MỞ ĐẦU Việt Nam có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng. Những yếu tố trên đã tạo nên các hệ sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới phong phú và phát triển với khoảng 12 000 loài, trong đó có các loài mang nhiều giá trị mà ta chưa biết đến [1]. Việc tìm ra, nghiên cứu và ứng dụng chúng đang là một vấn đề mà các nhà khoa học rất quan tâm. Trong đề tài này, các dược liệu bao gồm hương nhu trắng, đại hồi, mùi già, quế và trầu không được tiến hành nghiên cứu để làm rõ hoạt tính kháng nấm và khả năng ứng dụng của chúng, cụ thể như sau: 1.
Mục tiêu nghiên cứu Fusarium là một trong những chi nấm gây hại phổ biến nhất trên nông sản. Chúng đứng thứ năm trong mười chi nấm gây tử vong nhiều nhất ở thực vật. Trong đó, hai chủng Fusarium oxysporum và Fusarium solani, là hai chủng gây hại nhiều nhất trên nông sản trong cả quá trình phát triển và bảo quản sau thu hoạch. Để có thể giải quyết các vấn đề do Fusarium gây ra cần nhiều các hợp chất hóa học, thuốc thử hoặc thiết bị đòi hỏi chi phí cao.
Thêm vào đó, các chất này thường ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như để lại dư lượng trên nông sản làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Vì vậy, việc phát triển một chế phẩm diệt nấm có khả năng kháng nấm tốt, có nguồn gốc tự nhiên, sinh học, đáp ứng được nhu cầu của xã hội và bắt kịp xu hướng mới, hướng tới tạo ra các loại nông sản an toàn, có năng suất và chất lượng cao là mối quan tâm hàng đầu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các chiết xuất từ các dược liệu như hương nhu, đại hồi, mùi già, quế, trầu không có khả năng kháng nấm tốt [2-6]. Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về việc kháng Fusarium từ các chiết xuất này ở Việt Nam vẫn còn hạn chế.
Do đó, với mong muốn cung cấp thêm nhiều bằng chứng về khả năng kháng nấm cũng như bước đầu đề xuất công thức kết hợp các dược liệu này với nhau, làm tiền đề cho một chế phẩm kháng nấm sinh học, luận văn này đã tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm in vitro, in vivo hoạt tính kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu từ năm loại dược liệu kể trên. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận văn này là các dược liệu như bên dưới: Cành lá hương nhu trắng. Cành lá đại hồi. Cành lá trầu không.
Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu như đã đề ra ở trên, cần thực hiện các nội dung sau: Chuẩn bị, thu các cao chiết và tinh dầu từ các dược liệu: o Các cao chiết và tinh dầu bao gồm cao chiết và tinh dầu từ hương nhu trắng, tinh dầu cành lá hồi, cao và tinh dầu mùi già, cao và tinh dầu lá trầu không là các mẫu thử nghiệm được chuẩn bị bởi nhóm nghiên cứu của TS. Lê Xuân Tiến. o Các tinh dầu từ cành là quế (tinh dầu tổng, các phân đoạn) là sản phẩm của Công ty TNHH OXEYNS, được chưng cất theo quy trình như bên dưới. 1 Quy trình chưng cất phân đoạn tinh dầu quế 3 Điều kiện để thu các phân đoạn tinh dầu quế được thể hiện như trong bảng: Bảng 1.
1 Thông số quá trình chưng cất các phân đoạn tinh dầu quế Nhiệt độ đáy tháp Nhiệt độ đỉnh tháp Áp suất Phân đoạn Lưu ý chưng cất (°C) chưng cất (°C) (kPa) Light (Q2) 127 – 128 94 - 108 -99 Middle (Q4) 127 – 128 108 - 110 -99 Residue (QR) 133 -99 Thu ở đáy Đánh giá GC – MS các tinh dầu để xác định sự ảnh hưởng của các thành phần tinh dầu lên hoạt tính kháng nấm. Đánh giá hoạt tính kháng hai chúng nấm Fusarium oxysporum và Fusarium solani của các cao chiết và tinh dầu thông qua các thử nghiệm: o Khảo sát hoạt tính kháng nấm in vitro bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. o Xác định giá trị MIC của mỗi cao chiết và tinh dầu. o Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vivo trên cây ớt hiểm.
4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2. Tổng quan về các chủng nấm thử nghiệm 2. Nấm gây héo rũ trên cây Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum thuộc họ Nectriaceae bộ Hypocreales là một mầm bệnh có sẵn trong đất. oxysporum có thể gây bệnh trên hơn 100 loại cây trồng khác nhau từ cà chua, chuối, ớt, bắp cải, khoai lang, thuốc lá, dưa hấu… đến các loại hoa như tulip, thủy tiên, cẩm chướng…và đứng thứ năm trong số mười mầm bệnh gây tử vong cao nhất ở thực vật [7].
Các triệu chứng đặc trưng của bệnh bao gồm hiện tượng các mạch dẫn trong cây bị hóa nâu, lá bị héo, còi cọc, héo dần và rụng hay thậm chí có thể làm chết cây. oxysporum gây ra thiệt hại không nhỏ tới năng suất và chất lượng nông sản, đặc biệt là ở các vùng mang khí hậu nhiệt đới [8-12]. oxysporum có thể sinh trưởng dễ dàng trên nhiều loại môi trường nhân tạo. Trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) , nấm mọc nhanh (có thể kín đĩa đường kính 9 cm trong vòng 7 ngày), tản nấm thường có màu hồng, cam, đỏ, tía sau khi cấy 4 - 5 ngày [8, 9, 13].
Nấm hình thành ba loại bào tử vô tính cả trên môi trường nhân tạo hoặc trên cây bị héo chết: một là bào tử phân sinh lớn dạng đa bào (3 - 5 vách ngăn), hình trăng khuyết; hai là bào tử phân sinh nhỏ dạng đơn bào, hình oval hoặc hình thành từ bọc giả; ba là bào tử hậu dạng đơn bào hoặc thành cặp, vách dày, sức chống chịu tốt, hình thành từ sợi nấm hoặc từ bào tử phân sinh lớn [13, 14]. 1 Nấm Fusarium oxysporum sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA a. Mặt trên khuẩn lạc b. Mặt dưới khuẩn lạc 5 2.
Nấm gây bệnh thối gốc, cổ rễ Fusarium solani Fusarium solani thuộc họ Nectriaceae bộ Hypocreales cũng là một mầm bệnh có sẵn trong đất. solani là một trong những loại bệnh gây hại nguy hiểm nhất đối với cây trồng. Chúng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nông sản, gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho người nông dân. solani gây thối thân, cổ rễ cây thông qua các vết thương từ đó gây nên tình trạng héo rũ.
Trên cây non, nấm làm cho lá cây mất dần gân lá, héo rũ và rụng dần đến khi cây chết. Ở cây trưởng thành, nấm gây héo rũ, còi cọc, hoa và quả kém phát triển [15-17]. solani còn có khả năng gây hại cho nông sản sau khi thu hoạch thông qua các vết thương trên củ, quả trong quá trình thu hoạch và xử lý sau thu hoạch. Nấm làm cho nông sản bị mất dần độ cứng, không giữ được nước, nhũn và cuối cùng bị sợi nấm bao phủ [17, 18].
solani có thể sinh trưởng dễ dàng trên nhiều loại môi trường nhân tạo. Trên môi trường PDA, nấm mọc nhanh (có thể kín đĩa 9 cm trong vòng 7 ngày), tản nấm có hình thể tơi xốp hoặc bằng phẳng trên môi trường nuôi cấy. Mặt trên tản nấm có màu trắng, mặt dưới có màu kem. Nấm hình thành ba loại bào tử vô tính cả trên môi trường nhân tạo hoặc trên cây bị héo chết: tiểu bào tử có dạng hình trụ hoặc hình trứng có thể có 1 vách ngăn hoặc không có vách ngăn, đại bào tử đa số có dạng hình liềm thường có 2 – 5 vách ngăn, bào tử áo đa số có dạng hình tròn [19, 20].
2 Nấm Fusarium solani sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA a. Mặt trên khuẩn lạc b. Mặt dưới khuẩn lạc 6 2. Hình thức gây bệnh của Fusarium oxysporum và Fusarium solani trên cây Fusarium oxysporum là mầm bệnh tồn tại trong đất, từ đó chúng xâm nhập vào cây thông qua các vết thương hở ở rễ, phần thân nằm gần mặt đất hoặc thông qua hạt giống bị nhiễm bệnh.
Điều kiện nhiệt độ từ 18 – 34 °C, ẩm độ cao thích hợp cho nấm phát triển. Khi đã xâm nhập được vào vật chủ, nấm đi vào bó mạch và xâm chiếm các mô xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân. Quá trình này gây nên các phản ứng trên cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu. Các hợp chất này làm cản trở quá trình vận chuyển nước từ rễ đến các bộ phận khác của cây.
Do đó gây ra các triệu chứng héo, hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn và thậm chí gây chết cây [21, 22]. oxysporum xâm nhập vào vật chủ (cây), các triệu chứng ban đầu được gây ra bao gồm: hiện tượng mất vân lá, héo rũ, còi cọc trên lá non, dần dần làm cây yếu rồi chết. Trên cây trưởng thành, nấm gây héo vàng, hiện tượng hoa, quả phát triển bất thường và biểu hiện rõ nhất ở giai đoạn ra hoa. Đồng thời, khi nấm xâm nhập, các mạch dẫn trong cây sẽ bị chuyển sang màu nâu.
Đôi khi, hiện tượng này không thể nhìn thấy khi quan sát hình thái thông thường nhưng có thể thấy rõ khi quan sát mặt cắt ngang thân cây. Tuy héo là triệu chứng chủ yếu của bệnh và có thể quan sát được trên cây nhưng đây thực sự chỉ là triệu chứng thứ cấp, là hệ lụy của việc rễ và các mạch dẫn trong cây bị tổn thương dẫn đến mất nước. Triệu chứng chính của bệnh phải là hiện tượng thân cây, các mạch dẫn bị chuyển sang màu nâu, chỉ được phát hiện khi quan sát mặt cắt ngang thân cây như đã trình bày ở trên. Trong một số trường hợp, F.
oxysporum còn có thể gây ra hiện tượng thối rễ, thối củ tại vị trí vết thương ban đầu khi chúng xâm nhập vào vật chủ [23]. Trên cây ớt, mầm bệnh có thể tác động lên cây ngay cả ở thời điểm cây còn non và khi cây đã trưởng thành, ra hoa. Ở cây non, bệnh làm cho cây còi cọc, vàng lá, héo dần và cuối cùng là chết. Nếu mầm bệnh tấn công cây trưởng thành, hoa và quả của cây không phát triển bình thường.
Triệu chứng đặc trưng của bệnh là các lá già phía dưới bị vàng trước sau đó lan lên các lá trên. Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện ở một vài cành trên cây hay cả cây. Lá của các cây bị nhiễm bệnh sẽ bị vàng, héo và sau đó cây sẽ chết. Các tế bào cắt ngang thân cây bị bệnh thường hóa 7 nâu.