CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về độc tố sinh học biển Với khoảng 5000 loài thực vật phù du được biết cho đến nay, trong những điều kiện sinh sống đặc biệt, có khoảng 300 loài có tốc độ sinh trưởng lớn tạo thành những đám tảo với mật độ dày đặc, gọi là hiện tượng nở hoa (blooms). Hiện tượng nở hoa đôi khi có lợi cho việc nuôi trồng thủy sản cũng như môi trường sinh học biển. Tuy nhiên trong số 300 loài thực vật phù du kể trên, có hơn 40 loài thuộc lớp dinoflagellate và diatom là những loài sinh ra độc tố biển [15].
Chính sự phong phú của những loài tảo độc này làm cho mật độ của chúng trong nước biển có thể lên đến từ vài nghìn đến vài triệu tế bào trong 1 lít nước. Các độc tố biển này được tích tụ trong nhiều loài sinh vật biển như cá, cua, nhuyễn thể hai mảnh vỏ (sò, vẹm, trai) (Hình 1. Trong nhuyễn thể, độc tố được tích tụ chủ yếu ở tuyến tiêu hóa nhưng không gây độc cho chúng. Khi con người hoặc động vật tiêu thụ một lượng nhất định các nhuyễn thể chứa độc tố sẽ gây ngộ độc với các triệu chứng đa dạng.
Trên toàn thế giới, mỗi năm có khoảng 60000 trường hợp ngộ độc do nhiễm độc tố của các loài tảo sản xuất. Độc tố nhuyễn thể gây hủy hoại môi trường tự nhiên và có tác động tiêu cực đến nền kinh tế, du lịch và công nghiệp chế biển hải sản. Tảo độc trong chuỗi thức ăn 3 1. Độc tố sinh học biển trong thủy sản Dựa vào cấu trúc hóa học của các độc tố biển mà người ta chia chúng thành 2 nhóm: thân nước và thân dầu.
Các độc tố gây ra triệu chứng mất trí nhớ (ASP), độc tố gây liệt cơ (PSP) là những độc tố nhóm thân nước, có phân tử khối dưới 500 Da. Độc tố gây độc thần kinh (NSP). gây tiêu chảy (DSP), độc tố AZP và các độc tố khác như PTXs, YTXs thuộc nhóm thân dầu, với phân tử khối trên 600 Da (có thể lên đến 2000 Da). Độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù du.
Thông qua đường thức ăn của nhuyễn thể, độc tố được tích tụ hoặc chuyển hóa trong cơ thể nhuyễn thể. Tất cả các loài nhuyễn thể (động vật thân mềm ăn thức ăn bằng phương thức màng lọc) đều có nguy cơ bị nhiễm độc tố. Tuy nhiên, chúng thường thấy ở một số loài sau: PSP thường có trong vẹm, nghêu, sò, điệp; DSP thường có trong vẹm, trai, điệp; ASP thường chỉ có trong vẹm; NSP thường có trong trai, vẹm [10]. Khái quát chung về độc tố nhóm Okadaic acid (OA) Độc tố nhóm OA là thành phần chính của độc tố tiêu chảy (DSP), gồm có 3 chất: Okadaic acid, Dinophysistoxin-1 (DTX1), Dinophysistoxin-2 (DTX2).
Ngoài ra còn có Yessotoxin (YTXs) và Pectenotoxin (PTXs) cũng thuộc nhóm độc tố DSP, thường xuất hiện cùng nhóm OA trong các trường hợp ngộ độc tuy nhiên chúng không gây tiêu chảy. Do đó, một số người cho rằng nên loại bỏ 2 nhóm chất này ra khỏi nhóm độc tố gây tiêu chảy. Nguồn gốc tích tụ độc tố Độc tố nhóm OA được sản xuất bởi giống tảo Dinophysis, giống tảo này trong điều kiện môi trường thuận lợi sẽ phát triển rất nhanh và gây ra hiện tượng nở hoa. Chúng hay bắt gặp ở các vùng biển nhiệt đới và ôn đới, cả ven biển và ngoài khơi.
Ở Việt Nam, chúng hay được bắt gặp ở vùng biển Thừa Thiên - Huế, biển Bà Lụa tỉnh Kiên Giang [4]. Có 7 loài tảo thuộc giống Dinophysis được xác nhận là sản sinh ra độc tố nhóm OA, bao gồm: D. Ngoài ra, còn 2 loài tảo khác thuộc giống Dinophysis đang bị nghi ngờ đó là: D. Khả năng sản xuất độc tố phụ thuộc vào mỗi loài và thời điểm trong năm.
fortii ở bắc Nhật Bản trong tháng Ba và tháng Sáu cho nồng độ độc tố rất cao, điều này có liên quan đến lượng độc tố được tích tụ trong nhuyễn thể. Tuy nhiên, cũng loài đó nhưng ở Nam Nhật Bản vào tháng Năm và tháng Bảy cho nồng độ độc tố rất thấp, còn trong nhuyễn thể thì gần như không có [19]. Tính chất - Cấu trúc hóa học Hình 1. Cấu trúc hóa học các độc tố DSP - Tồn tại ở dạng bột hoặc là tinh thể màu trắng, tan tốt trong Dimethyl sulfoxide ( ≥1 mg/mL) và 1 số dung môi hữu cơ.
Độ tan giảm trong môi trường acid, base. - Nhiệt độ nóng chảy: 164-166 o C. - Bền với nhiệt. - LC50 tiêm màng bụng trên chuột: 192 µg/kg [27].
Độc tính Độc tính của mỗi độc tố DSP là không giống nhau. Do đó, để thuận tiện cho việc tính toán độc tính của hỗn hợp các độc tố DSP, người ta dùng khái niệm độc tính tương đương. DTX1 có độc tính mạnh nhất trong nhóm nên được chọn làm mốc, có độc tính là 1 đơn vị, độc tính của các độc tố khác được tính toán dựa trên việc so sánh với độc tính của DTX1. Độc tính tương đương của một số độc tố DSP được cho trong bảng 1.
Độc tính tương đương một số độc tố DSP Độc tính tương Độc tố Tham khảo đương Okadaic acid 1 [7] Dinophysistoxin-1 1 Dinophysistoxin-2 0,6 Yessotoxin 1 [8] 1a-homo yessotoxin 1 45OH yessotoxin 1 45OH-1a-homo yessotoxin 0,5 Tại châu Âu, mức giới hạn liều lượng tổng cộng các độc tố OA, DTXs, PTXs là tương đương 160 µg OA eq./kg nhuyễn thể. Vào năm 2008, cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu khuyến cáo OA, DTXs không nên vượt quá liều tương đương 45 µg OA eq./kg nhuyễn thể. Tại Việt Nam, qui định về hàm lượng độc tố DSP trong nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là ở mức không phát hiện. Theo tiêu chuẩn ngành do Bộ Thủy Sản ban hành, khi định tính bằng thử hóa sinh trên chuột, kết quả thử độc tố DSP phải âm tính.
Trong trường hợp cần thiết, kiểm chứng định lượng bằng HPLC, hàm lượng độc tố DSP trong 100 g sản phẩm không lớn hơn 60 µg [3], [5]. Thử nghiệm độc tính cấp của một số độc tố DSP trên chuột, kết quả được cho trong bảng 1. Liều gây ngộ độc cấp tính của độc tố DSP sau khi tiêm vào phúc mạc Liều gây độc cấp tính Tình trạng ngộ Tên các độc tố (mg/kg) độc OA 200 Tiêu chảy DTX1 160-200 * Tiêu chảy DTX3 500 Tiêu chảy PTX1 250 Độc gan PTX2 230-260 * Độc gan YTX 100 * Độc tim Ghi chú: * Cho chuột đực uống với liều 80 mg/kg thể trọng 1/3 số chuột chết; với liều 100 mg/kg thể trọng tất cả chuột đều chết [16]. Cơ chế gây độc Độc tố nhóm OA ức chế serine và threonine phosphatase PP1 và PP2A [10] dẫn đến làm phosphoryl hóa quá mức các protein có chứa các liên kết qui định tính thấm của tế bào.
Kết quả làm mất dịch tế bào, gây nên các triệu chứng như buồn nôn, nôn, rối loạn tiêu hóa, đau bụng, tiêu chảy… 1. Triệu chứng ngộ độc Sau khi ăn, trong vòng 30 phút đến 12 giờ, nạn nhân bị tiêu chảy, buồn nôn, ói mửa, đau ở vùng bụng. Sau triệu chứng trên thì xuất hiện triệu chứng ớn nóng lạnh. ít trường hợp tử vong, bình phục sau 3 ngày.
Trường hợp nặng: sau khi ăn, nạn nhân thấy ngứa, tê môi, cảm giác nghẹt thở.và có thể chết vì liệt cơ hô hấp trong vòng 2-24 giờ sau khi ăn. Tình hình ngộ độc Trường hợp ngộ độc độc tố DSP đầu tiên được ghi nhận tại Hà Lan trong những năm 1960, tiếp theo là các báo cáo tương tự tại Nhật Bản cuối những năm 1970. Kể từ đó, hơn 1300 trường hợp đã được báo cáo từ Nhật Bản, với mùa cao điểm từ tháng tư đến tháng chín. Những trường hợp ngộ độc khác cũng được ghi nhận tại châu Âu và Nam Mỹ.
Tại Tây Ban Nha, hơn 5000 trường hợp đã được báo cáo năm 1981. Tại Pháp năm 1984 và 1986, trên 2000 trường hợp được báo cáo hàng năm và trên 300 trường hợp ngộ độc tại Scandinavia năm 1984. Trai xuất khẩu từ Đan Mạch đến Pháp gây ra ngộ độc cho hơn 400 người trong năm 1990. Năm 1991, hơn 100 người ở Chile bị ngộ độc.
Năm 1992, độc tố DSP được phát hiện ở nồng độ cao gây nguy hiểm trong sò ốc tại Uruguay. Tại Việt Nam, ngày 03/05/2/2013, Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản Nam Bộ (NAFIQAD-SRA) đã gửi thông báo cảnh báo về việc phát hiện mật độ tảo độc Dinophysis (sản sinh độc tố DSP) vượt quá giới hạn cảnh báo tại vùng thu hoạch Bà Lụa , tỉnh Kiên Giang. Mặc dù xuất hiện rộng rãi trên toàn cầu nhưng những khu vực bị ảnh hưởng nhiều nhất vẫn ở châu Âu và Nhật Bản [4], [9], [10]. Các phương pháp xác định độc tố gây tiêu chảy 1.
Thử nghiệm sinh học Thử nghiệm in vivo Phương pháp sử dụng phổ biến nhất là thử nghiệm trên chuột, được phát triển bởi Bộ Sức khỏe và An toàn Nhật Bản. Độc tố được chiết ra từ thịt nhuyễn thể bằng aceton, sau đó đem đi cô quay đến khi còn cặn, cặn thu được hòa tan vào một lượng nhỏ thể tích Tween 60 1%. Dịch chiết sau đó tiêm màng bụng vào chuột có cân nặng khoảng 20 g và theo dõi sự sống sót của chuột từ 24 đến 48 giờ. Một đơn vị chuột (MU) được định nghĩa là liều lượng nhỏ nhất của độc tố cần thiết để giết chết một con chuột trong vòng 24 giờ.
Độc tính của mẫu (MU/g nhuyễn thể) được xác định là liều lượng nhỏ nhất mà tại đó giết chết ít nhất 2 trong 3 con chuột trong vòng 24 giờ. Tại nhiều nước, giới hạn qui định được đặt ở mức 0,05 MU/g nhuyễn thể. Trong bài viết này, tất cả các thành phần của nhóm DSP đã được phát hiện, bao gồm cả những độc tố không gây tiêu chảy (PTXs và YTXs) [16]. Do vậy, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này đó là thiếu tính đặc hiệu (không phân biệt được giữa các độc tố trong nhóm DSP), tính chủ quan về thời gian chết của động vật và vấn đề đạo đức về việc giết hại động vật trong phòng thí nghiệm.
Hơn nữa, thí nghiệm này rất đắt và tốn thời gian nhưng lại có thể cho kết quả không chính xác do ảnh hưởng của một vài chất béo khác (những acid béo rất độc đối với chuột) đồng thời kết quả khác nhau giữa dịch chiết trong toàn bộ nhuyễn thể và trong gan tụy [13]. Thử nghiệm in vitro Năm 1991, Aune cùng cộng sự đã phát triển thử nghiệm dựa trên sự thay đổi hình thái của gan tụy tươi chuột thí nghiệm khi phơi nhiễm với độc tố DSP.