Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Rối loạn lipid máu (RLLPM) là một trong những thách thức y tế công cộng lớn trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam do tỷ lệ mắc cao và mối liên hệ nhân quả với các bệnh lý tim mạch. Theo số liệu năm 2018 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người trưởng thành mắc RLLPM trên thế giới là 39%, trong đó tỷ lệ này tại châu Âu là 54%, châu Mỹ là 48%, châu Phi là 22,6% và khu vực Đông Nam Á là 29%. Tại Việt Nam, thống kê của Bộ Y tế năm 2015 chỉ ra có khoảng 30,2% dân số có nồng độ cholesterol toàn phần trong máu từ 5,0 mmol/L trở lên hoặc đang phải can thiệp bằng thuốc hạ cholesterol. RLLPM là căn nguyên chính dẫn tới quá trình hình thành và phát triển mảng vữa xơ động mạch; theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ, người mắc RLLPM có nguy cơ xuất hiện biến cố tim mạch cao gấp hai lần so với người có mức lipid máu bình thường. Năm 2019, thiếu máu cơ tim cục bộ gây tử vong cho 8,54 triệu người (trong đó 3,78 triệu ca liên quan đến nồng độ LDL-c cao) và đột quỵ do thiếu máu cục bộ khiến 2,73 triệu người tử vong (với 0,61 triệu ca liên quan đến mức LDL-c cao).

Trong điều trị RLLPM, enzym 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR) giữ vai trò là enzym giới hạn tốc độ của toàn bộ con đường sinh tổng hợp cholesterol nội sinh tại gan. Nhóm thuốc ức chế HMGCR (statin) như lovastatin, simvastatin, fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin hiện là liệu pháp đầu tay kinh điển. Tuy nhiên, việc sử dụng statin kéo dài ghi nhận nhiều phản ứng có hại trên lâm sàng: đau cơ (gặp ở khoảng 10% bệnh nhân), viêm cơ (0,1%), tiêu cơ vân cấp kèm suy thận (0,01%), tăng men transaminase gan (1–3%), tăng nguy cơ mắc đái tháo đường mới khởi phát từ 10% đến 20%, cùng nguy cơ gây dị tật thai nhi trong ba tháng đầu thai kỳ. Do đó, nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên mới có khả năng ức chế HMGCR với độ an toàn cao, ít tác dụng phụ để thay thế hoặc hỗ trợ statin là cấp thiết. Các polyphenol từ thực vật được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học có lợi trên hệ tim mạch và chuyển hóa lipid, song các công bố trước đây chủ yếu dừng lại ở thử nghiệm in vitro, còn thiếu dữ liệu mô phỏng tương tác ở quy mô phân tử với enzym đích HMGCR.

Khóa luận được xác định thuộc ngành Dược học, với hình thức nghiên cứu thiết kế/sàng lọc thuốc in silico (hóa tin học sinh học). Mục tiêu nghiên cứu được tác giả xác định cụ thể gồm hai nhiệm vụ:

  1. Sàng lọc các hợp chất polyphenol có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase bằng phương pháp docking phân tử.
  2. Đánh giá các đặc điểm giống thuốc và phân tích các thông số dược động học và độc tính của các hợp chất tốt nhất thu được sau quá trình sàng lọc.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Cấu trúc không gian 3 chiều phần xúc tác của enzym HMGCR người phức hợp với phối tử đồng kết tinh fluvastatin (mã PDB: 1HWI, độ phân giải 2,22 Å); cấu trúc hóa học của 150 hợp chất polyphenol tự nhiên và 7 thuốc nhóm statin chuẩn làm chứng dương (lovastatin, pravastatin, simvastatin, atorvastatin, fluvastatin, pitavastatin, rosuvastatin).
  • Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu mô phỏng trên máy tính (in silico), thực hiện tại Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, hoàn thành vào tháng 05 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

  • Sinh tổng hợp cholesterol và động học HMGCR: Cholesterol nội sinh được tổng hợp chủ yếu tại gan (chiếm 80%). Phản ứng biến đổi HMG-CoA thành mevalonate xúc tác bởi HMGCR là phản ứng giới hạn tốc độ chung của chu trình. Vị trí hoạt động của enzym HMGCR ở người nằm ở mặt phân cách giữa hai monomer, bao gồm túi liên kết cơ chất HMG (tạo bởi Ser684, Asp690, Lys691, Lys692, Asp767 của monomer này và Glu559, Lys735, Asn755, Leu853, His866 của monomer đối diện), túi liên kết CoA và túi liên kết NADPH.
  • Nhóm hợp chất polyphenol: Bao gồm các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật có khung mang các nhóm -OH gắn trực tiếp vào nhân thơm, chia thành 4 nhóm cấu trúc lớn: flavonoid, phenolic acid, stilbene và lignan.
  • Quy tắc 5 tiêu chí Lipinski: Đánh giá tính chất giống thuốc đường uống (drug-likeness) thông qua 5 thông số hóa lý:
    1. Khối lượng phân tử (MW) < 500 Da.
    2. Hệ số phân bố octanol/nước (LogP) < 5.
    3. Số nhóm cho liên kết hydro (H-bond donors) ≤ 5.
    4. Số nhóm nhận liên kết hydro (H-bond acceptors) ≤ 10.
    5. Độ khúc xạ mol (MR) nằm trong khoảng 40–130. Theo tiêu chuẩn sàng lọc của đề tài, phân tử đáp ứng ít nhất 2/5 tiêu chuẩn được xem là có tiềm năng phát triển thuốc đường uống.
  • Mô hình đánh giá dược động học và độc tính ADMET: Sử dụng nền tảng pkCSM dựa trên biểu diễn cấu trúc đồ thị phân tử để dự đoán 30 thông số về hấp thu qua ruột (HIA), tính thấm Caco2, thể tích phân bố (VDss), tính thấm hàng rào máu não (BBB), hệ thần kinh trung ương (CNS), ức chế cytochrom P450 (CYP2D6, CYP3A4), độ thanh thải toàn phần, cơ chất vận chuyển OCT2 tại thận, đột biến gen AMES, ức chế kênh kali hERG II tim mạch và độc tính cấp LD50 trên chuột.

Phương pháp nghiên cứu và công cụ kỹ thuật

Nghiên cứu sử dụng hệ thống phần cứng máy tính ThinkPad X250, hệ điều hành Windows 10 cùng các công cụ phần mềm chuyên dụng:

  • Chuẩn bị cấu trúc: Cấu trúc HMGCR (1HWI) được tách bỏ các phân tử nước và ligand fluvastatin bằng Discovery Studio Visualizer 4.0; bổ sung nguyên tử hydro phân cực, gán điện tích và trường lực Kollman bằng MGL Tools 1.5.6. Cấu trúc phối tử dạng 3D tải từ cơ sở dữ liệu PubChem dưới định dạng .sdf, chuyển sang .pdb bằng UCSF Chimera 1.14, tối ưu hóa hình học không gian bằng phương pháp Gradient liên hợp (Conjugate Gradients) trên phần mềm Avogadro và chuyển đổi sang định dạng .pdbqt.
  • Hộp lưới tương tác (Grid box): Thiết lập tại tâm tọa độ vị trí hoạt động x = 16,0; y = 1,0; z = 10,0; kích thước hộp lưới 20 × 20 × 20 Å; khoảng cách giữa các điểm lưới là 0,375 Å.
  • Thẩm định quy trình docking (Re-docking): Đánh giá độ tin cậy của thông số docking bằng cách dock lại ligand đồng kết tinh fluvastatin vào thụ thể 1HWI đã xử lý, tính toán độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) bằng phần mềm UCSF Chimera. Tiêu chuẩn quy trình đạt giá trị tin cậy khi RMSD < 1,5 Å.
  • Mô phỏng docking phân tử: Tiến hành trên phần mềm AutoDock Vina cho 150 polyphenol và 7 chất chứng dương statin. Quá trình docking được lặp lại 3 lần độc lập để giảm thiểu sai số tính toán. Tiêu chuẩn lựa chọn hợp chất tiềm năng: năng lượng liên kết tự do (ΔG) bằng hoặc âm hơn chất chứng dương có kết quả tốt nhất (-8,3 kcal/mol của atorvastatin), đồng thời tạo liên kết hydro và tương tác kỵ nước với các acid amin thiết yếu trong trung tâm xúc tác của HMGCR.
  • Phân tích tương tác không gian: Trực quan hóa và trích xuất các tương tác 2D, 3D giữa phối tử và acid amin đích bằng phần mềm Discovery Studio 2021 Client.
  • Sàng lọc tính giống thuốc và dự đoán ADMET: Tính toán các chỉ số Lipinski bằng công cụ trực tuyến của SCFBIO IIT Delhi; tính toán các chỉ số ADMET bằng công cụ trực tuyến pkCSM từ mã SMILES của PubChem.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 cung cấp cơ sở dữ liệu lý luận toàn diện về bệnh lý rối loạn lipid máu, enzym HMGCR, nhóm hợp chất polyphenol và các phương pháp nghiên cứu tính toán in silico:

  • Trình bày định nghĩa RLLPM theo hướng dẫn chẩn đoán của Bộ Y tế, các tiêu chí xét nghiệm định lượng (TC > 5,2 mmol/L; TG > 1,7 mmol/L; LDL-c > 2,58 mmol/L; HDL-c < 1,03 mmol/L) và các bảng phân loại bệnh (phân loại 5 typ của Fredrickson năm 1956 và phân loại thực hành lâm sàng của De Gennes). Phân tích cơ chế bệnh sinh hình thành tế bào bọt và mảng xơ vữa thành mạch từ LDL-c bị oxy hóa.
  • Tổng quan chiến lược điều trị bằng điều chỉnh lối sống và thuốc, phân tích chi tiết cơ chế tác dụng của 7 statin lưu hành (nhóm 1 nguồn gốc nấm: lovastatin, pravastatin, simvastatin; nhóm 2 tổng hợp hóa học: fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, pitavastatin), dược động học và độc tính điển hình của nhóm statin.
  • Mô tả cấu trúc tetramer của HMGCR người, xác định tọa độ và vai trò của các acid amin xúc tác: His866 tham gia proton hóa anion CoA thiol; Lys735, Lys691 tạo liên kết hydro ổn định oxy mang điện tích âm của mevaldyl-CoA; Asp690 và Asp767 tham gia hai giai đoạn phản ứng khử; Glu559 cung cấp proton cho mevaldehyde; Ser684, Arg590 và Asn755 tạo tương tác định vị cơ chất.
  • Khái quát cấu trúc 4 phân nhóm polyphenol (flavonoid, phenolic acid, stilbene, lignan) và các cơ chế hạ lipid máu đã được công bố; giới thiệu nguyên lý các thuật toán tìm kiếm cấu dạng, hàm tính điểm trường lực trong docking phân tử, quy tắc Lipinski và vai trò của dự đoán ADMET sớm trong quy trình phát triển thuốc.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu tính toán và các bước tiến hành thực nghiệm in silico:

  • Nguyên liệu: Cấu trúc protein HMGCR mã 1HWI từ Protein Data Bank; tập dữ liệu 150 cấu trúc hóa học polyphenol và 7 chất chứng dương statin trích xuất từ cơ sở dữ liệu PubChem.
  • Thiết bị và phần mềm: Máy tính ThinkPad X250, hệ điều hành Windows 10, AutoDock Vina, MGL Tools 1.5.6, UCSF Chimera 1.14, Discovery Studio 2021 Client, Avogadro, máy chủ dự đoán Lipinski trực tuyến và công cụ pkCSM.
  • Quy trình gồm 3 bước logic: (1) Chuẩn bị thụ thể - phối tử, thẩm định thông số docking thông qua re-docking tính chỉ số RMSD và chạy docking sàng lọc 150 phân tử; (2) Lọc các hợp chất có ái lực liên kết mạnh bằng quy tắc 5 tiêu chuẩn của Lipinski; (3) Dự đoán và đánh giá các thông số dược động học, loại trừ các phân tử có nguy cơ độc tính bằng pkCSM.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ

Chương 3 trình bày các kết quả tính toán định lượng thu được qua từng phễu lọc:

  • Thẩm định docking: Quá trình re-dock fluvastatin vào cấu trúc 1HWI cho thấy sự chồng khít cấu dạng hình học với giá trị RMSD = 1,15 Å (thấp hơn ngưỡng giới hạn 1,5 Å), xác nhận các thông số hộp lưới và trường lực hoàn toàn hợp lệ.
  • Kết quả docking 7 chất chứng dương statin:
    • Atorvastatin đạt điểm năng lượng liên kết thấp nhất: ΔG = -8,3 kcal/mol (tạo liên kết hydro với Ser684, Lys692, Arg590, Lys735, Ser661, Ser565, Asn686, Ala751; liên kết π-alkyl với Leu853; liên kết π-sigma với Ala856; liên kết C-H với Asp690).
    • Rosuvastatin: -8,1 kcal/mol.
    • Pitavastatin: -8,1 kcal/mol.
    • Fluvastatin: -8,0 kcal/mol.
    • Lovastatin: -7,4 kcal/mol.
    • Pravastatin: -7,1 kcal/mol.
    • Simvastatin: -7,1 kcal/mol.
  • Sàng lọc 150 polyphenol theo năng lượng liên kết: Ghi nhận 81/150 hợp chất có năng lượng liên kết ΔG ≤ -8,3 kcal/mol (mức ái lực bằng hoặc vượt trội hơn atorvastatin).
  • Sàng lọc tính giống thuốc (Lipinski): Trong 81 hợp chất, có 50 hợp chất thỏa mãn từ 2/5 tiêu chí Lipinski trở lên. Đáng chú ý, có 4 hợp chất thỏa mãn toàn bộ 5/5 tiêu chí gồm Furowanin A, Euchrenone A10, Cyclomorusin và 11-Hydroxytephrosin. Hợp chất Ochnaflavone có năng lượng liên kết rất âm (-10,8 kcal/mol) nhưng bị loại do không đáp ứng quy tắc Lipinski.
  • Dự đoán ADMET bằng pkCSM: Trong 50 hợp chất giống thuốc, có 34 chất bị loại bỏ do mang nguy cơ độc tính (ức chế kênh hERG II gây độc cơ tim, dương tính với thử nghiệm gây đột biến AMES hoặc có LD50 < 2 mol/kg). 16 hợp chất còn lại thể hiện tính an toàn cao (không độc tim, không độc gan, không kích ứng da, không gây đột biến, LD50 > 2 mol/kg).
  • Lựa chọn 5 hợp chất tối ưu nhất: Kết hợp điểm số docking và hồ sơ ADMET thuận lợi, tác giả chọn ra 5 hợp chất triển vọng nhất gồm: Silidianin (-8,8 kcal/mol), 11-Hydroxytephrosin (-8,7 kcal/mol), Sanggenol L (-8,7 kcal/mol), Sanggenon N (-8,6 kcal/mol) và Kuwanon E (-8,5 kcal/mol). Cả 5 chất đều có năng lượng gắn kết tốt hơn toàn bộ 7 statin đối chứng và tương tác chặt chẽ với các acid amin then chốt trong túi xúc tác HMGCR.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương 4 phân tích sâu về đặc tính sinh học, dược động học của 5 phân tử được chọn và đánh giá phương pháp nghiên cứu:

  • Silidianin: Là thành phần flavonolignan trong phức hợp silymarin của cây cúc gai (chiếm khoảng 10%). Điểm docking đạt -8,8 kcal/mol (cao hơn đồng phân isosilibin -8,3 kcal/mol, tuy thấp hơn silibinin -9,3 kcal/mol và silichristine -8,9 kcal/mol nhưng silidianin vượt trội hơn hẳn về tính an toàn và khả năng hấp thu qua ruột đạt 91,339%). Hợp chất không ức chế CYP2D6, CYP3A4, không độc tế bào gan hay tim mạch, dù có khả năng thấm một phần qua hàng rào máu não (logBBB = -0,761).
  • 11-Hydroxytephrosin: Thuộc nhóm rotenoid, phân lập từ các loài thực vật họ Đậu (Derris cuneifolia, Millettia brandisiana...). Điểm docking -8,7 kcal/mol, hấp thu qua ruột 90,683%, tính thấm qua màng Caco2 rất tốt (0,916 log Papp trong 10⁻⁶ cm/s). Chất này có đặc tính ức chế CYP3A4, có thể làm thay đổi sinh khả dụng của các thuốc phối hợp chuyển hóa qua enzym này.
  • Bộ ba hợp chất từ vỏ rễ cây dâu tằm (Morus alba): Sanggenol L (-8,7 kcal/mol, HIA 88,224%), Sanggenon N (-8,6 kcal/mol, Caco2 0,951, HIA 89,142%) và Kuwanon E (-8,5 kcal/mol, HIA 88,598%). Cả ba chất đều tương tác tốt với HMGCR, không độc gan, tim hay da; tuy nhiên Sanggenol L có tính thấm Caco2 trung bình (0,505) và cả ba chất đều có khả năng thấm một phần qua hàng rào máu não/hệ thần kinh trung ương.
  • Đánh giá phương pháp: Khẳng định tính hiệu quả, tiết kiệm chi phí của sàng lọc in silico; phân tích điểm mạnh của AutoDock Vina về hàm tính điểm chính xác và hạn chế trong việc dự đoán tư thế cấu dạng linh động; thảo luận sự cần thiết của việc thẩm định RMSD (đạt 1,15 Å) và việc lặp lại tính toán 3 lần để triệt tiêu sai số.

Kết quả và đóng góp

Số liệu kết quả thực nghiệm in silico

Nghiên cứu đã xây dựng dữ liệu định lượng cụ thể qua các bước sàng lọc. Bảng dưới đây tổng hợp so sánh tương quan năng lượng liên kết và các acid amin tương tác của 5 hợp chất polyphenol tiềm năng so với các chất chứng dương statin:

Tên hợp chất / Phối tử Phân loại Năng lượng liên kết ΔG (kcal/mol) Các acid amin tham gia liên kết chính tại vị trí hoạt động
Silidianin Polyphenol (Cúc gai) -8,8 Asn658, Asp767, Glu559, Arg590, Leu853, Leu857, Met657
11-Hydroxytephrosin Polyphenol (Họ Đậu) -8,7 Arg590, His752, Glu559, Leu853, Met657, Met655, Cys561
Sanggenol L Polyphenol (Dâu tằm) -8,7 Ser684, Asp690, Lys735, Asn658, Arg590, Glu559, Leu853, Met655
Sanggenon N Polyphenol (Dâu tằm) -8,6 Asp690, Asn658, Lys692, Glu559, Arg590, Met655, Leu853, Met657
Kuwanon E Polyphenol (Dâu tằm) -8,5 Glu559, Lys735, Asn755, Asp690, Arg590, Leu857, Val683, His752, Leu853, Ala856
Atorvastatin Chứng dương (Statin loại 2) -8,3 Ser684, Lys692, Arg590, Lys735, Ser661, Ser565, Asn686, Ala751, Leu853, Asp690, Ala856
Rosuvastatin Chứng dương (Statin loại 2) -8,1 Ser684, Arg590, Asp690, Ser661, Ser565, Asn686, Asn755, Glu559, Ala751, Leu853
Pitavastatin Chứng dương (Statin loại 2) -8,1 Ser684, Arg590, Lys692, Ser661, Leu853, Cys561, His752, Leu562
Fluvastatin Phối tử kết tinh (Statin loại 2) -8,0 Ser684, Lys692, Arg590, Asn755, Lys735, Ser661, Ala856, Leu853
Lovastatin Chứng dương (Statin loại 1) -7,4 His752, Asn755, Leu857, Val683, Ala856
Pravastatin Chứng dương (Statin loại 1) -7,1 Ser684, Lys692, Arg590, Asp690, Lys735, Leu857, Leu853, Val683
Simvastatin Chứng dương (Statin loại 1) -7,1 Lys692, Arg590, Leu853, His752

Bảng tổng hợp các thông số dược động học và an toàn ADMET chính của 5 hợp chất tiềm năng:

Thông số ADMET Silidianin 11-Hydroxytephrosin Sanggenol L Sanggenon N Kuwanon E
Tính thấm Caco2 (log Papp 10⁻⁶ cm/s) 0,518 0,916 0,505 0,951 0,779
Hấp thu ruột HIA (%) 91,339 90,683 88,224 89,142 88,598
Thể tích phân bố VDss (log L/kg) 1,230 0,221 0,945 - -
Thấm hàng rào máu não BBB (log BB) -0,761 - -2,738 - -
Thấm TKTW CNS (log PS) -3,691 - - - -
Ức chế CYP2D6 Không Không Không Không Không
Ức chế CYP3A4 Không Có Không Không Không
Độ thanh thải toàn phần (log mL/phút/kg) -0,065 0,253 0,096 0,187 0,338
Cơ chất OCT2 ở thận Không Không Không Không Không
Độc tính AMES / Ức chế hERG Không / Không Không / Không Không / Không Không / Không Không / Không
Độc tính gan / Kích ứng da Không / Không Không / Không Không / Không Không / Không Không / Không
Độc tính cấp LD50 (mol/kg) 2,429 2,245 2,664 2,185 2,060

Đóng góp mới của tác giả

  • Khóa luận đã thiết lập một quy trình sàng lọc ảo tích hợp có độ tin cậy cao: kết hợp giữa docking phân tử (AutoDock Vina), phễu lọc cấu trúc giống thuốc Lipinski và mô hình dự đoán ADMET (pkCSM).
  • So với các nghiên cứu trước đây vốn chỉ khảo sát tác dụng hạ cholesterol hoặc ức chế HMGCR thô trên cao chiết thực vật hoặc thử nghiệm in vitro đơn thuần, tác giả đã giải thích cơ chế ở cấp độ phân tử: làm rõ cách thức các polyphenol liên kết trực tiếp vào các acid amin xúc tác quan trọng (Glu559, Arg590, Ser684, Asp690, Lys735, Asp767) tương tự hoặc chặt chẽ hơn cơ chế gắn kết của fluvastatin và atorvastatin.
  • Sàng lọc và định danh được 5 ứng viên phân tử tự nhiên cụ thể từ cúc gai (Silidianin), cây họ Đậu (11-Hydroxytephrosin) và vỏ rễ dâu tằm (Sanggenol L, Sanggenon N, Kuwanon E) có ái lực mạnh và hồ sơ an toàn tốt, định hướng cụ thể cho các nghiên cứu bán tổng hợp và chiết tách thực nghiệm tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế nội tại xuất phát từ điều kiện thực hiện và bản chất phương pháp:

  • Quy mô thư viện sàng lọc còn ở mức khiêm tốn (150 hợp chất polyphenol), do đó có thể đã bỏ sót nhiều phân tử tiềm năng khác trong tự nhiên.
  • Nghiên cứu dừng lại ở mức mô phỏng máy tính (in silico), chưa được kiểm chứng thực nghiệm bằng các thử nghiệm sinh hóa in vitro (đo hoạt độ enzym HMGCR tinh sạch) hoặc thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật tăng lipid máu.
  • Hạn chế của công cụ tính toán: cấu trúc protein trong docking được cố định tương đối cứng, chưa phản ánh hết mức độ linh động không gian trong môi trường sinh lý; phần mềm AutoDock Vina có ưu thế chấm điểm năng lượng nhưng khả năng mô phỏng tư thế phối tử còn hạn chế hơn một số phần mềm thương mại; việc sử dụng liên tiếp nhiều công cụ trực tuyến có thể tích lũy sai số.
  • Về mặt dược động học: Cả 5 chất tiềm năng đều được dự đoán có khả năng thấm một phần qua hàng rào máu não hoặc hệ thần kinh trung ương; Sanggenol L có độ thấm qua màng Caco2 chưa cao; 11-Hydroxytephrosin ức chế enzym gan CYP3A4.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

  • Mở rộng cơ sở dữ liệu sàng lọc cấu trúc với số lượng hợp chất polyphenol và dẫn chất tự nhiên lớn hơn.
  • Tiến hành các thử nghiệm thực nghiệm sinh học in vitro nhằm định lượng chính xác nồng độ ức chế 50% enzym (IC50) của Silidianin, 11-Hydroxytephrosin, Sanggenol L, Sanggenon N và Kuwanon E đối với HMGCR người.
  • Nghiên cứu sâu hơn về độc tính trên hệ thần kinh trung ương của các hợp chất có khả năng thấm qua hàng rào máu não, cũng như khảo sát tương tác thuốc của 11-Hydroxytephrosin liên quan đến CYP3A4.
  • Ứng dụng các kỹ thuật bào chế hoặc biến đổi cấu trúc hóa học để cải thiện tính thấm qua màng ruột (Caco2) cho Sanggenol L.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học ngành Dược học, Hóa dược, Công nghệ sinh học và Tin sinh học đang tiếp cận hướng đề tài thiết kế thuốc có sự hỗ trợ của máy tính (CADD) hoặc sàng lọc ảo (virtual screening).
  • Các nhà nghiên cứu đang làm việc trên các nhóm hoạt chất tự nhiên từ cây cúc gai (Silybum marianum), dâu tằm (Morus alba), hoặc tìm kiếm các chất hạ lipid máu tác động lên enzym HMG-CoA reductase.
  • Phần phương pháp nghiên cứu tại Chương 2 và quy trình thẩm định re-docking (tính toán RMSD), thiết lập thông số hộp lưới, chuẩn bị file phối tử/thụ thể (.pdbqt) là nội dung có giá trị thực hành cao, có thể dùng làm tài liệu tham khảo quy trình chuẩn cho các đồ án, khóa luận ứng dụng AutoDock Vina và pkCSM.

Câu hỏi thường gặp

1. Mã PDB của thụ thể HMG-CoA reductase được sử dụng trong khóa luận là gì và cấu trúc này có đặc điểm gì?
Khóa luận sử dụng cấu trúc tinh thể phần xúc tác của enzym HMGCR người được tải từ Protein Data Bank với mã PDB là 1HWI, ở độ phân giải 2,22 Å. Cấu trúc này đã có sẵn phối tử đồng kết tinh là fluvastatin liên kết tại vị trí hoạt động.

2. Tiêu chuẩn thẩm định quy trình docking (re-docking) của nghiên cứu đạt kết quả bao nhiêu?
Quy trình docking được thẩm định bằng cách tách phối tử fluvastatin ra khỏi phức hợp 1HWI và dock lại vào đúng vị trí ban đầu. Kết quả đo bằng phần mềm UCSF Chimera cho thấy độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) giữa cấu dạng dock lại và phối tử gốc là 1,15 Å, đáp ứng tiêu chuẩn tin cậy (RMSD < 1,5 Å).

3. Chất chứng dương statin nào cho kết quả năng lượng liên kết tốt nhất và mức năng lượng là bao nhiêu?
Trong số 7 statin đối chứng được khảo sát, atorvastatin đạt điểm số docking tốt nhất với năng lượng liên kết tự do ΔG = -8,3 kcal/mol, tiếp theo là rosuvastatin (-8,1 kcal/mol), pitavastatin (-8,1 kcal/mol), fluvastatin (-8,0 kcal/mol), lovastatin (-7,4 kcal/mol), pravastatin (-7,1 kcal/mol) và simvastatin (-7,1 kcal/mol). Mức -8,3 kcal/mol của atorvastatin được dùng làm mốc chuẩn để lọc các polyphenol tiềm năng.

4. Sau các bước sàng lọc qua các phễu lọc docking, Lipinski và ADMET, số lượng hợp chất thay đổi như thế nào?
Từ 150 polyphenol ban đầu, phễu docking chọn được 81 hợp chất có ΔG ≤ -8,3 kcal/mol. Qua phễu lọc quy tắc 5 tiêu chí Lipinski, có 50 hợp chất đạt yêu cầu tính giống thuốc (≥ 2/5 tiêu chí). Qua phễu lọc ADMET của pkCSM, loại bỏ 34 chất có nguy cơ độc tính, giữ lại 16 hợp chất an toàn. Cuối cùng, tác giả chọn ra 5 hợp chất xuất sắc nhất về cả ái lực liên kết và thông số dược động học.

5. Năm hợp chất polyphenol tiềm năng nhất được xác định trong nghiên cứu là những chất nào?
Năm hợp chất được lựa chọn gồm: Silidianin (từ cây cúc gai, ΔG = -8,8 kcal/mol), 11-Hydroxytephrosin (từ các loài cây họ Đậu, ΔG = -8,7 kcal/mol), Sanggenol L (từ vỏ rễ dâu tằm, ΔG = -8,7 kcal/mol), Sanggenon N (từ vỏ rễ dâu tằm, ΔG = -8,6 kcal/mol) và Kuwanon E (từ vỏ rễ dâu tằm, ΔG = -8,5 kcal/mol).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Vũ Thị Thu Thủy đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình sàng lọc in silico các hợp chất polyphenol ức chế enzym HMG-CoA reductase với độ tin cậy kỹ thuật cao (RMSD = 1,15 Å). Qua hệ thống phễu lọc gồm docking phân tử bằng AutoDock Vina, quy tắc 5 tiêu chí Lipinski và dự đoán ADMET bằng pkCSM trên tập dữ liệu 150 polyphenol, đề tài đã xác định được 5 hợp chất tiềm năng nhất gồm Silidianin, 11-Hydroxytephrosin, Sanggenol L, Sanggenon N và Kuwanon E. Tất cả 5 phân tử này đều thể hiện ái lực gắn kết với HMGCR mạnh hơn 7 statin đối chứng lâm sàng (năng lượng liên kết từ -8,5 đến -8,8 kcal/mol), tạo tương tác bền vững với các acid amin xúc tác then chốt và có hồ sơ dược động học dự đoán an toàn. Công trình cung cấp luận cứ khoa học phân tử quan trọng, mở ra hướng đi rõ ràng cho các thử nghiệm thực nghiệm in vitro và in vivo tiếp theo nhằm phát triển các thuốc hạ lipid máu mới từ nguồn dược liệu tự nhiên.