MỞ ĐẦU Viêm đƣờng hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên vi rút là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các nƣớc đang phát triển. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 4,5 triệu trẻ em dƣới 5 tuổi tử vong hàng năm do VĐHHC và do căn nguyên vi rút chiếm 40% trong tổng số đó [69]. Các tác nhân vi rút thƣờng gặp nhƣ vi rút cúm mùa (Influenzavirus), vi rút hợp bào đƣờng hô hấp (RSV), vi rút á cúm (Parainfluenzavirus) đã đƣợc ghi nhận. Bên cạnh đó sự xuất hiện của các tác nhân vi rút mới nhƣ vi rút cúm A/H5N1 (1997), metapneumovirus (hMPV) (2001), SARS-CoV (2003), cúm A/H1N1 đại dịch (2009), vi rút MERS-CoV (tháng 9/2012) và gần đây nhất là vi rút cúm A/H7N9 lây từ gia cầm sang ngƣời tại Trung Quốc (4/2013)…[31, 142] đã làm tăng mối quan ngại cho sức khỏe cộng đồng, đặc biệt đối với trẻ em và ngƣời già (>65 tuổi).
Trong khi đó, thuốc kháng vi rút dùng trong điều trị đặc hiệu là hạn chế, vắc xin dự phòng của nhiều tác nhân vẫn còn trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển. Vi rút gây VĐHHC thƣờng mang tính chất mùa tại các nƣớc có khí hậu ôn đới, trong khi Việt Nam là nƣớc nhiệt đới, có sự khác biệt rõ rệt của khí hậu tại 2 khu vực miền Bắc và miền Nam. Do phần lớn các tác nhân vi rút gây bệnh VĐHHC có sự đa dạng di truyền và đặc tính kháng nguyên nên việc nghiên cứu để lựa chọn vi rút phát triển vắc xin phòng bệnh có tính ổn định cao và đại diện cho quần thể vi rút lƣu hành là cần thiết. Các nghiên cứu trƣớc đây về vi rút VĐHHC đã có tại Việt Nam sử dụng phƣơng pháp phân lập vi rút trên tế bào cảm thụ hoặc phƣơng pháp PCR thông thƣờng nên chƣa mang tính đồng bộ, chƣa phản ánh đƣợc đầy đủ tỷ lệ lƣu hành và đặc điểm của các loại vi rút gây VĐHHC.
Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực Y-Sinh học tại Việt Nam những năm gần đây, kỹ thuật Realtime RT-PCR đã đƣợc triển 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khai nhằm phát hiện toàn bộ các tác nhân vi rút gây VĐHHC với độ chính xác cao trong thời gian ngắn giúp cho các bác sĩ lâm sàng có định hƣớng điều trị hiệu quả. Tuy nhiên, thông tin về vai trò, đặc điểm vi rút học của các tác nhân vi rút gây VĐHHC tại Việt Nam còn hạn chế. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên của một số tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp trên bệnh nhân tại bệnh viện ở miền Bắc Việt Nam, 2013-2016‖ với mục tiêu: 1. Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR.
Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên một số tác nhân vi rút chủ yếu gây viêm đƣờng hô hấp cấp trong giai đoạn nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu Gồm 2 nội dung chính: Nội dung 1: Xác định các tác nhân vi rút gây VĐHHC bằng phương pháp Realtime RT-PCR - Mẫu bệnh phẩm (dịch họng, dịch nội khí quản) của bệnh nhân VĐHHC điều trị chủ yếu ở các Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Nhi Trung ƣơng, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ƣơng, Bệnh viện Lao phổi Trung ƣơng, Bệnh viện Saint-Paul… thuộc khu vực miền Bắc Việt Nam. - Xác định 12 tác nhân vi rút bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại Trung tâm Cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng. Nội dung 2: Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên một số tác nhân vi rút chủ yếu gây viêm đường hô hấp cấp trong giai đoạn nghiên cứu.
- Phân lập các mẫu bệnh phẩm đƣợc xác định dƣơng tính với các tác nhân vi rút cúm, RSV, hMPV.trên tế bào cảm thụ (MDCK, Vero, LLC/MK, Hep 2…) - Xác định hình thái tế bào bị huỷ hoại bởi các tác nhân vi rút hô hấp 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com RSV, hMPV, Adeno… - Khuếch đại chủng vi rút, giải trình tự nucleotide một số mẫu đại diện theo thời gian của vi rút cúm. - So sánh phân đoạn gen HA và NA với các vi rút cúm lƣu hành tại một số nƣớc khác trong khu vực và trên thế giới; xây dựng cây gia hệ. - Nghiên cứu giám sát hiệu quả cho việc phát hiện các chủng vi rút nguy hiểm mới từ các hiện tƣợng đột biến hoặc trao đổi tích hợp gen và có thể là về nguy cơ xuất hiện dịch cũng nhƣ mức độ lan rộng của dịch. Tính mới, ý nghĩa khoa học và sự cần thiết của vấn đề cần nghiên cứu.
- Là công trình nghiên cứu giám sát một cách toàn diện 12 tác nhân vi rút hô hấp phổ biến gây VĐHHC tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2013-2016 bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR, đã cung cấp các thông tin cập nhật về sự lƣu hành các vi rút gây VĐHHC tại miền Bắc Việt Nam, bổ sung vào các thông tin chung tại khu vực và trên hệ thống giám sát toàn cầu. - Là công trình công bố các kết quả nghiên cứu về đặc tính vi rút học của chủng vi rút A/H1N1pdm09, A/H3N2 và B trong giai đoạn nghiên cứu (2013- 2016) một cách đầy đủ. - Đây là thông báo đầu tiên về nhiễm hMPV trong mẫu bệnh phẩm thu thập tại đối tƣợng ngƣời lớn (19-59 tuổi) tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm thông tin vào các nghiên cứu trên thế giới về gánh nặng bệnh tật của nhiễm hMPV, góp phần thúc đẩy phát triển vắc xin phòng chống hMPV trong tƣơng lai.
Nghiên cứu là một trong những hoạt động không những cung cấp các kết quả khoa học, mà còn góp phần trong công tác đảm bảo sức khoẻ cộng đồng cho nhân dân Việt Nam. Điều lệ Y tế quốc tế (IHR-2005) đã đƣợc 194 quốc gia và vùng lãnh thổ cam kết thực hiện, Việt Nam cũng là một thành viên thành viên đã và đang triển khai thực hiện chƣơng trình An ninh Y tế 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com toàn cầu (GHS) với sự hỗ trợ của TCYTTG (WHO) và Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Mỹ (CDC). 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP VÀ ĐẶC ĐIỂM VI RÖT HỌC CỦA CÁC TÁC NHÂN VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP THƢỜNG GẶP Viêm đƣờng hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên vi rút là nguyên nhân chính của tỷ lệ mắc, nhập viện, tử vong trong các bệnh lý đƣờng hô hấp trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt tại các nƣớc đang phát triển. VĐHHC thƣờng gây bệnh nặng cho trẻ em (<5 tuổi) và ngƣời già (>65 tuổi), tuỳ thuộc vị trí địa lý, điều kiện khí hậu, căn nguyên vi rút gây viêm đƣờng hô hấp khác nhau trong từng quốc gia. Tuy nhiên, các vi rút thƣờng gặp tại các bệnh nhân nằm viện đƣợc ghi nhận từ 5 họ: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae và Adenoviridae. Mỗi loại vi rút có thể chịu trách nhiệm cho các hội chứng/ triệu chứng lâm sàng khác nhau phụ thuộc vào lứa tuổi, hệ miễn dịch của từng cá thể.
Ngƣợc lại, mỗi triệu chứng/ hội chứng viêm đƣờng hô hấp cấp có thể gây nên bởi nhiều tác nhân vi rút khác nhau [64]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các vi rút thuộc 4 họ: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae và Adenoviridae. VĐHHC thƣờng biểu hiện tại đƣờng hô hấp trên hoặc đƣờng hô hấp dƣới, mặc dù VĐHHC đƣợc phân loại theo tác nhân gây bệnh, nhƣng thông thƣờng đƣợc gọi theo hội chứng: cảm lạnh, viêm phế quản, viêm thanh quản, viêm phổi…và tƣơng ứng với các hội chứng đó là các tác nhân liên quan (VD: viêm tiểu phế quản thường gặp do vi rút hợp bào đường hô hấp - RSV). VĐHHC do căn nguyên vi rút đƣợc lây truyền từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành trong quá trình tiếp xúc: nói chuyện, ho, hắt hơi, các giọt khí mang tác nhân gây bệnh sẽ lƣu hành trong không khí, và có thể nhiễm vào đƣờng thở ngƣời bên cạnh.
Ngoài ra, vi rút cũng có thể lây truyền khi tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với ngƣời bệnh: bắt tay, khăn giấy, chất thải (vi rút đƣờng ruột). 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Một số vi rút gây bệnh mang tính theo mùa và đƣợc biểu hiện rõ tại các nƣớc có khí hậu ôn đới nhƣ vi rút cúm và RSV thƣờng gây dịch vào mùa đông. Những hiểu biết về xu hƣớng và mùa của VĐHHC trong cộng đồng có thể cung cấp các thông tin cần thiết để cảnh báo về sự bùng phát dịch cũng nhƣ xây dựng các chiến lƣợc phòng bệnh, giảm thiểu sự lây truyền trong cộng đồng [3, 64].1 Vi rút họ Orthomyxoviridae Vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm 7 loài: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút cúm D, Isavirus, Thogotovirus và Quaranjavirus, trong đó 3 loài vi rút cúm A, B và C (vi rút cúm mùa) đƣợc ghi nhận là tác nhân chính gây VĐHHC [135]. Trong đó vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên gia cầm, ngƣời và các động vật khác nhƣ lợn, ngựa… là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu.
Vi rút cúm B thƣờng gây bệnh nhẹ nhƣng cũng có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em. Vi rút cúm C chƣa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời. Vi rút cúm A có tổng số 256 phân typ khác nhau dựa vào kháng nguyên (KN) bề mặt HA và NA. Trong số đó, chỉ có các phân typ A/H1N1; A/H3N2; A/H2N2 và gần đây là A/H1N1pdm09 đƣợc ghi nhận gây bệnh cho ngƣời.
Nguồn gốc các vụ đại dịch cúm thế kỷ XX, XXI với căn nguyên là vi rút cúm A nhƣ sau: - H1N1 (1918): Có nguồn gốc từ vi rút cúm gia cầm, do đột biến tại các điểm quan trọng liên quan đến khả năng thích nghi trên vật chủ là ngƣời (gen HA) [115]. - H1N1pdm (2009): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm lợn (H1N1, H3N2), 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vi rút cúm gia cầm (H5N1) và vi rút cúm ngƣời (H3N2) [107]. Đặc điểm vi rút họ Orthomyxoviridae a. Hình thái và cấu trúc phân tử Hình 1.
Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [145] Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, thƣờng có hình cầu với cấu trúc xoắn, đƣờng kính 80-120nm, đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đến vài µm. Bề mặt vi rút có đính các gai bản chất là glycoprotein, đó là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).