Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, sở hữu hệ thực vật phong phú và đa dạng. Nguồn tài nguyên này là tiền đề cho sự phát triển của lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên, đóng góp quan trọng vào y học cổ truyền và công nghiệp dược phẩm. Trong y học dân gian, các loài thuộc chi Đinh lăng (Polyscias) từ lâu đã được sử dụng như các vị thuốc bồi bổ cơ thể, tăng cường thể lực, chống lão hóa, hỗ trợ điều trị đau đầu, đau tức ngực, tiêu hóa kém và bồi phục sức khỏe.

Chi Đinh lăng (Polyscias) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) là chi lớn thứ hai trong họ này. Dù có giá trị sử dụng cao, nhiều loài trong chi vẫn chưa được khảo sát đầy đủ và toàn diện về thành phần hóa học cũng như dược tính. Đối với loài Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung khảo sát trên bộ phận lá tươi hoặc lá khô (chẳng hạn như công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Ánh Tuyết năm 2010 và Văn Bá Lãnh năm 2011). Bộ phận vỏ thân của loài này chưa được khảo sát chuyên sâu về các thành phần hóa học thứ cấp.

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học của sinh viên Nguyễn Trần Bảo Huy, thực hiện tại Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết (hoàn thành vào tháng 5 năm 2012), được triển khai nhằm giải quyết khoảng trống dữ liệu này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

  1. Thu thập, xử lý nguyên liệu thực vật vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae).
  2. Chiết xuất và điều chế các phân đoạn cao chiết có độ phân cực khác nhau từ bột vỏ thân cây.
  3. Sử dụng các phương pháp sắc ký thích hợp để phân lập và tinh chế các hợp chất hữu cơ sạch từ các phân đoạn cao.
  4. Ứng dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D và phổ khối lượng) để giải đoán và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), họ Nhân sâm (Araliaceae).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh; nghiệm thu vào tháng 5 năm 2012.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở phân loại thực vật học của chi Polyscias (họ Araliaceae) và các dữ liệu nghiên cứu hóa thực vật, dược lý học đã công bố trong và ngoài nước về các nhóm hợp chất thiên nhiên (chủ yếu là saponin triterpenoid, steroid, flavonoid, polyacetylen).

Hệ thống phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tác giả áp dụng bao gồm các giai đoạn chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc hóa học:

Giai đoạn thực nghiệm Phương pháp / Kỹ thuật sử dụng Mục đích và đối tượng xử lý
Xử lý và chiết xuất Chiết ngâm dầm / ngấm kiệt với các dung môi hữu cơ Điều chế cao tổng và phân tách thành các phân đoạn cao phân cực khác nhau: eter dầu hỏa (Ed), clorofom (C), butanol (Bu), metanol (M).
Phân tách và cô lập Sắc ký cột cổ điển (CC), sắc ký cột pha đảo ($RP\text{-}18$), sắc ký bản mỏng (TLC) Tách phân đoạn, theo dõi độ tinh khiết và cô lập các hợp chất sạch từ cao eter dầu hỏa và cao butanol.
Xác định cấu trúc (1D-NMR) Phổ $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, phổ DEPT ($90^\circ$, $135^\circ$) Xác định độ dịch chuyển hóa học ($\delta$), độ tích phân, hằng số ghép ($J$), phân biệt các loại carbon (C bậc bốn, CH, $\text{CH}_2$, $\text{CH}_3$).
Xác định cấu trúc (2D-NMR) HSQC, HMBC, $^{1}\text{H-}^{1}\text{H}$ COSY Xác định tương quan trực tiếp H–C qua 1 liên kết (HSQC), tương quan tầm xa H–C qua 2–3 liên kết (HMBC), và tương quan ghép spin giữa proton lân cận (COSY).
Phân tích khối lượng Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) với kỹ thuật ion hóa phun mù điện tử (ESI) Xác định khối lượng phân tử và mảnh ion đặc trưng của hợp chất cô lập.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về hình thái thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Polyscias nói chung và loài Polyscias guilfoylei Bail. nói riêng.

1. Đặc điểm thực vật học: Cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.) là dạng cây bụi, chiều cao trung bình từ 3 đến 4 m, thân ít phân nhánh. Lá cây có màu lục sáng đặc trưng, viền lá màu trắng, xẻ lông chim đều đặn; cuống lá ngắn, to, có sọc hoặc đốm; lá chét có phiến thuôn dài với mép có răng cưa không đều.

2. Tổng quan về thành phần hóa học chi Polyscias: Tác giả tổng hợp kết quả nghiên cứu hóa thực vật từ nhiều loài trong chi:

  • Loài Polyscias guilfoylei Bail.: Nghiên cứu năm 2010 của Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã phân lập từ lá 8 hợp chất: isophytol (1), acid oleanolic (2), acid $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic (3), hỗn hợp acid $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow3$)-$\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic (4) và acid $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow4$)-$\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic (5) theo tỷ lệ $2:3$, acid $3\text{-}O\text{-}[\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow3$),$\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow4$)]-$\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic (6), acid $3\text{-}O\text{-}[\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow2$),$\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow4$)]-$\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic (7), và $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucopyranosyl-($1\rightarrow4$)-$\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic $28\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucopyranosyl ester (8). Đến năm 2011, Văn Bá Lãnh cô lập thêm từ lá $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucopyranosylstigmasterol (19) cùng este (8).
  • Các loài cùng chi:
    • Polyscias amplifolia (Baker) Harms: Prakash C. và cộng sự (2003) cô lập 4 saponin có aglycon là acid oleanolic gồm các hợp chất (9), (10), (11), (12).
    • Polyscias dichroostachya Baker: Cô lập 4 saponin có aglycon là hederagenin gồm các hợp chất (13), (14), (15), (16).
    • Polyscias filicifolia Balf.: Nguyễn Thúy Anh Thư và cộng sự (2007) phân lập nhóm steroid (stigmasterol 17, spinasterol 18, $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucopyranosylstigmasterol 19), phenolic (20, 21), saponin (5) và acid oleanolic (2).
    • Polyscias fulva (Hiern) Harms: Phân lập các saponin hederagenin (14, 22), flavonoid glycosid (23), dammaran glycosid (24), lichexanthon (27), aglycon hederagenin (28), saponin oleanolic (29), saponin collinsogenin (30), saponin echynocystic (31) cùng các hợp chất ceramide (32) và cerebroside (33).
    • Polyscias fruticosa (L.) Harms: Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự (1990) xác định rễ, thân, lá chứa glycosid, alcaloid, tanin, vitamin B1 và khoảng 20 acid amin; Brophy Joseph J. và cộng sự (1990) phân tích tinh dầu lá bằng GC-MS phát hiện 24 cấu tử với 4 chất chính là $\beta$-elemen (34), $\beta$-germacren-D (35), E-$\gamma$-bisabolen (36) và $\alpha$-bergamoten (37); Võ Xuân Minh (1991) công bố hàm lượng saponin toàn phần trong rễ ($0{,}49%$), vỏ rễ ($1{,}00%$), lõi rễ ($0{,}11%$) và lá ($0{,}38%$); Lutomski và cộng sự (1992) cô lập 5 hợp chất polyacetylen (38–42); Võ Duy Huấn và cộng sự (1998) phân lập 11 saponin triterpen (5, 45, 7, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52).
    • Polyscias scutellaria: Paphassarang và cộng sự (1988–1990) và Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) cô lập nhiều saponin oleanolic glycosid (3, 4, 7, 8, 45, 48, 59, 60, 61) và steroid (17, 18, 19).
    • Polyscias balfouriana Bail.: Nguyễn Thị Ánh Tuyết và cộng sự (2007, 2010) cô lập 12 hợp chất từ lá (gồm 5-hydroxymethylfurfural 62, các steroid 17, 18, 19, 63, acid oleanolic 2, flavonoid 65, các saponin 64, 66, 67, 5, 8) và 3 saponin từ rễ (4, 7, 68).

3. Nghiên cứu dược tính và ứng dụng y học dân gian:

  • Tác dụng tăng lực, tăng sức bền chống kiệt sức và nhiệt độ; Polyscias fruticosa làm tăng tiết niệu trên chuột gấp hơn 5 lần, nâng cao sức đề kháng với bức xạ siêu cao tần, kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei và tăng hiệu lực thuốc cloroquin; không gây tăng huyết áp ở người như nhân sâm.
  • Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2001) chứng minh cao Polyscias fruticosa ở liều 45–180 mg/kg thể trọng có tác dụng chống trầm cảm, phục hồi giấc ngủ bị rút ngắn do stress, kích thích hoạt động thần kinh - nội tiết, chống viêm và phòng ngừa xơ vữa động mạch trên chuột nhắt trắng.
  • Tác dụng kháng u: Ba hợp chất saponin (9, 10, 12) từ quả Polyscias amplifolia thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người.
  • Ứng dụng điều trị loét: Dịch trích butanol từ lá và rễ cây Polyscias balfouriana có tác dụng chống loét trên mô hình chuột thực nghiệm (dịch chiết lá thể hiện hoạt tính mạnh hơn dịch chiết rễ).
  • Kháng khuẩn và kháng đột biến: Dịch chiết sinh khối tế bào Polyscias filicifolia kháng mạnh vi khuẩn Staphylococcus aureus và kháng yếu đối với Micrococcus flavus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae; dịch trích ethanol $40%$ kháng đột biến gen trên các chủng Salmonella typhimurium TA98 và TA100.
  • Khóa luận dẫn chứng các bài thuốc dân gian từ đinh lăng dùng chữa mệt mỏi, suy nhược, sốt lâu ngày, ho tức ngực, lợi sữa cho phụ nữ sau sinh, chữa dị ứng mẩn ngứa và phòng kinh giật ở trẻ em.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương này mô tả chi tiết quá trình chuẩn bị hóa chất, thiết bị, khảo sát mẫu nguyên liệu thực vật và quy trình phân tách các phân đoạn cao:

  • Trang thiết bị và hóa chất: Sử dụng các loại dung môi hữu cơ đạt tiêu chuẩn phân tích (eter dầu hỏa, clorofom, metanol, n-butanol); chất hấp phụ sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18; thiết bị phân tích phổ NMR tại các tần số thích hợp.
  • Xử lý mẫu: Vỏ thân cây Đinh lăng trổ được rửa sạch, phơi/sấy khô, xay nhỏ thành bột nguyên liệu thô trước khi tiến hành chiết ngấm kiệt.
  • Quy trình chiết và điều chế cao: Bột vỏ thân được chiết bằng dung môi thích hợp, dịch chiết được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để tạo cao tổng. Tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng thu các phân đoạn cao có độ phân cực tăng dần: phân đoạn cao eter dầu hỏa, phân đoạn cao clorofom, phân đoạn cao butanol và phân đoạn cao nước.
  • Cô lập hợp chất: Sắc ký cột phân đoạn cao eter dầu hỏa và cao butanol nhiều lần kết hợp kiểm tra bản mỏng sắc ký (TLC) giúp cô lập thành công hai hợp chất tinh khiết:
    • Hợp chất BU-1 (cô lập từ phân đoạn cao butanol).
    • Hợp chất ED-1 (cô lập từ phân đoạn cao eter dầu hỏa).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 tập trung vào việc giải đoán dữ liệu phổ để xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất cô lập:

  • Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BU-1: Tác giả sử dụng tổng hợp các phổ $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT (DEPT-90, DEPT-135) cùng các phổ tương quan 2D (HSQC, HMBC, $^{1}\text{H-}^{1}\text{H}$ COSY). Các tín hiệu phổ cho thấy hợp chất BU-1 thuộc nhóm hợp chất saponin triterpenoid khung oleanane liên kết với chuỗi đường (glycon) tại vị trí C-3 hoặc C-28, phù hợp với các đặc trưng cấu trúc glycosid của chi Polyscias.
  • Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất ED-1: Phân tích các tín hiệu dịch chuyển hóa học trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp làm rõ khung cấu trúc của hợp chất ít phân cực cô lập từ phân đoạn eter dầu hỏa (phù hợp với các dẫn xuất triterpen tự do hoặc phytosterol thường gặp ở thực vật).

Chương 4: Kết luận và đề xuất

  • Kết luận: Đã xử lý thành công nguyên liệu vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), điều chế các phân đoạn cao chiết và cô lập được 2 hợp chất hóa học ký hiệu BU-1 và ED-1, đồng thời thu thập đầy đủ dữ liệu phổ NMR phục vụ xác định cấu trúc.
  • Đề xuất: Mở rộng nghiên cứu với lượng mẫu nguyên liệu lớn hơn để cô lập thêm các hợp chất thứ cấp khác trong vỏ thân và rễ; đồng thời triển khai thử nghiệm sàng lọc các hoạt tính sinh học của các loại cao chiết và các hợp chất đơn lập.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã ghi nhận các kết quả thực nghiệm cụ thể:

  1. Chiết xuất thành công các phân đoạn cao chiết phân cực khác nhau từ vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), bao gồm cao eter dầu hỏa, cao clorofom và cao butanol.
  2. Cô lập thành công 2 hợp chất hữu cơ sạch: hợp chất BU-1 (từ phân đoạn butanol) và hợp chất ED-1 (từ phân đoạn eter dầu hỏa).
  3. Đo đạc và phân tích chi tiết bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) cùng phổ khối lượng LC/MS của hợp chất BU-1, phục vụ xác định cấu trúc phân tử.

Đóng góp khoa học của khóa luận:

  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về thành phần hóa học phân lập từ bộ phận vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.), bổ sung cho các công trình trước đó vốn chỉ tập trung vào bộ phận lá.
  • Làm phong phú thêm hệ thống cơ sở dữ liệu phổ học của các hợp chất saponin triterpenoid và steroid thuộc chi Polyscias và họ Nhân sâm (Araliaceae) tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Do giới hạn về thời gian thực hiện khóa luận cử nhân và khối lượng mẫu nguyên liệu thu thập ban đầu, số lượng hợp chất cô lập được còn khiêm tốn (2 hợp chất BU-1 và ED-1). Nghiên cứu chưa thực hiện thử nghiệm hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxy hóa, độc tế bào) trực tiếp trên các mẫu cao và đơn chất đã tách.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Thu thập khối lượng mẫu lớn hơn để khảo sát sâu hơn các cấu tử vi lượng trong vỏ thân và rễ cây Polyscias guilfoylei Bail.; tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học in vitro đối với các phân đoạn cao và các hợp chất tinh khiết đã cô lập.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên cao học ngành Hóa Hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Dược học: Tham khảo phương pháp chiết phân bố phân đoạn dung môi, quy trình sắc ký cột phân tách saponin và phytosterol.
  • Người nghiên cứu cấu trúc hợp chất tự nhiên: Cung cấp bộ dữ liệu phổ thực nghiệm ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, 2D-NMR) của hợp chất triterpenoid/saponin phục vụ tra cứu, so sánh và đối chiếu cấu trúc.
  • Nghiên cứu sinh thực vật dược: Phần tổng quan tài liệu hệ thống hóa chi tiết thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 8 loài thuộc chi Polyscias cùng danh mục tài liệu tham khảo chuyên khảo trong nước và quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận nghiên cứu thành phần hóa học trên bộ phận nào của cây Đinh lăng trổ?
Nghiên cứu tập trung khảo sát trên bộ phận vỏ thân của cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail., họ Nhân sâm Araliaceae).

2. Tác giả đã cô lập được những hợp chất nào từ vỏ thân cây Đinh lăng trổ?
Tác giả đã cô lập được 2 hợp chất tinh khiết: hợp chất ký hiệu BU-1 (tách từ phân đoạn cao butanol) và hợp chất ED-1 (tách từ phân đoạn cao eter dầu hỏa).

3. Các phương pháp phổ học nào được sử dụng để xác định cấu trúc của hợp chất BU-1?
Cấu trúc hợp chất BU-1 được xác định dựa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT), phổ tương quan 2 chiều (HSQC, HMBC, $^{1}\text{H-}^{1}\text{H}$ COSY) và phổ khối lượng sắc ký lỏng (LC/MS với kỹ thuật ion hóa ESI).

4. Nghiên cứu năm 2010 của Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tìm thấy những hợp chất nào trong lá cây Đinh lăng trổ?
Công trình năm 2010 đã cô lập từ lá 8 hợp chất: isophytol, acid oleanolic, acid $3\text{-}O\text{-}\beta\text{-D-}$glucuronopyranosyloleanolic, hỗn hợp 2 saponin oleanolic glycosid nối chuỗi $1\rightarrow3$ và $1\rightarrow4$ theo tỷ lệ $2:3$, cùng 4 dẫn xuất saponin oleanolic mang từ 2 đến 3 đơn vị đường khác nhau.

5. Tác giả đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo nào cho đề tài?
Tác giả đề xuất tiếp tục nghiên cứu với khối lượng mẫu nguyên liệu lớn hơn để khảo sát kỹ hơn các thành phần hóa học trong vỏ thân và rễ cây Polyscias guilfoylei Bail., đồng thời tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các loại cao chiết và các hợp chất đã cô lập.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân hóa học của sinh viên Nguyễn Trần Bảo Huy đã hoàn thành việc khảo sát hóa thực vật trên vỏ thân cây Đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei Bail.). Đề tài đã điều chế thành công các phân đoạn cao chiết, cô lập được 2 hợp chất hóa học sạch (BU-1 và ED-1) và giải đoán cấu trúc bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hiện đại (1D và 2D-NMR). Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung dữ liệu khoa học về thành phần hóa học của chi Polyscias thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) tại Việt Nam.