CHƯƠNG 1: TONG QUAN 1.1 DAC DIEM THỰC VAT Tên thường: cây me rừng Tên gọi khác: chùm ruột núi, dư cam tử, ngưu cam tử, du cam tử. Tên khoa học: Phyllanthus emblica L. Thuộc họ dầu (Euphorbiaceae) 1.1 Mô tả chung [1] Cây cao 3m, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm. Lá xếp thành hai day trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim.
cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh, Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phái đưới của cành, với rat nhiều hoa đực và hoa cái. Hoa nở từ tháng 3 đến tháng L1 hằng năm.
Quả hình cầu. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt.2 Vùng phân bố Cây me rừng phân bố rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới châu A như ở Trung Quốc, Án Độ, In-đô-nê-xi-a, bán đảo Mã Lai [17]. O nước ta, cây me rừng được trong là loại cây mọc hoang trên các đôi trọc, xuât hiện nhiều tại các vùng rừng núi Việt Bắc và Tây Bắc [1].2 CÁC NGHIÊN CỨU VE DƯỢC TÍNH Hau hết các bộ phận đều được ding làm thuốc như qua, lá, than, rễ.1 Dược tính theo y học cỗ truyền Quả có vị chua, ngọt, đẳng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa dom, sinh tân.Rễ vị dang, chat, tính mát, có tác dụng hạ áp. Tại Án Độ, cây me rừng là một trong những loài thao được được sử dụng phô biến.
Cây me rừng giàu vitamin C, có tác dụng bảo vệ. tăng hap thụ thức ăn, tăng cường phôi, nhuận tràng, tốt cho da và tóc, chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư đa và gan. Một số bài thuốc cô truyền Chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cô họng, miệng khô khát: mỗi ngày dùng 10-30 quả sắc uống. Chữa viêm ruột, đau bụng, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g rễ sắc uống.
Chữa lở loét, man ngứa: dùng lá nau nước rửa bên ngoài. Trị tiêu đường: quả me rừng 15-20g ướp mudi và uỗng mỗi ngày.2 Nghiên cứu về được tính Quả có tác dụng chong oxi hóa, kháng khuan, sát trùng. kháng vi rút, kháng viêm [10]. w Hợp chất geraniin (52) có tác dụng chống oxi hóa rất tốt với ICs là 4.7 wM cho DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và 65,7 4M cho quá trình oxi hóa chất béo.
Các hợp chất khác như quercetin (48), kaempferol (49), quercetin 3-O-f-b-glucopyranoside (50). Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất được cô lập từ quả me rừng cho thấy một số hợp chất có tác dụng gây độc tế bào ung thu vú như geraniin (52) và isocorilagin (53) với ICs lan lượt là 13.2 va 80,9 ug/ml, cùng với các hop chất quercetin 3-Ø-#-D-glucopyranoside (50) (IC 15.5 pg/ml), kaempferol 3-Ó-/-b- glucopyranoside (51) (ICs¿ 31. Ngoài ra, isocorilagin có khả năng gây độc tế bao ung thư phôi với [Cao là 51,4 pg/ml [15]. Chiết xuất từ cây me rừng được Xiaoli Liu cùng các cộng sự nghiên cứu vào năm 2009 cho thay có khả năng kháng khuẩn, chống lại các vi khuẩn Gram đương (S.
subtilis), Gram âm (E. typhi) và nam (C. Tác dụng kháng virus HSV-1 và HSV-2 của hop chat 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-f-p- glucose (54) được cô lập từ cây me rừng cũng được thử nghiệm. Kết quả cho thay hợp chat nay có kha năng ức chế sự phát triển của HSV với IC¿ là 31,7 uM [16].
Dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan và phục hồi gan bị ton thương do ethanol khi thử nghiệm trên chuột với liều lượng 75 mg/kg/ngày [9]. Dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nông độ tinh dich của chuột đực đã được tiêm valproic acid (một loại thuốc trị bệnh động kinh nhưng có tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới) [6].3 CÁC NGHIÊN CUU VE THÀNH PHAN HÓA HỌC Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Phyllanthus emblica L. được trình bày như sau. Các nghiên cứu trước 1998 cho thay cây me rừng có chứa các hợp chất như zeatin (1).
H N N7S N N >w HO-P-O¬_o o oO N O N> OH \ Z HO, >⁄^Ï 1+ OH # 62, `Z (1) (2) HO R=Galloyl R=Galloyl (5) (6) yy OR | OH ¬Q Ho“IOI OH HRD 0 H (7) (9) R=C;H; (10) OH OH a woo I| (12) R,=R,=OH | " (14) R,=H, R;=OH OH OH (16) R;=R;=H (17) Năm 2000, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã cô lập được các hợp chat phyllaemblic acid (20) và dẫn xuất (21-23) từ rễ của cây me rừng [17]. ORH H OH H OOC : COOH R,OOC COOR; 5R=Ga R=G ilo _ lloyl ae ae (26) R,=H, R;=CH, (27) R,=CH;, R;=H (28) R,=R;=H RO H H \ R, OF HO H (29) R,=Galloyl, R;=R;=R,=H R=Galloyl =R,=R = =G (33) R,=R„=R,=H, R;=Galloyl i (32) R,=CH; OR, RO ess on 0 (38) R,=Galloyl, R,=neoche, R,=R,=H (39) R,=Galloyl, R,=H, R,=neoche, R,=H (40) R,=Galloyl, R,=R,=H, R,=neoche Năm 2007, Chun-Bin Yang cùng các cộng sự đã cô lập được hợp chat ellagitanin mới là phyllanthunin (41), cùng 8 hợp chất khác đã biết như: gallic acid (8), ethyl gallate (9). Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô lap thêm 6 hợp chat từ quả me rừng: quercetin (48), kaempferol (49), quercetin-3-Ø-/-D-glucopyranoside (50), kaempferol 3-@-/-Db-glucopyranoside (51), geraniin (52), isocorilagin (53) [13]. RO "g9 OF R=Galloyl (34) Năm 2012, Wei Lou và các cong sự đã cô lập được từ vo của trái me rừng các hợp chất chebulagic acid (55), chebulanin (56), isomallotusinin (57), và isocorilagin (53) [11].
Mahbuba Khatun và các cộng sự đã cô lập được /-sitosterol-3-@-/-D-glucoside (58) từ cây me rừng [5]. HO OHHO OH HO OHHO OH mm? Sen Le) O HO on on ‘0 OH ° syO HOOC O HOOC fe) 0 0 HO HO HO — OH O H O OH H H H ie) H R=Galloyl R=Galloyl R=Galloyl (55) (56) (57) \ OH H SẺ, H (58) Năm 2013, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được các hợp chất sterol (59-70), từ cành và lá của cây me rừng. trong d6 có 2 hợp chat sterol mới là trihydroxysitosterol (60) và Š5z,6/,7z-acetoxysitosterol (61) [12]. 10 (61) R,=H, R;=CH,COO (62) R,=H, R;=OH (59, ReH (63) R,=CH;:CH;O, R,#H (60, R=OH (64) R,=R;»eO (65) R,=R„=H (66) R,=R;=O i (67) R,=H, R,=OH OH (68) Ghi chú: OH HO HO Galloy! Neoche H Glu= Glucopyranosy Rha-glu= @-L-rhamnopyranosyl (1—>6) —O-f-p- glucopyranosyl CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHAT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHAP 2.1 Hoá chất * Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Án và Merck dùng cho cột sắc kí.
* Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc kí cột. ® Sắc kí bảng mỏng loại 25DC - Alufolein 20x20, Kiesel gel 60F - Merck. * Sắc kí bảng mỏng loại 25DC, RP-18, Merck. * Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gôm: hexane, ethanol, acetone, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước cất.
" Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mong: sử dụng H;SO, 20%.2 Thiết bị ® Các thiết bị dùng đẻ giải ly, dụng cụ chứa mẫu. ® Cac cột sắc kí. * Máy cô quay chân không. ® Bếp cách thuỷ.
" Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. * Cân điện tử.3 Phương pháp tiễn hành 2.1 Phương pháp phân lập các hợp chat Dùng phương pháp sắc kí dé cô lập và tinh chế các hợp chất hữu cơ bao gồm các kĩ thuật SKC silica gel pha thường và pha đảo RP-18 kết hợp SKLM. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch HạSO; 20%.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phô cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR (500 MHz), ‘C-NMR (125 MHz), 2D-NMR được đo tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.Hồ Chí Minh. Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS tại Phòng thí nghiệm Viện Kiểm Nghiệm Thuốc, 200 Cô Bắc, Cô Giang, Quận 1, TP.Hồ Chi Minh.1 Thu hái nguyên liệu Mau cây dùng trong nghiên cứu dé tài là lá, thân và rễ cây me rừng (Phyllanthus emblica L.
) được thu hái tinh Bình Thuận, vào thang 5/2014. Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica L.”, họ Thau dau (Euphorbiaceae).2 Xử lý mẫu nguyên liệu Mau nguyên liệu được rửa sạch, loại bo phân sâu bệnh, phơi khô trong bóng ram, roi xay thành bột mịn. Sau đó tiễn hành ngâm chiết và phân lập các hợp chat.
DIEU CHE CÁC LOẠI CAO 2.1 Điều chế cao hexane và ethyl acetate của lá Các bộ phận cây me rừng (Phyllanthus emblica L. ) như rễ, than, lá được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi. Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 96” bằng phương pháp ngâm đầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô. Cao ethanol thô của lá được chiết long - long lân lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane và cao ethyl acetate.
Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2. l4 | Dich ethanol - Cô quay thu hồi dung Ethanol thu Cao ethanol hôi (285.5 g) Chiết lỏng — lỏng với hexane, ethyl acctate - C6 quay thu hồi dung Cao ethyl acetate Cao con lai (143.2 Điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ Cao ethanol thô rễ được chiết lỏng - lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane và cao ethyl acetate. Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ Bột rễ khô (9.4 kg) - Ngâm trong ethanol 96 Dich ethanol | - Cô quay thu hôi dung Ethanol thu Cao ethanol hồi (252.4 g) - Chiết lỏng — lỏng với hexane, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung Cao hexane Cao ethyl acetate Cao còn lại (6.4 CÔ LẬP CÁC HOP CHAT TRONG CAO ETHYL ACETATE CUA LA Phương pháp SKC (sắc kí cật): Các cao (hoặc phân đoạn) được sắc kí cột với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dan, dịch giải ly qua cột được hứngg vào các lọ. Theo đõi quá trình giải ly bằng SKLM (sắc kí lớp móng).
Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau gom chung thành một phân đoạn.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá Cao ethyl acetate của lá me (143.1g) được SKC silica gel lần lượt với các hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dan (80-100% EA), tiếp sau là hệ dung môi EA:Me (5- 100% Me). Kết quả thu được 5 phân đoạn kí hiệu từ EA1 - EAS. Kết quả được trình bày ở bang 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá Trọng Phân Dung môi lượng Sắc kí lớp mỏng Ghi chú đoạn giải ly (g) 13.28 | Nhiều vết Chua khao sat paiMe | 22.25 Nhitu vétkéo vét_ Di Khao sát EA:Me 8:2 | 33.40 Nhiều vết Da khảo sát EA:Me7:3 | 14.70 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: H (hexane), EA (cthyl acetate), Me (methanol) 2.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3 Phân đoạn EA3 (22.25g) cho SKLM nhiều vết.