Khảo sát đặc điểm phân tử thuộc exon 26 gen apob liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu

Bệnh cao cholesterol máu gia đình (FH) là một bệnh di truyền trội, dẫn đến rối loạn chuyển hóa… 98 trang · Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh · 2020.

• Tác giả: Đỗ Nguyễn Mai Thy
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Khảo Sát Đặc Điểm Phân Tử Thuộc Exon 26 Gen APOB Liên Quan Đến Bệnh Cao Cholesterol Trong Máu
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1. Nguyên nhân mắc bệnh cao cholesterol. Một số bệnh lý liên quan đến việc chuyển hoá Cholesterol
• 1.1. Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease, CVD)
• 1.2. Bệnh Familial Hypercholesterolemia (FH)
• 1.3. Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH
• 1.4. Các gen có vai trò trong chuyển hoá cholesterol. Hướng nghiên cứu về đặc điểm phân tử gen ApoB và bệnh FH trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.5. Phương pháp PCR kết hợp với giải trình tự xác định tính chất đột biến điểm liên quan đến bệnh FH
• 1.6. Phương pháp phân tích tổng hợp để xác định mối tương quan giữa tính chất đột biến trên một số gen liên quan đến bệnh FH
• 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Công cụ tin sinh học
• 2.2. Phương pháp
• 2.3. Khai thác dữ liệu
• 2.4. Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)
• 2.5. Khảo sát in silico
• 2.6. Khảo sát thực nghiệm
• 2.7. Xác định các dạng biến thể xuất hiện trên vùng trình tự exon 26 gen ApoB thuộc một số mẫu bệnh phẩm
• 2.8. Bước đầu thiết lập cấu trúc mô hình (3D) của chuỗi polypeptide (tương ứng exon 26 gen ApoB)
• 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
• 3.1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp
• 3.2. Tỉ lệ đột biến tổng thể trên bộ dữ liệu về gen ApoB
• 3.3. Tỉ lệ đột biến trên bộ dữ liệu về gen ApoB, xét theo một số phân hạng
• 3.4. Kết quả khảo sát In silico
• 3.5. Khảo sát thực nghiệm phân tích đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 26 trên gen ApoB
• 3.6. Đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 26 gen ApoB ở một số mẫu bệnh phẩm đại diện
• 3.7. Bước đầu tạo mô phỏng cấu trúc protein ApoB của mẫu bệnh phẩm cao cholesterol đại diện
• 3.8. Tổng hợp dữ liệu phân tử của vùng trình tự 334 bp thuộc exon 26 gen ApoB trong 20 mẫu bệnh phẩm máu
• 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
• 4.1. Kết luận
• 4.2. Đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Gen APOB Exon 26 và Bệnh Cao Cholesterol

Bệnh cao cholesterol máu gia đình (FH) là một bệnh di truyền trội, dẫn đến rối loạn chuyển hóa LDL-cholesterol, làm tăng cao nồng độ LDL-Cholesterol trong máu. Đây là yếu tố nguy cơ gây ra các bệnh lý tim mạch, bệnh động mạch vành sớm. Theo WHO, bệnh lý thiếu máu cục bộ tim và bệnh tim mạch vành thuộc nhóm bệnh lý gây tử vong cao. Rối loạn chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu là nguyên nhân hình thành mảng xơ vữa, dẫn đến tắc nghẽn động mạch, làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành. Gen APOB đóng vai trò quan trọng trong cơ chế chuyển hóa cholesterol, đặc biệt là protein ApoB-100 và ApoB-48. Việc khảo sát đặc điểm phân tử của exon 26 gen APOB có ý nghĩa quan trọng trong việc dự đoán, tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh FH.

1.1. Vai trò của protein APOB trong vận chuyển cholesterol

Protein APOB (Apolipoprotein B) là thành phần cấu trúc chính của LDL. Nó giúp LDL liên kết với thụ thể LDL (LDLR) trên bề mặt tế bào để cholesterol có thể được vận chuyển vào bên trong tế bào. Đột biến trên gen APOB, đặc biệt là ở exon 26, có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein này, dẫn đến tăng nồng độ LDL cholesterol trong máu. Công bố của Knott và cộng sự (1985), Brown và cộng sự (1986) đã xác định một số dạng đột biến trên gen APOB gây nên bệnh FH, ở thể bệnh khiếm khuyết Apolipoprotein (Familial defective Apolipoprotein-100 – FDB).

1.2. Mối liên hệ giữa exon 26 gen APOB và rối loạn lipid máu

Exon 26 gen APOB là một vùng quan trọng của gen này, mã hóa một phần của protein APOB cần thiết cho chức năng của nó. Đột biến ở exon này có thể dẫn đến rối loạn chuyển hóa lipid máu, tăng cholesterol xấu (LDL-C) và giảm cholesterol tốt (HDL-C). Nghiên cứu tập trung khảo sát đặc điểm phân tử của exon 26 gen APOB, liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu, giúp cập nhật cơ sở khoa học tiền đề, có ý nghĩa khoa học thực tiễn trong hướng phát triển công cụ sinh học phân tử, hỗ trợ dự đoán, tiên lượng, chẩn đoán sớm bệnh FH.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Sớm Đột Biến Gen APOB

Mặc dù vai trò của gen APOB trong bệnh cao cholesterol máu đã được biết rõ, việc chẩn đoán sớm các đột biến trên gen này vẫn còn nhiều thách thức. Các phương pháp xét nghiệm di truyền hiện tại có chi phí cao và chưa được phổ biến rộng rãi ở Việt Nam. Bên cạnh đó, việc giải thích kết quả xét nghiệm và tư vấn di truyền cho bệnh nhân cũng đòi hỏi đội ngũ chuyên gia có trình độ cao. Việc xác định các biến thể gen APOB gây bệnh và phân biệt chúng với các biến thể lành tính là một thách thức lớn. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm phân tử của gen APOB ở người Việt Nam để cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh cao cholesterol máu.

2.1. Rào cản chi phí và tiếp cận xét nghiệm di truyền

Chi phí cho các xét nghiệm di truyền, đặc biệt là các xét nghiệm giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), còn khá cao so với thu nhập trung bình của người dân Việt Nam. Điều này gây khó khăn cho việc tiếp cận xét nghiệm di truyền để chẩn đoán bệnh FH và các bệnh lý di truyền khác. Bên cạnh đó, hệ thống bảo hiểm y tế ở Việt Nam chưa chi trả cho các xét nghiệm này, làm tăng thêm gánh nặng tài chính cho bệnh nhân.

2.2. Yêu cầu chuyên môn cao trong giải thích kết quả phân tích gen APOB

Kết quả phân tích gen APOB có thể phức tạp và khó giải thích, đặc biệt là khi phát hiện các biến thể gen APOB chưa được biết rõ vai trò trong bệnh sinh. Việc xác định liệu một biến thể gen APOB cụ thể có gây bệnh hay không đòi hỏi các chuyên gia có kiến thức sâu về di truyền học, sinh học phân tử và y học lâm sàng. Tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình cũng rất quan trọng để giúp họ hiểu rõ về nguy cơ di truyền bệnh và đưa ra các quyết định điều trị phù hợp.

III. Phương Pháp Phân Tích Gen APOB Exon 26 Bằng PCR và Giải Trình Tự

Phương pháp PCR kết hợp với giải trình tự là một công cụ mạnh mẽ để phân tích gen APOB, đặc biệt là vùng exon 26. PCR (phản ứng chuỗi polymerase) cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể từ mẫu bệnh phẩm. Sau đó, giải trình tự được sử dụng để xác định trình tự nucleotide của đoạn DNA được khuếch đại. Bằng cách so sánh trình tự này với trình tự tham chiếu, có thể phát hiện các đột biến gen APOB, bao gồm các thay thế nucleotide, mất đoạn hoặc thêm đoạn. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện cả những đột biến hiếm gặp.

3.1. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu cho exon 26 gen APOB

Việc thiết kế mồi PCR là bước quan trọng để đảm bảo rằng chỉ có vùng exon 26 gen APOB được khuếch đại. Mồi PCR phải có trình tự bổ sung với vùng DNA ở hai đầu của exon này. Các yếu tố như chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy và hàm lượng GC phải được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả khuếch đại cao và tránh khuếch đại các vùng DNA không đặc hiệu.

3.2. Quy trình giải trình tự và phân tích dữ liệu

Sau khi PCR, sản phẩm được làm sạch và chuẩn bị cho giải trình tự. Có nhiều công nghệ giải trình tự khác nhau, nhưng phương pháp Sanger vẫn là phương pháp phổ biến nhất. Sau khi có trình tự, các phần mềm phân tích dữ liệu tin sinh học được sử dụng để so sánh trình tự với trình tự tham chiếu và phát hiện các đột biến. Phân tích tổng hợp được thực hiện để xác định mối tương quan giữa tính chất đột biến trên một số gen liên quan đến bệnh FH.

3.3. Tối ưu hóa điều kiện PCR để tăng độ chính xác

Để đảm bảo kết quả PCR chính xác, cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, bao gồm: nồng độ Mg2+, nồng độ dNTP, nhiệt độ ủ mồi, thời gian kéo dài và số chu kỳ PCR. Sử dụng enzyme polymerase có độ chính xác cao cũng rất quan trọng để giảm thiểu sai sót trong quá trình khuếch đại. Việc kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose là cần thiết để đảm bảo rằng chỉ có sản phẩm có kích thước mong muốn được sử dụng cho giải trình tự.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Xác Định Đột Biến Trên Mẫu Bệnh Phẩm

Nghiên cứu này khảo sát thực nghiệm bằng quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đặc điểm phân tử trên vùng trình tự exon 26 gen APOB của một số mẫu máu của bệnh nhân Việt Nam. Các mẫu máu được thu thập từ bệnh nhân có hoặc không có chỉ số sinh hóa máu bất thường về lượng cholesterol trong máu. Mục tiêu là xác định các dạng biến thể xuất hiện trên vùng trình tự này và đánh giá mối liên quan của chúng với bệnh cao cholesterol máu. Bước đầu thiết lập cấu trúc mô hình (3D) của chuỗi polypeptide được mã hóa bởi exon 26 gen APOB thuộc trình tự tham chiếu và thuộc một số mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân Việt Nam.

4.1. Thu thập và chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Mẫu máu được thu thập từ bệnh nhân có và không có bệnh cao cholesterol máu. DNA được chiết tách từ mẫu máu và kiểm tra chất lượng. Việc đảm bảo chất lượng DNA là rất quan trọng để có kết quả PCR và giải trình tự chính xác. DNA phải có độ tinh khiết cao và không bị phân mảnh.

4.2. Kết quả phân tích đột biến exon 26 gen APOB ở mẫu bệnh phẩm

Sau khi thực hiện PCR và giải trình tự, các kết quả được phân tích để xác định các đột biến có mặt trong mẫu bệnh phẩm. Các đột biến này được so sánh với các dữ liệu đã biết để xác định xem chúng có liên quan đến bệnh cao cholesterol máu hay không. Các đột biến mới được phát hiện có thể cần được nghiên cứu thêm để xác định vai trò của chúng trong bệnh sinh.

4.3. So sánh trình tự gen với cơ sở dữ liệu NCBI

Trình tự gen APOB (NP_000375.3) trên cơ sở dữ liệu NCBI được dùng làm chuẩn để so sánh, tìm ra sự khác biệt với mẫu bệnh phẩm. Dữ liệu và phân tích tổng hợp được khai thác, xác định chỉ số Proportion phản ánh mức độ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB trên người bệnh cao cholesterol trong máu.

V. Bước Đầu Xây Dựng Mô Hình Cấu Trúc 3D Protein APOB Đột Biến

Việc xây dựng mô hình cấu trúc 3D của protein APOB, đặc biệt là vùng tương ứng với exon 26, có thể giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của các đột biến. Các đột biến có thể làm thay đổi cấu trúc protein, ảnh hưởng đến khả năng tương tác của nó với các protein khác hoặc với lipid. Mô hình cấu trúc có thể giúp dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng protein và từ đó, phát triển các phương pháp điều trị nhắm vào protein đột biến.

5.1. Sử dụng công cụ tin sinh học để mô phỏng cấu trúc protein

Các công cụ tin sinh học như SWISS-MODEL có thể được sử dụng để xây dựng mô hình cấu trúc 3D của protein APOB dựa trên trình tự amino acid. Các công cụ này sử dụng các thuật toán phức tạp để dự đoán cấu trúc protein dựa trên các cấu trúc đã biết của các protein tương tự. Mô hình cấu trúc được xây dựng phải được kiểm tra và đánh giá để đảm bảo độ tin cậy.

5.2. Phân tích ảnh hưởng của đột biến đến cấu trúc và chức năng protein

Sau khi có mô hình cấu trúc, có thể phân tích ảnh hưởng của các đột biến đến cấu trúc và chức năng protein. Các đột biến có thể làm thay đổi hình dạng của protein, làm gián đoạn các liên kết quan trọng hoặc ảnh hưởng đến khả năng tương tác của protein với các protein khác hoặc với lipid. Phân tích này có thể giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của các đột biến và từ đó, phát triển các phương pháp điều trị nhắm vào protein đột biến.

5.3. Cấu trúc protein ApoB NP_000375.3 trên công cụ SWISS Model

Mô hình cấu trúc 3D protein ApoB được xây dựng trên công cụ SWISS Model cho thấy vùng polypeptide tương ứng với exon 26 gen ApoB có các đột biến khác nhau ở các mẫu bệnh nhân khác nhau. Nghiên cứu này tập trung khảo sát in silico và thực nghiệm nhằm xác định đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 26 trên gen APOB, đóng góp vào việc phát triển các công cụ chẩn đoán và điều trị bệnh FH.

VI. Tiềm Năng Ứng Dụng và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Gen APOB

Nghiên cứu về đặc điểm phân tử của exon 26 gen APOB có tiềm năng ứng dụng lớn trong việc chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh cao cholesterol máu. Việc xác định các đột biến gây bệnh có thể giúp chẩn đoán sớm bệnh FH và đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời. Nghiên cứu này cũng có thể mở ra các hướng nghiên cứu mới về cơ chế bệnh sinh của bệnh cao cholesterol máu và phát triển các phương pháp điều trị nhắm vào protein APOB.

6.1. Phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác

Các phương pháp chẩn đoán dựa trên PCR và giải trình tự có thể được phát triển thành các xét nghiệm nhanh và chính xác để sàng lọc bệnh FH trong cộng đồng. Các xét nghiệm này có thể được thực hiện trên mẫu máu khô hoặc mẫu nước bọt, giúp đơn giản hóa quy trình thu thập mẫu và giảm chi phí.

6.2. Nghiên cứu về tương tác gen môi trường và phát triển liệu pháp cá nhân hóa

Nghiên cứu về tương tác giữa gen APOB và các yếu tố môi trường như chế độ ăn uống và lối sống có thể giúp phát triển các liệu pháp cá nhân hóa cho bệnh nhân cao cholesterol máu. Các liệu pháp này có thể bao gồm thay đổi chế độ ăn uống, tăng cường tập thể dục và sử dụng thuốc để giảm cholesterol.

6.3. Tầm quan trọng của tư vấn di truyền và phòng ngừa bệnh di truyền

Tư vấn di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc giúp bệnh nhân và gia đình hiểu rõ về nguy cơ di truyền bệnh và đưa ra các quyết định phù hợp về sinh sản và chăm sóc sức khỏe. Các biện pháp phòng ngừa bệnh di truyền như sàng lọc trước sinh và thụ tinh trong ống nghiệm có thể được sử dụng để giảm nguy cơ sinh con mắc bệnh FH.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một bệnh lý di truyền trội thường gặp, gây rối loạn chuyển hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), dẫn đến sự gia tăng nồng độ cholesterol LDL (LDL-C) trong huyết tương. Tình trạng tích tụ lipid kéo dài là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hình thành các mảng xơ vữa động mạch, dẫn đến bệnh tim mạch (Cardiovascular Diseases - CVD), bệnh thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease - CAD) và bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD). Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), các bệnh lý tim mạch chiếm tới 37% trong tổng số 17 triệu ca tử vong sớm do bệnh không lây nhiễm vào năm 2015. Bệnh FH biểu hiện ở hai thể lâm sàng: thể dị hợp tử (HeFH) với tần suất xuất hiện trong quần thể từ 1/200 đến 1/500, làm gia tăng nguy cơ biến cố mạch vành trước 50 tuổi ở nam và trước 60 tuổi ở nữ; thể đồng hợp tử (HoFH) có tần suất hiếm gặp hơn (khoảng 1/160.000 đến 1/100.000) nhưng gây nguy cơ tử vong sớm trước 30 tuổi do nồng độ cholesterol toàn phần thường xuyên vượt ngưỡng 500 mg/dL (>13 mmol/L).

Bên cạnh các yếu tố môi trường và lối sống, căn nguyên cốt lõi của FH xuất phát từ các đột biến trên các gen tham gia vào con đường chuyển hóa lipid, bao gồm thụ thể LDL (LDLR), proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) và apolipoprotein B (ApoB). Trong đó, gen ApoB mã hóa cho protein ApoB-100 đóng vai trò là phối tử thiết yếu gắn kết giữa hạt lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) với thụ thể LDLR tại tế bào gan. Các đột biến sai nghĩa hoặc biến đổi cấu trúc tại exon 26 gen ApoB dẫn đến hội chứng khiếm khuyết phối tử apolipoprotein B-100 có tính gia đình (Familial Defective Apolipoprotein B-100 - FDB), làm suy giảm nghiêm trọng khả năng thanh thải LDL khỏi tuần hoàn máu.

Từ bối cảnh thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp tiến hành đề tài: "Khảo sát đặc điểm phân tử thuộc exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu".

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát đặc điểm phân tử, bao gồm sự xuất hiện hay không xuất hiện các dạng đột biến điểm (thay thế nucleotide, mất nucleotide, gắn chèn nucleotide) trên vùng trình tự mục tiêu exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol máu (trọng tâm là bệnh FH) dựa trên cơ sở tổng hợp dữ liệu khoa học quốc tế và thực nghiệm trên một số mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu được triển khai qua 4 nội dung cụ thể:

1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp (meta-analysis) nhằm xác định chỉ số tỷ lệ gộp (Proportion) phản ánh mức độ xuất hiện các đột biến điểm trên gen ApoB ở bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính gia đình trên quy mô toàn cầu.
2. Khảo sát in silico đặc tính cặp mồi nhằm thiết lập quy trình phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại đặc hiệu vùng trình tự mục tiêu exon 26 gen ApoB.
3. Khảo sát thực nghiệm bằng quy trình PCR kết hợp giải trình tự Sanger nhằm xác định đặc điểm biến dị nucleotide trên vùng trình tự exon 26 gen ApoB từ các mẫu máu bệnh nhân Việt Nam có hoặc không có chỉ số sinh hóa máu bất thường.
4. Bước đầu mô phỏng cấu trúc không gian ba chiều (3D) của chuỗi polypeptide được mã hóa bởi exon 26 gen ApoB ở trình tự tham chiếu và mẫu bệnh phẩm mang biến thể.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Trình tự nucleotide vùng exon 26 gen ApoB ở người và các biến thể phân tử liên quan đến bệnh FH; 20 mẫu bệnh phẩm máu thu thập từ các bệnh nhân tại các bệnh viện thuộc khu vực Thành phố Hồ Chí Minh (thuộc đề tài nghiên cứu khoa học mã số T2015.181 của Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh).
• Phạm vi nghiên cứu: Dữ liệu y văn quốc tế dạng nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) được cập nhật đến tháng 6 năm 2020; các khảo sát thực nghiệm sinh học phân tử và mô phỏng tin sinh học được tiến hành và hoàn thành trong năm 2020 tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nền tảng lý thuyết của khóa luận dựa trên sinh học phân tử về con đường vận chuyển cholesterol nội sinh và ngoại sinh. Các hạt lipoprotein gồm VLDL, LDL và HDL thực hiện điều hòa hàm lượng lipid. Phân tử LDL được vận chuyển tới các mô ngoại vi hoặc gan thông qua sự nhận diện giữa thụ thể LDLR (nằm trên nhiễm sắc thể 19) và phối tử ApoB-100. Protein ApoB-100 gồm 4.563 axit amin, được mã hóa bởi gen ApoB nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (kích thước khoảng 43 kb, bao gồm 29 exon và 28 intron). Vùng exon 26 có kích thước lớn, chứa các đoạn trình tự mã hóa cho miền tương tác giữa ApoB và thụ thể LDLR. Các đột biến điểm tại hoặc xung quanh vị trí codon 3500 (vị trí cập nhật trên danh pháp quốc tế là 3527), tiêu biểu là R3500Q (thay thế arginine bằng glutamine) hay R3500W (thay thế arginine bằng tryptophan), làm protein mất khả năng liên kết với LDLR, trực tiếp gây bệnh FDB.

Phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa công cụ tin sinh học và thực nghiệm sinh học phân tử:

1. Phương pháp khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp (Meta-analysis):

• Tiến hành thu thập tài liệu khoa học trên các cơ sở dữ liệu NCBI, PubMed và Google Scholar theo quy trình lựa chọn PRISMA. Các từ khóa tìm kiếm gồm: Familial hypercholesterolemia, Apolipoprotein B, Coronary Artery Disease, Cardiovascular Diseases, HeFH, HoFH, ApoB.
• Tiêu chí lựa chọn: Các công bố là nghiên cứu đoàn hệ (cohort study), xuất bản bằng tiếng Anh hoặc tiếng Việt, có số liệu rõ ràng về số lượng mẫu bệnh nhân FH và số ca mang đột biến gen ApoB, áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR-giải trình tự, Realtime-PCR, MLPA hoặc NGS.
• Phân tích thống kê: Sử dụng phần mềm MedCalc phiên bản 19.1 để tính toán chỉ số tỷ lệ gộp (Proportion) và khoảng tin cậy 95% (95% CI). Tính bất đồng nhất giữa các nghiên cứu được đánh giá qua phép kiểm định Chi-bình phương (Q) và chỉ số bất đồng nhất $I^2$. Mô hình hiệu ứng ngẫu nhiên (Random effects model - R) được lựa chọn khi $I^2$ cao; biểu đồ rừng (Forest plot) và biểu đồ phễu (Funnel plot) được dùng để trực quan hóa kết quả và đánh giá độ phân tán sai số.

2. Phương pháp phân tích in silico:

• Trình tự gen tham chiếu được truy xuất từ cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bao gồm mã định danh nhiễm sắc thể NC_000002.12, trình tự gen hệ thống NG_011793.1 và trình tự mRNA NM_000384.3.
• Sử dụng các công cụ BioEdit phiên bản 7.2, Annhyb phiên bản 4.946 và BLAST để phân tích độ tương đồng trình tự, xác định vị trí exon 26 và đánh giá các thông số vật lý của cặp mồi khuếch đại (chiều dài, nhiệt độ nóng chảy Tm, tỷ lệ %GC, tính đặc hiệu).
• Sử dụng công cụ SWISS-MODEL và cơ sở dữ liệu cấu trúc PDB để dựng mô hình không gian 3D của chuỗi polypeptide dựa trên chuỗi protein tham chiếu NP_000375.3.

3. Phương pháp khảo sát thực nghiệm:

• Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ sinh phẩm TopPURE Blood DNA Extraction KIT (công ty ABT) trên 200 µL máu toàn phần hoặc huyết thanh theo nguyên lý hấp phụ trên màng silica.
• Đánh giá chất lượng DNA: Đo mật độ quang phổ (OD) tại các bước sóng 260 nm và 280 nm; độ tinh sạch được xác định qua tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ (ngưỡng tiêu chuẩn từ 1,8 đến 2,0); nồng độ DNA được tính theo công thức: $C\ (\mu\text{g/mL}) = 50 \times A_{260} \times d$ (với $d$ là độ pha loãng).
• Phản ứng khuếch đại PCR: Phản ứng có tổng thể tích 50 µL, chứa 25 µL Master mix 2X (Bioline), 2 µL mồi xuôi ApoB-F (10 µM), 2 µL mồi ngược ApoB-R (10 µM), DNA khuôn và nước cất pha tiêm. Chu trình nhiệt gồm: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; tiếp nối bằng 35 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, gắn mồi ở 54°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 30 giây; kéo dài lần cuối ở 72°C trong 10 phút.
• Điện di gel agarose: Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose với chất nhuộm GelRed 6X, đối chiếu thang chuẩn ADN 50 bp (Bioline).
• Giải trình tự Sanger và xử lý dữ liệu: Sản phẩm PCR kích thước 334 bp được gửi giải trình tự hai chiều tại Công ty Cổ phần Công nghệ TBR. Sắc ký đồ được đọc bằng phần mềm Chromas phiên bản 2.1, sau đó gióng hàng và phát hiện đột biến điểm thông qua phần mềm CodonCode Aligner và BioEdit 7.2 khi so sánh với trình tự chuẩn NG_011793.1.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tập trung trình bày tổng quan về bệnh học cao cholesterol máu và cơ chế di truyền phân tử:

• Khái quát về chức năng sinh học của cholesterol, phân loại các hạt lipoprotein (HDL, LDL, VLDL) và sự nguy hiểm của rối loạn chuyển hóa lipid đối với các bệnh tim mạch xơ vữa.
• Phân tích chi tiết bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (FH), nhấn mạnh sự khác biệt giữa thể dị hợp HeFH và thể đồng hợp HoFH về nồng độ lipid huyết tương, thời điểm phát bệnh cũng như nguy cơ tử vong sớm do tắc nghẽn mạch vành.
• Hệ thống hóa các gen đích gây bệnh FH gồm LDLR, PCSK9 và ApoB. Trong đó, thụ thể LDLR bị chia thành 5 nhóm sai hỏng chính (từ mất hoàn toàn tổng hợp đến suy giảm khả năng tái tuần hoàn màng tế bào). Đối với gen ApoB, các tài liệu quốc tế (từ các công bố kinh điển của Knott, Brown, Innerarity đến Whitfield) đã chỉ ra rằng các đột biến điểm tập trung tại exon 26 làm suy giảm ái lực gắn kết của ApoB-100 với LDLR, dẫn đến bệnh FDB.
• Khái quát các kỹ thuật phát hiện đột biến phân tử đã và đang được triển khai trên thế giới và tại Việt Nam, bao gồm PCR kết hợp giải trình tự Sanger, AS-PCR, Realtime-PCR, MLPA, SSCP và NGS.
• Nêu rõ cơ sở lý thuyết và tính cần thiết của phương pháp phân tích tổng hợp (meta-analysis) trong y học thực chứng để giải quyết sự sai lệch do kích thước mẫu, phương pháp hoặc chủng tộc giữa các công bố khoa học đơn lẻ.

Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và hệ thống công cụ hỗ trợ:

• Trình bày thông tin 20 mẫu bệnh phẩm máu thu nhận từ các bệnh nhân tại Thành phố Hồ Chí Minh thuộc đề tài T2015.181, có ghi nhận các chỉ số sinh hóa máu (cholesterol toàn phần, HDL-C, LDL-C, triglyceride).
• Danh mục hóa chất và thiết bị phòng thí nghiệm: Máy luân nhiệt PCR, máy ly tâm lạnh, máy đo quang phổ hấp thụ, bể điện di agarose, kit tách chiết TopPURE Blood DNA Extraction KIT, thang chuẩn 50 bp, Master mix 2X.
• Thiết lập quy trình khai thác dữ liệu qua PRISMA và thuật toán meta-analysis trên MedCalc 19.1 nhằm ước tính tỷ lệ đột biến gộp cùng phân tích bất đồng nhất $I^2$.
• Quy chuẩn hóa các thao tác thực nghiệm: Quy trình 8 bước tách chiết DNA bằng cột silica; công thức và điều kiện đo độ tinh sạch DNA; thành phần phản ứng PCR thể tích 50 µL và chu trình luân nhiệt tối ưu ở nhiệt độ gắn mồi 54°C.
• Quy trình phân tích dữ liệu phân tử: Sử dụng Chromas v2.1 kiểm tra chất lượng đỉnh tín hiệu của sắc ký đồ giải trình tự, sử dụng CodonCode Aligner để gióng hàng đối chiếu với trình tự tham chiếu NG_011793.1 nhằm phát hiện chính xác các vị trí đột biến điểm, mất đoạn hoặc chèn nucleotide. Tiếp đó là phương pháp dựng mô hình không gian 3D trên SWISS-MODEL từ trình tự protein tham chiếu NP_000375.3.

Chương 3: Kết quả – Thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các hướng nghiên cứu:

• Phân tích tổng hợp (Meta-analysis):

  • Từ 45 công bố khoa học ban đầu, quy trình PRISMA chọn lọc được 28 nghiên cứu đoàn hệ (tổng số 38.868 mẫu bệnh nhân FH). Phân tích trên MedCalc cho thấy chỉ số bất đồng nhất $I^2 = 99,96%$ ($p < 0,0001$). Do tính bất đồng nhất cao, mô hình hiệu ứng ngẫu nhiên (R) được áp dụng, ghi nhận tỷ lệ đột biến gộp trên gen ApoB là 22,067% (95% CI: 3,497% - 50,454%). Tỷ lệ đột biến giữa các nghiên cứu riêng lẻ dao động từ 0,01% đến 100%.
  • Sau khi sàng lọc và loại bỏ 6 nghiên cứu có độ lệch biên độ quá lớn (các nghiên cứu của Du et al., 2016; Han et al., 2015; Futema et al., 2014; Futema et al., 2012; Pecin et al., 2011; Kalina et al., 2001), bộ dữ liệu còn lại 22 nghiên cứu đoàn hệ (17.480 mẫu FH). Kết quả phân tích lần 2 theo mô hình ngẫu nhiên ghi nhận tỷ lệ đột biến gộp là 28,316% (95% CI: 6,169% - 58,539%, $Chi^2 = 24426,57$, $df = 21$, $p < 0,0001$, $I^2 = 99,91%$).
  • Phân tích phân nhóm (subgroup analysis) chỉ ra sự phụ thuộc của tỷ lệ đột biến vào phương pháp và khu vực địa lý: Phương pháp PCR-giải trình tự ghi nhận tỷ lệ 37,68% (bộ 28 nghiên cứu) và 12,50% (bộ 22 nghiên cứu); Realtime-PCR ghi nhận 30,83%; phương pháp NGS đạt 5,19%. Về loại đột biến, đột biến R3500Q/R3527Q chiếm ưu thế với 16,35% (bộ 28 nghiên cứu) và 12,90% (bộ 22 nghiên cứu). Theo địa lý, tỷ lệ đột biến ở Châu Âu là 25,49% (bộ 28 bài) và 14,29% (bộ 22 bài); ở Châu Á là 16,18% (bộ 28 bài) và 16,47% (bộ 22 bài). Ở nhóm bệnh nhân có nồng độ cholesterol toàn phần $\ge 5$ mmol/L, tỷ lệ đột biến đạt 29,53%.

• Khảo sát in silico:

  • Trên gen ApoB tham chiếu (NG_011793.1), exon 26 kéo dài từ nucleotide 36.198 đến 43.768. Vùng trình tự bao quanh codon đột biến then chốt R3500Q/R3527Q được định vị từ nucleotide 6.216 đến 6.549 (sau cắt), có độ dài 334 bp (tương ứng vùng 10.779 bp trên NM_000384.3).
  • Cặp mồi được lựa chọn có độ tương đồng 100% với trình tự đích: Mồi xuôi ApoB-F (5'-GACCACAAGCTTAGCTTGG-3', vị trí 6216–6234, Tm = 56,6°C) và mồi ngược ApoB-R (5'-GGGTGGCTTTGCTTGTATG-3', vị trí 6531–6549).

• Khảo sát thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm:

  • 20 mẫu DNA tách chiết đều đạt độ tinh sạch với tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0.
  • Phản ứng PCR khuếch đại thành công vùng exon 26; kết quả điện di gel agarose cho thấy một băng DNA duy nhất, sáng rõ, kích thước đạt chuẩn 334 bp.
  • Kết quả giải trình tự và gióng hàng bằng CodonCode Aligner đã phát hiện các biến thể điểm tại các mẫu đại diện: Mẫu M13 (bệnh nhân 35 tuổi, cholesterol toàn phần 6,38 mmol/L) xuất hiện 5 biến thể điểm gồm c.10495G>A (D3499B), c.10550C>G (A3517G), c.10556C>A (T3519B), c.10560C>A (Y3520STP tạo mã kết thúc sớm) và c.10575C>A (S3525R); mẫu M17 mang 2 biến thể gồm c.10495G>A (D3499B) và c.10505G>A (G3502D).

• Mô phỏng cấu trúc protein 3D:

  • Sử dụng SWISS-MODEL tái hiện cấu trúc không gian 3D của chuỗi polypeptide tương ứng vùng exon 26 từ trình tự tham chiếu NP_000375.3 và chuỗi polypeptide mang biến thể của mẫu M17, cho thấy sự thay đổi tương tác trong cấu trúc không gian của protein ApoB.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã tổng hợp các số liệu định lượng cụ thể từ cả hai hướng tiếp cận phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm:

Hạng mục khảo sát	Quy mô mẫu / Thông số	Kết quả ghi nhận
Meta-analysis (Bộ 28 nghiên cứu)	38.868 mẫu bệnh nhân FH	Tỷ lệ đột biến gộp: 22,067% (95% CI: 3,497% - 50,454%; $I^2 = 99,96%$)
Meta-analysis (Bộ 22 nghiên cứu sau lọc)	17.480 mẫu bệnh nhân FH	Tỷ lệ đột biến gộp: 28,316% (95% CI: 6,169% - 58,539%; $I^2 = 99,91%$)
Tỷ lệ đột biến R3500Q/R3527Q gộp	24 nghiên cứu đoàn hệ	16,35% (95% CI: 5,51% - 31,46%)
Đột biến ở phân nhóm Châu Á	5 nghiên cứu đoàn hệ	16,18% (bộ 28 bài) và 16,47% (bộ 22 bài)
Kích thước đoạn khuếch đại exon 26	Cặp mồi ApoB-F/R	334 bp (vị trí 6216–6549 trên NG_011793.1)
Độ tinh sạch DNA tách chiết thực nghiệm	20 mẫu máu bệnh nhân	$OD_{260}/OD_{280}$ dao động trong khoảng 1,8 – 2,0
Biến thể phát hiện trên mẫu đại diện M13	Giải trình tự Sanger	5 biến thể điểm: c.10495G>A, c.10550C>G, c.10556C>A, c.10560C>A, c.10575C>A
Biến thể phát hiện trên mẫu đại diện M17	Giải trình tự Sanger	2 biến thể điểm: c.10495G>A và c.10505G>A

Các đóng góp khoa học chính của khóa luận:

• Cung cấp dữ liệu định lượng có tính hệ thống về tỷ lệ đột biến gen ApoB trên bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính gia đình thông qua phân tích tổng hợp y văn quốc tế, chỉ ra mức độ phổ biến của đột biến R3500Q/R3527Q và sự sai biệt giữa các kỹ thuật xét nghiệm cũng như giữa các vùng địa lý.
• Tối ưu hóa thành công quy trình thực nghiệm PCR khuếch đại đoạn 334 bp thuộc exon 26 gen ApoB, bảo đảm tính đặc hiệu cao từ mẫu máu lâm sàng.
• Bổ sung dữ liệu phân tử thực tế về các dạng biến thể điểm trên exon 26 gen ApoB ở người Việt Nam, đóng góp cơ sở dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu dịch tễ học phân tử trong nước.
• Bước đầu kết nối dữ liệu biến đổi nucleotide với mô hình cấu trúc không gian 3D protein bằng công cụ SWISS-MODEL, tạo tiền đề phân tích cơ chế sai hỏng phối tử ApoB-100.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có một số hạn chế cụ thể được ghi nhận:

• Kích thước mẫu thực nghiệm còn hạn chế, mới chỉ khảo sát trên 20 mẫu bệnh phẩm máu thu thập tại khu vực Thành phố Hồ Chí Minh, chưa mang tính đại diện cao cho toàn bộ quần thể bệnh nhân FH tại Việt Nam.
• Phạm vi khảo sát thực nghiệm tập trung vào đoạn trình tự 334 bp bao quanh codon 3500 thuộc exon 26 gen ApoB, chưa bao phủ toàn bộ 29 exon của gen ApoB và chưa phân tích đồng thời các gen liên quan mật thiết khác như LDLR hay PCSK9.
• Chỉ số bất đồng nhất ($I^2$) trong phân tích tổng hợp ở mức rất cao (>99%), phản ánh sự khác biệt lớn về tiêu chuẩn chọn mẫu bệnh nhân, nồng độ lipid nền và kỹ thuật phát hiện giữa các nghiên cứu đoàn hệ trên thế giới.

Hướng nghiên cứu mở rộng:

• Mở rộng quy mô mẫu thu thập trên các nhóm bệnh nhân có chỉ số lâm sàng cao cholesterol máu tại nhiều trung tâm y tế khác nhau trên cả nước.
• Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để khảo sát toàn bộ các vùng mã hóa của gen ApoB kết hợp với LDLR và PCSK9.
• Nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ kiểu gen - kiểu hình và thực nghiệm đánh giá chức năng liên kết sinh học của các protein mang biến thể mới phát hiện.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

• Giảng viên, sinh viên và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Hóa sinh lâm sàng và Y học Di truyền trong việc tiếp cận phương pháp luận phân tích đột biến gen gây bệnh chuyển hóa.
• Các nghiên cứu sinh và cán bộ kỹ thuật xét nghiệm y sinh cần tham khảo quy trình thực nghiệm PCR khuếch đại đoạn 334 bp exon 26 gen ApoB, kỹ thuật kiểm soát chất lượng DNA và phương pháp gióng hàng đọc sắc ký đồ giải trình tự Sanger.
• Những người thực hiện các đề tài tổng quan hệ thống và y học thực chứng, cung cấp quy trình phân tích meta-analysis trên phần mềm MedCalc từ khâu lọc bài theo PRISMA, kiểm định $I^2$ đến xây dựng biểu đồ Forest plot và Funnel plot.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao exon 26 của gen ApoB lại được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu trọng tâm trong đề tài? Exon 26 là exon có kích thước lớn nhất trên gen ApoB và mã hóa cho vùng domain protein trực tiếp tham gia vào quá trình gắn kết giữa phối tử ApoB-100 với thụ thể LDLR trên màng tế bào. Các tài liệu khoa học quốc tế xác định các đột biến điểm nổi trội gây thể bệnh khiếm khuyết apolipoprotein B-100 (FDB) tập trung dày đặc tại exon này, điển hình là các đột biến tại hoặc lân cận codon 3500 (như R3500Q, R3500W, R3527Q), làm giảm thanh thải LDL và trực tiếp gây tăng cholesterol máu.

2. Kết quả phân tích tổng hợp (meta-analysis) ghi nhận tỷ lệ đột biến gen ApoB ở bệnh nhân FH trên thế giới là bao nhiêu? Trong bộ dữ liệu 28 nghiên cứu đoàn hệ ban đầu (38.868 bệnh nhân FH), tỷ lệ đột biến gộp được xác định là 22,067% (95% CI: 3,497% - 50,454%; mô hình hiệu ứng ngẫu nhiên R). Sau khi lọc bỏ 6 nghiên cứu có độ biến thiên ngoại lai, bộ dữ liệu 22 nghiên cứu đoàn hệ (17.480 bệnh nhân FH) cho tỷ lệ đột biến gộp là 28,316% (95% CI: 6,169% - 58,539%; mô hình R).

3. Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR có thông số kỹ thuật và trình tự như thế nào? Cặp mồi khuếch đại vùng exon 26 gen ApoB gồm:

• Mồi xuôi ApoB-F: 5'-GACCACAAGCTTAGCTTGG-3' (chiều dài 19 bp, vị trí bắt cặp 6216–6234, Tm = 56,6°C).
• Mồi ngược ApoB-R: 5'-GGGTGGCTTTGCTTGTATG-3' (chiều dài 19 bp, vị trí bắt cặp 6531–6549). Cặp mồi này có độ tương đồng 100% với trình tự tham chiếu NG_011793.1 và khuếch đại đoạn sản phẩm đặc hiệu dài 334 bp.

4. Khảo sát thực nghiệm giải trình tự trên mẫu bệnh phẩm Việt Nam đã phát hiện những đột biến điểm cụ thể nào ở mẫu đại diện M13 và M17?

• Mẫu M13 xuất hiện 5 biến thể điểm: c.10495G>A (D3499B), c.10550C>G (A3517G), c.10556C>A (T3519B), c.10560C>A (Y3520STP tạo mã kết thúc sớm) và c.10575C>A (S3525R).
• Mẫu M17 xuất hiện 2 biến thể điểm: c.10495G>A (D3499B) và c.10505G>A (G3502D).

5. Tiêu chuẩn lựa chọn các công bố khoa học đưa vào phân tích meta-analysis trong nghiên cứu gồm những gì? Các công bố được chọn lọc phải là các nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) viết bằng tiếng Anh hoặc tiếng Việt, có đối tượng là bệnh nhân cao cholesterol máu liên quan đến FH, gen mục tiêu là ApoB, có đầy đủ số liệu về cỡ mẫu và số ca đột biến dương tính/âm tính, sử dụng các phương pháp sinh học phân tử rõ ràng (như PCR-giải trình tự, Realtime-PCR, NGS, MLPA) và có thông tin về chủng tộc, nguồn gốc mẫu máu cùng các chỉ số lipid máu lâm sàng.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành việc khảo sát đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 26 gen ApoB thông qua sự kết hợp giữa phân tích tổng hợp y văn quốc tế và thực nghiệm sinh học phân tử trên mẫu máu lâm sàng tại Việt Nam. Kết quả meta-analysis trên 22 nghiên cứu đoàn hệ đã xác định tỷ lệ đột biến gộp trên gen ApoB ở bệnh nhân FH là 28,316%, trong đó dạng đột biến R3500Q/R3527Q chiếm ưu thế. Trên phương diện thực nghiệm, nghiên cứu đã tối ưu thành công phản ứng PCR khuếch đại đoạn 334 bp đặc hiệu và bước đầu phát hiện các biến thể điểm trên exon 26 ở các mẫu bệnh nhân trong nước, đồng thời mô phỏng biến đổi cấu trúc protein 3D bằng công cụ tin sinh học. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tiền đề phục vụ cho hướng phát triển các công cụ chẩn đoán phân tử sớm bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Familial hypercholesterol (FH) là bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình, là một dạng bệnh di truyền trội, dẫn đến rối loạn chuyển hoá LDL–cholesterol với biểu hiện tăng cao nồng độ LDL–Cholesterol trong máu và là yếu tố nguy cơ gây ra bệnh lý tim mạch (Cardiovascular Diseases – CVD), bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Diseases – CAD),… Theo tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), bệnh lý thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD), bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease –CHD) thuộc nhóm bệnh lý gây tử vong cao trên thế giới. Sự rối loạn chuyển hoá lipid, cholesterol trong máu (>5 mmol/L) là nguyên nhân hình thành mảng xơ vữa tích tụ trong thành mạch máu, dẫn đến tắc nghẽn các động mạch và động mạch chủ, là nguy cơ dẫn đến bệnh lý thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD) hoặc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease – CHD) [1,2,3] Bệnh cao cholesterol mang tính gia đình (FH) có hai dạng là đồng hợp và dị hợp, trong đó tỉ lệ thể dị hợp FH là 1/200, tỉ lệ đồng hợp FH xấp xỉ 1/160. Bệnh FH thể dị hợp làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch trước 50 tuổi ở nam và 60 tuổi ở nữ. Bệnh FH đồng hợp thường gây tử vong ở độ tuổi 30 [4].

Công bố khoa học của Jensen và cộng sự (1967) ghi nhận tỉ lệ mắc bệnh tim mạch vành là 45,1% trong nhóm bệnh nhân nam giới mắc FH ở Đan Mạch. Bên cạnh một số yếu tố dinh dưỡng, sự hạn chế vận động/ít tập thể dục và điều kiện môi trường sống, nguyên nhân chính của bệnh lý rối loạn chuyển hoá cholesterol trong máu theo hướng tăng cao bất thường là do sự xuất hiện tính chất đột biến ở các gen có vai trò trong cơ chế chuyển hoá cholesterol, điển hình là gen ApoB (Apolipoprotein B). Gen ApoB (Apolipoprotein B) định vị ở nhiễm sắc thể số 2, có kích thước khoảng 43kb, gồm 29 exon. Gen ApoB mã hoá protein ApoB–100 và ApoB–48, có chức năng là phối tử hình thành phức hợp giữa Low Density Lipoprotein (LDL) và Low Density Lipoprotein Receptoer (LDLR).

Công bố của Knott và cộng sự (1985), Brown và cộng sự (1986), Innerarity và cộng sự (1990), Whitfield và cộng sự (2004) xác định một số dạng đột biến 2 trên gen ApoB làm cho protein ApoB sai hỏng cấu trúc và chức năng – gây nên bệnh FH, ở thể bệnh khiếm khuyết Apolipoprotein (Familial defective Apolipoprotein-100 – FDB). Hòa cùng với xu hướng phát triển công cụ sinh học phân tử hỗ trợ dự đoán, tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh lý di truyền và kế thừa, kết hợp với các dữ liệu nghiên cứu cùng nhóm nghiên cứu, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện: “Khảo sát đặc điểm phân tử thuộc exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu”. Công trình nghiên cứu giúp cập nhật, hoàn thiện cơ sở khoa học tiền đề có ý nghĩa khoa học thực tiễn đối với ứng dụng trong hướng phát triển công cụ sinh học phân tử phù hợp để hỗ trợ trong dự đoán, tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh FH (bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình) ở Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm phân tử (có hoặc không có sự xuất hiện các đột biến điểm: thay thế nucleotide, mất nucleotide hoặc gắn chèn nucleotide) trên trình tự gen mục tiêu, đó là exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu – tiêu điểm cụ thể là bệnh FH một cách tổng thể dựa vào dữ liệu khoa học trên thế giới và trên một số mẫu bệnh phẩm ở Việt Nam.