cây phát sinh chủng loại đã định danh chính xác các chủng: Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Trichoderma atroviride, Microdiplodia hawaiiensis, Colletotrichum sp. (Hình 3.1 đến 3.10 trong văn bản).

2. Khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm (Mục 4.2):

   • Hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptera litura): Thể hiện qua kết quả khảo nghiệm các mẫu dịch chiết cây Ngâu (Bảng 4.1).
   • Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea: Đánh giá trên các mẫu dịch chiết tổng thực vật (Bảng 4.2), dịch chiết các chủng nấm nội sinh thực vật (Bảng 4.4), các cặn chiết phân đoạn của nấm Fusarium (Bảng 4.3 và Hình 3.14), cũng như tinh chất curcumin phân lập từ Nghệ vàng (Hình 3.13). Các số liệu chứng minh hiệu lực kìm hãm sự phát triển của nấm kiểm chứng ở các nồng độ thử nghiệm khác nhau.

3. Nghiên cứu thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh (Mục 4.3):

   • Thành phần hóa học cây Ngâu (A. duperreana) và Gội ổi (A. oligophylla): Phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất sạch, trong đó dữ liệu phổ NMR của hợp chất số 7 được đo trong dung môi CDCl3 (Bảng 4.5).
   • Thành phần hóa học cây Nghệ vàng (Curcuma longa): Thu nhận và kiểm tra hoạt tính kháng nấm của curcumin.
   • Thành phần hóa học cây Trầu không (Piper betle): Phân lập các hợp chất sạch, cung cấp dữ kiện phổ NMR chi tiết của hợp chất 13 và 14 (Bảng 4.6); xác định thành phần của 12 hợp chất (từ chất 15 đến chất 26) bằng phổ sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Bảng 4.7 và Hình 3.15).
   • Thành phần hóa học nấm nội sinh Microdiplodia hawaiiensis từ cây Ngâu: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất tinh khiết, lập bảng dữ liệu phổ NMR cho hợp chất 28 và 29 (Bảng 4.8).
   • Thành phần hóa học nấm nội sinh Fusarium oxysporum từ cây Nghệ vàng: Thu nhận hợp chất sạch số 30, xác định cấu trúc dựa trên số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (Bảng 4.9).
   • Thành phần hóa học nấm nội sinh Fusarium solani từ cây Trầu không: Thu nhận hợp chất sạch số 31, lập bảng dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (Bảng 4.10).

Đối tượng nghiên cứu	Loại mẫu phân tích	Ký hiệu hợp chất công bố trong văn bản	Phương pháp phân tích cấu trúc chính
Cây Ngâu ta (A. duperreana)	Chiết xuất vỏ cây	Hợp chất 7	Phổ NMR (CDCl3)
Cây Trầu không (P. betle)	Chiết xuất lá cây	Hợp chất 13, 14	Phổ NMR
Cây Trầu không (P. betle)	Thành phần bay hơi lá	Hợp chất 15 đến 26	Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)
Nấm NSTV cây Ngâu (M. hawaiiensis)	Dịch chiết sinh khối	Hợp chất 28, 29	Phổ NMR
Nấm NSTV Nghệ vàng (F. oxysporum)	Dịch chiết sinh khối	Hợp chất 30	Phổ 1H-NMR và 13C-NMR
Nấm NSTV Trầu không (F. solani)	Dịch chiết sinh khối	Hợp chất 31	Phổ 1H-NMR và 13C-NMR

4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên và hoạt tính sinh học (Mục 4.4):
   • So sánh, đối chiếu hệ hợp chất tự nhiên và hoạt tính sinh học giữa cây Ngâu và chủng nấm nội sinh M. hawaiiensis.
   • Đối chiếu thành phần hóa học và hoạt tính kháng nấm giữa củ Nghệ vàng và chủng nấm nội sinh F. oxysporum.
   • Đánh giá mối tương quan về chất và hiệu lực sinh học giữa lá Trầu không và chủng nấm nội sinh F. solani.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới của luận án:

• Về khoa học và lý luận:
  • Phân lập và định danh dựa trên đặc điểm hình thái kết hợp chỉ thị sinh học phân tử vùng gen ITS các chủng nấm nội sinh từ bốn loài thực vật nghiên cứu tại Việt Nam (Microdiplodia hawaiiensis, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Trichoderma atroviride...).
  • Làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và nấm nội sinh thực vật bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (NMR 1D, 2D, HR-ESI-MS, GC-MS), bao gồm việc xác định cấu trúc các chất ký hiệu 7, 13, 14, cụm chất bay hơi 15–26, và các chất chuyển hóa từ nấm nội sinh gồm 28, 29, 30, 31.
  • Phân tích mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên và hoạt tính sinh thái (trừ sâu khoang Spodoptera litura, kháng nấm Botrytis cinerea) giữa ba cặp đối tượng: Cây Ngâu ta – nấm M. hawaiiensis; cây Nghệ vàng – nấm F. oxysporum; cây Trầu không – nấm F. solani.
• Về thực tiễn và giải pháp kỹ thuật:
  • Hoàn thiện quy trình phân lập, nuôi cấy nhân sinh khối nấm nội sinh thực vật trên môi trường gạo xốp trong 35 ngày để khai thác hoạt chất sinh học mà không cần phá hủy hay khai thác quá mức cây chủ trong tự nhiên.
  • Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về độc tính trừ sâu khoang và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật Botrytis cinerea của các dịch chiết và hợp chất sạch, phục vụ định hướng nghiên cứu sản xuất chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:

  • Mẫu thực vật thu hái tập trung tại hai địa điểm (VQG Cúc Phương và Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh) tại một thời điểm (tháng 12/2012), chưa phản ánh biến thiên thành phần hóa học và quần xã nấm nội sinh theo các mùa trong năm hoặc các vùng sinh thái khác nhau.
  • Các thử nghiệm sinh học đối với sâu khoang (Spodoptera litura) và nấm bệnh (Botrytis cinerea) mới được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm (in vitro), chưa tiến hành khảo nghiệm thực địa trên đồng ruộng.
  • Luận án mới tập trung giải mã cấu trúc sâu cho ba chủng nấm nội sinh chủ đạo (M. hawaiiensis, F. oxysporum, F. solani); các chủng nấm phân lập khác mới dừng lại ở bước định danh hoặc sàng lọc sơ bộ.

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men sinh khối nấm nội sinh ở quy mô lớn hơn (pilot) nhằm nâng cao hàm lượng các hoạt chất mong muốn.
  • Mở rộng khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng bệnh trên nhiều đối tượng côn trùng và nấm bệnh hại cây trồng khác trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng.
  • Đi sâu nghiên cứu cơ chế di truyền và con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở nấm nội sinh trong mối quan hệ tương tác với tế bào cây chủ.

Giá trị tham khảo

Luận án cung cấp tài liệu tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Hóa học hữu cơ: Tham khảo quy trình phân lập sắc ký (TLC, CC, Sephadex LH-20, RP-18, HPLC-Prep) và bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), phổ GC-MS của các hợp chất tự nhiên phân lập từ cây Ngâu, Gội ổi, Trầu không, Nghệ vàng và nấm nội sinh.
• Các nhà nghiên cứu thuộc lĩnh vực Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học: Tham khảo kỹ thuật phân lập nấm nội sinh từ các mô thực vật khác nhau, quy trình nuôi cấy sinh khối trên môi trường gạo xốp, cũng như phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB và giải trình tự gen vùng ITS để định danh nấm sợi.
• Cán bộ nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất chế phẩm Bảo vệ thực vật: Tham khảo phương pháp sàng lọc hoạt tính trừ sâu khoang và kháng nấm Botrytis cinerea trong phòng thí nghiệm; tiếp cận nguồn dữ liệu về các phân đoạn chiết có hoạt tính cao làm tiền đề cho việc phối chế thuốc bảo vệ thực vật sinh học thảo mộc và vi sinh.

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn loài thực vật trong luận án được thu hái tại những địa điểm nào và định danh bởi ai? Cả bốn mẫu thực vật đều được thu hái vào tháng 12 năm 2012 và do chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - VAST) xác định tên khoa học: Vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) và lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) thu hái tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình); lá cây Trầu không (Piper betle) và củ Nghệ vàng (Curcuma longa) thu hái tại Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh Phúc).

2. Quy trình định danh sinh học phân tử các chủng nấm nội sinh trong luận án sử dụng kỹ thuật và phần mềm nào? Quy trình định danh nấm sử dụng phương pháp tách ADN tổng số bằng CTAB theo J. Doyle (1987), thực hiện phản ứng PCR nhân bản vùng gen ITS với cặp mồi ITS1/ITS4 tạo đoạn khuếch đại khoảng 750 bp, tinh sạch bằng kit QIAquick Spin Columns (Qiagen). Trình tự gen được đọc tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (ĐHQGHN), so sánh qua BLAST trên NCBI và dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA phiên bản 6.02.

3. Sinh khối nấm nội sinh được nuôi cấy trên môi trường nào và trong thời gian bao lâu trước khi chiết xuất? Các chủng nấm nội sinh sau khi định danh được nuôi cấy nhân sinh khối lớn trên môi trường gạo xốp trong thời gian 35 ngày cho đến khi sợi nấm phát triển kín môi trường, sau đó được vô hoạt bằng tia tử ngoại (UV) trong tủ cấy vô trùng trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ.

4. Hoạt tính sinh học của các dịch chiết và chất sạch được khảo nghiệm trên những sinh vật đích nào? Hoạt tính sinh học được khảo nghiệm trong phòng thí nghiệm trên hai đối tượng dịch hại thực vật: Hiệu lực trừ sâu được thử nghiệm trên sâu khoang (Spodoptera litura); hiệu lực kháng nấm bệnh được thử nghiệm trên chủng nấm sợi hại thực vật Botrytis cinerea.

5. Ba chủng nấm nội sinh chủ đạo được phân lập từ những cây chủ nào và các hợp chất tiêu biểu được xác định cấu trúc là gì? Ba chủng nấm nội sinh gồm: Chủng Microdiplodia hawaiiensis phân lập từ cây Ngâu ta (xác định cấu trúc hợp chất 28 và 29); chủng Fusarium oxysporum phân lập từ cây Nghệ vàng (xác định cấu trúc hợp chất 30); và chủng Fusarium solani phân lập từ cây Trầu không (xác định cấu trúc hợp chất 31).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Hiếu đã thực hiện khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bốn loài thực vật bản địa (Aglaia duperreana, Aglaia oligophylla, Piper betle, Curcuma longa) cùng các chủng nấm nội sinh phân lập từ chúng. Bằng sự kết hợp giữa các kỹ thuật sắc ký phân tách, phương pháp phổ nghiệm cấu trúc hiện đại (NMR, MS, GC-MS) và sinh học phân tử (phân tích trình tự vùng ITS), tác giả đã định danh được các chủng nấm (M. hawaiiensis, F. oxysporum, F. solani...) và xác định cấu trúc của nhiều hợp chất tự nhiên. Các kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptera litura) và kháng nấm sợi (Botrytis cinerea) đã làm sáng tỏ mối tương quan về chất và hoạt tính giữa thực vật chủ và vi sinh vật nội sinh. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm cho hướng nghiên cứu khai thác nấm nội sinh thực vật nhằm tìm kiếm hoạt chất bảo vệ thực vật sinh học tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chất lượng cuộc sống của con người ngày càng nâng cao, đòi hỏi các sản phẩm nông nghiệp và môi trường an toàn. Tuy nhiên để giữ vững năng suất, chất lượng nông sản, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, người ta lại phải sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, chủ yếu là các loại thuốc hóa học độc hại, và cứ như vậy vòng luẩn quẩn tăng sản lượng, tăng đầu vào, nguy cơ sản phẩm không an toàn và ô nhiễm môi trường lại tiếp tục diễn ra. Vì vậy việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản phẩm nông nghiệp dễ sử dụng hơn, có hiệu lực trừ dịch hại cao hơn và thân thiện hơn với môi sinh và môi trường đang được đặt ra với toàn thể nhân loại chúng ta. Từ những thập niên cuối của thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI, các biện pháp sinh học (biological control) bảo vệ sản xuất nông nghiệp ngày càng phát huy tác dụng và dần được xác định là hướng biện pháp chủ đạo trong quản lý dịch hại tổng hợp trong thời gian tới.

Ưu điểm nổi bật nhất của các biện pháp sinh học (ví dụ, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học) là hầu như không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, ít gây tình trạng bùng phát dịch hại. Bên cạnh đó, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (thuốc BVTVSH, bio-pesticide) còn mau phân hủy trong tự nhiên, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao và thời gian bảo quản, sử dụng ngắn như các loại rau củ, hoa quả… Thêm nữa, các nguyên liệu để tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc. Chi phí sản xuất thuốc BVTVSH thấp hơn so với thuốc BVTV hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Với những lợi ích mang lại, thuốc BVTVSH sẽ giúp người nông dân “thân thiện” hơn với cánh đồng của mình để có thể thụ hưởng lợi ích kinh tế lâu dài từ chính “người bạn” này.

1 Nấm nội sinh thực vật (nấm NSTV, Plant endophytic fungi) là những vi sinh vật sống trong tế bào thực vật mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào tới cây chủ. Nấm NSTV cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones, tổng hợp siderophores, cố định đạm hay qua hỗ trợ phytoremediation. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh. Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều hoạt chất được sinh ra từ nấm NSTV cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật.

Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng các hoạt chất quý giá này do chính cây sản xuất, do nấm NSTV sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm NSTV có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của nấm NSTV không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người và động vật. Vì vậy, nấm NSTV hiện đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô cùng to lớn của nấm NSTV.

Các hợp chất do nấm NSTV sản sinh ra là con đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế, nông nghiệp vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc (xanthones, anthraquinones, pestalotheols, octadrides, dihydroxyanthones, pyrenocine, steroids.) với rất nhiều hoạt tính mới [2,3]. Điều quan trọng nữa là nếu có thể khai thác được nguồn nguyên liệu từ nấm NSTV sẽ tránh được việc khai thác cạn kiệt nguồn 2 tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài thực vật quý hiếm, gây hậu quả xấu tới môi trường tự nhiên. Việt Nam vẫn nổi tiếng thế giới về tiềm năng đa dạng sinh học cac loài thực vật, với trên 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể các loài nấm, tảo, rêu. rất nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam.

Những công bố liên tục trong những năm gần đây của các đoàn khảo sát, chuyên gia Việt Nam và quốc tế về việc phát hiện các loài động thực vật mới tại Việt Nam càng khẳng định giá trị tiềm ẩn vô tận của nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá này. Từ kho tàng kinh nghiệm dân gian, chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm trong việc nghiên cứu, tìm tòi, phát hiện và kết hợp tài tình các nguyên liệu thực vật đa dạng thành các bài thuốc dân gian hết sức quý giá, vô cùng đặc sắc, có hiệu quả đặc biệt trong việc chữa bệnh, năng cao sức khỏe con người, bảo vệ mùa màng, diệt trừ sâu bệnh, côn trùng, động vật gây hại. Với trình độ phát triển khoa học công nghệ hiện nay, cần thiết phải tiếp tục tim tòi, nghiên cứu, chọn lọc kinh nghiệm dân gian, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên kết hợp với sự hỗ trợ của công nghệ, thiết bị hiện đại để tạo ra các sản phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm cao mới, có giá trị hơn, hiệu quả hơn, được đánh giá cao cả về hàm lượng khoa học công nghệ cũng như giá trị sử dụng. Triển khai tiếp chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại học Tổng hợp Heirich-Heine Duesseldorf, CHLB Đức) về việc nghiên cứu hệ thực vật Việt Nam để sàng lọc, phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, có tiềm năng sử dụng để chế tạo chế phẩm trừ sâu và nấm bệnh hại cây trồng, cũng như mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm nội sinh thực vật, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật” trên 3 bốn (04) loài thực vật Việt Nam bao gồm Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.), Nghệ vàng (Curcuma longa L.) và ba (03) chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Ngâu ta, nghệ vàng và trầu không.

Đề tài nghiên cứu có tính khoa học, tính thực tiễn và tính thời sự, được thực hiện với mục tiêu là sàng lọc, phát hiện, chiết xuất, xác định cấu trúc các chất có tiềm năng sử dụng làm thuốc trừ sâu và nấm bệnh hại cây. Các nội dung nghiên cứu của Luận án bao gồm: - Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây. - Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần. - Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và cachợp chất hữu cơ thành phần.

- Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm NSTV như là một hướng đi mới nhanh hơn và hiệu quả hơn, một nguồn tài nguyên vô tận mới để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có giá trị cao tại Việt Nam. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật Theo nghiên cứu của nhà côn trùng học Xô viết N.000 loài côn trùng có hại cho con người, động vật và thực vật. Số lượng chủng vi sinh vật (nấm bệnh) có hại cũng không ít hơn.

Các số liệu thống kê cho thấy côn trùng và vi sinh vật có hại đã gây thiệt hại rất lớn cho sản xuất nông nghiệp, với ước tính khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực toàn cầu đã bị mất hàng năm do côn trùng và nấm bệnh, và thực tế nếu côn trùng và nấm bệnh gây hại đã không được nghiên cứu và khống chế một cách hệ thống thì mức độ thiệt hại còn lớn hơn rất nhiều (ước tính tới 37% tổng sản lượn khoai tây, 22% tổng sản lượng cải bắp, 10% tổng sản lượng táo và 9% sản lượng tổng đào quả toàn cầu sẽ bị hư hại) [1]. Tại Trung quốc, có 1.648 loại tác nhân có hại cho mùa màng, trong đó có 724 loại nhân tố thực vật có hại, 838 loại côn trùng, mối mọt, 64 loại cỏ dại và 22 loài gặm nhấm. Nếu không sử dụng thuốc BVTV, tổng sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc sẽ bị mất tương ứng lần lượt là 78%, 54% và 32%. Sử dụng thuốc BVTV tại Trung Quốc đã góp phần giúp nước này thu được thêm 89,44 triệu tấn ngũ cốc, 1,65 triệu tấn bông, 2,53 triệu tấn hạt lấy dầu và 78 triệu tấn rau màu [2].

Theo đánh giá của Viện Lúa quốc tế (IRRI), côn trùng và nấm bệnh gây thiệt hại khoảng 37% tổng sản lượng lúa thu hoạch hàng năm trên toàn cầu. Một trong những trường hợp nấm gây bênh nổi tiếng nhất, thiệt hại nghiêm trọng nhất trong lịch sử trồng trợt thế giới là bệnh Panama do chủng nấm Fusarium cubense gây ra trên cây chuối. Bệnh Panama đã gần như xóa sổ ngành nông nghiệp trồng chuối tại Châu Mỹ La tinh những năm đầu thế kỷ 20. Những căn bệnh mới do nấm gây ra tiếp tục đe dọa xóa sổ ngành công nghiệp trồng chuối trị giá 11 tỷ USD trên toàn cầu [3].

5 Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã tạo thêm được 1/3 tổng sản lượng nông sản toàn cầu. Nếu không có thuốc BVTV, sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc toàn cầu có thể bị thiệt hại tới 78%, 54% và 32% [4]. Tại Mỹ, cứ 1 USD bỏ ra cho thuốc BVTV sẽ thu về 4 USD sản lượng thu hoạch.