CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kỹ thuật cắt lạnh 1.1 Khái niệm và lịch sử kỹ thuật cắt lạnh 1.1 Khái niệm kỹ thuật cắt lạnh Trong quá trình thực hiện các phẫu thuật, đôi khi cần có chẩn đoán nhanh về tình trạng bệnh lý qua mô bệnh học. Phẫu thuật viên cần biết việc cắt bỏ khối u, đặc biệt là u ác tính đã đạt yêu cầu hay chưa ( diện cắt còn u hay không, xác định có cắt thùy còn lại trong ung thư tuyến giáp,.) trước khi đóng lại, hay một diễn biến bệnh bất ngờ có thể được tìm thấy (các xâm lấn u tới các phủ tạng, mô xương, khối u chưa xác định đã thu nhập đúng mô phù hợp hay chưa [2]. Điều này đòi hỏi một kỹ thuật chẩn đoán mô bệnh học nhanh chóng, tức thì. Chính vì lẽ đó một kỹ thuật đảm bảo được các yêu cầu trên được ra đời, là kỹ thuật cắt lạnh.
Nguyên lý của kĩ thuật cắt lạnh là sự làm lạnh nhanh khiến nước chuyển từ lỏng sang rắn trong mẫu mô, đóng vai trò như chất trung gian giữ hình dạng (khung) của mô, vì thế mô trở nên cứng và có thể cắt mỏng được. Kỹ thuật cắt lạnh là kỹ thuật cắt mô nhanh bằng cách làm lạnh mô bởi nhiệt độ âm sâu dưới sự trợ giúp của máy cắt lạnh. Máy cắt lạnh là thiết bị vừa có chức năng làm đông lạnh bệnh phẩm đồng thời thực hiện được các lát cắt lạnh và gắn vào tiêu bản. Kỹ thuật cắt lạnh được tiến hành với các mẫu mô lấy ra khỏi cơ thể, chưa được cố định, chuyển đến labo Giải phẫu bệnh trong thời gian ngắn nhất và được đông lạnh nhanh chóng, cắt mảnh bằng máy cắt, nhuộm màu ngay lập tức để chẩn đoán mô bệnh học nhanh các tổn thương, đặc biệt là tổn thương ác tính.
Mô bệnh học được xử lý theo cách này sẽ không phù hợp đối với nghiên cứu chi tiết của tế bào, nhưng có giá trị bởi nó nhanh chóng, và cung cấp được cho phẫu thuật viên ngay lập tức thông tin liên quan đến sự ác tính của mô [2],[3].2 Lịch sử kỹ thuật cắt lạnh Lần đầu tiên sử dụng việc đóng băng để làm cứng các mô từ thế kỷ XIX. De Riemer năm 1818 đã tiên phong sử dụng FS để chẩn đoán mô bệnh học [2], [4]. Kỹ thuật được Hazard và Stevenson giới thiệu vào năm 1949 với mẫu mô 3 tươi được đặt trong chất cố định có thể tích gấp mười. Khối cố định sau đó được đông cứng giữa các miếng băng khô và cắt với độ dày 10-15µm.
Mỗi mảnh được chuyển vào một cốc nước cất. Các mảnh sau đó được thực hiện bởi một que thủy tinh và một cốc có chứa carbol fucshin và dung dịch xanh toluidine, gắn vào một miếng kính sạch và ngay lập tức được bao phủ bằng dung dịch 30% đường sucrose, gắn lamen. Quá trình này kéo dài trong một giờ và có thể được bảo quản trong vài ngày [2], [4], [5]. Teloh HA đã hoàn thiện kỹ thuật này vào năm 1957 bằng cách trực tiếp đặt mẫu mô chưa trộn vào giai đoạn đóng băng bằng bốc hơi liên tục của khí carbon dioxide, gây đông lạnh nhanh.
Mẫu mô sau đó được cắt ở 25µm và nhuộm bằng cách thả dung dịch thionin. Màu sắc phẩm nhuộm thionin sẽ biến mất sau khoảng 48 giờ [4], [5]. Sự phát triển của máy cắt lạnh vào năm 1959, đã cách mạng hóa kỹ thuật FS. Phần nước ở trong mô được đông lạnh để tạo ra một ma trận cứng, làm nền cho việc cắt mô.
Các mảnh mô được cắt và thu nhập gắn trên lam kính, sẵn sàng để nhuộm màu [3], [5] .2 Cơ sở khoa học Chẩn đoán mô bệnh học thường quy trong các xét nghiệm mô bệnh học hiện nay phần lớn được xác định bằng việc quan sát hình thái và cấu trúc, cách sắp xếp các tế bào trong mô. Để đạt được quan sát chi tiết ở từng tế bào, yêu cầu bắt buộc là mô bệnh học phải được cắt thành những lát rất mỏng, độ dày 3- 5 µm, tương đương với một lớp tế bào, nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Vấn đề được giải quyết qua quá trình chuyển bệnh phẩm. Sử dụng paraffine làm chất nền cho bệnh phẩm, xâm nhập vào trong tế bào và làm khuôn giữ cho thành phần cũng như tổ chức mô được giữ nguyên khi cắt mảnh, chống lại sự thay đổi mối liên quan giữa tế bào và tổ chức do tác động của lưỡi dao [2], [6].
Tuy nhiên, quá trình chuyển bệnh phẩm trải qua quá trình nhiều bước liên tiếp, phụ thuộc vào tốc độ ngấm hóa chất của mô, độ dày và tính chất của mô, kéo dài ít nhất một vài tiếng, không thể đáp ứng nhu cầu cần kết quả ngay lập tức như đã đề ra. 4 Một chất nền tồn tại ngay trong mô tại thời điểm làm xét nghiệm mà vẫn tạo được độ cứng cần thiết để phục vụ việc cắt mảnh là rất cần thiết để có được kết quả bệnh học nhanh và chính xác. Tính chất mô học của cơ thể được cấu tạo bởi khoảng 70% là nước, người ta sử dụng nước bị đông đá ở nhiệt độ âm để làm nên cho việc cắt mảnh. Kết hợp với dung dịch Gel cắt lạnh (Optimal cutting temperature compound) len lỏi vào những khoảng trống của mô và lấp đầy chúng, tạo thành khối bao gồm mô bệnh và Gel.
Gel cắt lạnh được sản xuất nhằm mục đích hướng tới sự đồng nhất về độ cứng giữa khối Gel và mô cắt, đồng thời cũng là một chất dẫn nhiệt để làm lạnh đều và nhanh chóng mô bệnh. Gel cắt lạnh không ngấm được vào mô ở cấp độ tế bào, không có tác động cố định bệnh phẩm cũng như làm nền cho quá trình cắt. Chất Gel này sẽ bị loại bỏ dễ dàng sau quá trình rửa trôi bằng nước và không ảnh hưởng đến sự cố định lại mô trong dung dịch formol [2], [7]. Mô bệnh sau khi được tạo khối và đông lạnh, được tiến hành cắt mảnh bởi máy cắt lạnh với nguyên lý giống với cắt mảnh thường quy.
Các mảnh cắt ở đây đòi hỏi sự phức tạp và khéo léo hơn để chống lại hiện tượng bị cuộn mảnh. Mảnh cắt được dán vào lam kính, cố định và tiến hành nhuộm màu. Có nhiều phương pháp nhuộm được đưa ra, quá trình nhuộm mô bằng Hematoxylin & Eosin kéo dài khoảng 3 phút, nhiều hơn so với nhuộm một màu xanh Toluidine. Tuy nhiên hình thái tế bào cũng rõ ràng, tương phản hơn trên tiêu bản nhuộm Hematoxylin & Eosin giúp các nhà Giải phẫu bệnh đưa ra chẩn đoán dễ dàng và chính xác hơn [2], [8], [9] .3 Ứng dụng và chỉ định của kỹ thuật cắt lạnh 1.1 Giá trị của kỹ thuật cắt lạnh - Xác định bản chất của tổn thương: Để xác định xem một tổn thương là lành tính hoặc ác tính là rất quan trọng đối với phẫu thuật viên, vì điều này sẽ quyết định bước tiếp theo cần thực hiện.
- Xác định sự hiện diện của tổn thương: FS đôi khi được sử dụng để xác nhận có sự hiện diện hoặc không của tổn thương trong vùng mô nghi ngờ. - Xác định sự hiện diện của tổn thương lành tính: Điều này khá quan trọng trong trường hợp tổn thương xương (những xương mềm có thể cắt lạnh 5 được). Một tổn thương lành tính cần phải được xác nhận việc kết thúc phẫu thuật. Tổn thương xương ác tính thường được chẩn đoán bằng cách sử dụng sinh thiết trước phẫu thuật.
- Xác định có đủ mô để chẩn đoán hay không: FS đôi khi được sử dụng để xác định liệu các mô được gửi cho chẩn đoán mô bệnh học đã đủ để chẩn đoán hay chưa. - Thiết lập mức độ tổn thương: Chẩn đoán khối u ác tính được thực hiện tốt nhất sau khi khối u được lấy hết ra. Tuy nhiên, đôi khi việc này là cần thiết ngay trong phẫu thuật để hướng dẫn xử trí tiếp theo. - Xác định sự hiện diện của tổn thương bất thường: FS cũng có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của một thương tổn khác được phát hiện thêm ngay trong cuộc phẫu thuật.
- Xác định độ an toàn của diện cắt: Đánh giá diện cắt phẫu thuật là rất quan trọng đối với sự phục hồi hay tái phát trong trường hợp bệnh ác tính. Một số mô bệnh ở vùng sâu, khó can thiệp, lấy hết được tổn thương là điều rất quan trọng để tránh khỏi sự tái phát nhanh chóng và khó điều trị. - Xác định bằng chứng cho tổn thương xâm lấn: Đối với các tổn thương nghi ngờ u xâm lấn, cần phải lấy mẫu mô xác định có xâm lấn, di căn hay không.2 Chỉ định - Chẩn đoán nhanh khối u lành hay ác tính nhằm giúp các phẫu thuật viên quyết định các bước tiếp xử trí tiếp theo. - Đánh giá diện cắt vùng rìa khối u cho đến khi diện cắt rìa âm tính.
- Đánh giá sự thoả đáng của mẫu mô trong sinh thiết từ một thủ thuật mở hoặc thủ thuật phức tạp, tránh phải làm thủ thuật lần hai khi mẫu không đạt yêu cầu. - Ngoài ra còn được dùng lập kế hoạch sử dụng mẫu, các nghiên cứu miễn dịch enzyme tế bào, huỳnh quang, hoá mô miễn dịch.3 Chống chỉ định Dường như không có chống chỉ định tuyệt đối đối với việc sử dụng chẩn đoán FS. Tuy nhiên, những hạn chế tương đối và các biện pháp phòng ngừa cần được lưu ý. Trong một số trường hợp, việc chỉ định FS là không phù hợp.
FS đôi khi là không cần thiết mặc dù không gây hại cho bệnh nhân (Ví dụ: phẫu thuật lần 2 cho một khối u lớn đã phẫu thuật trước đó hoặc điều trị không có kết quả, đã có kết quả mô bệnh học thường quy trước đó). Một số chỉ định FS không những không cần thiết mà còn có khả năng gây hại cho bệnh nhân (Ví dụ: đối với các tổn thương rất nhỏ, thực hiện FS trước khi tiến hành mô thường quy không đủ mô phục vụ cho chẩn đoán mô bệnh học thường quy).4 Độ chính xác của cắt lạnh. Có nhiều nghiên cứu khác nhau về giá trị của sinh thiết tức thì. Hầu hết chỉ ra rằng kỹ thuật này rất đáng tin cậy nếu thực hiện tốt.
Hầu hết các trung tâm báo cáo tỷ lệ chính xác từ 92% đến 98% tùy thuộc vào loại trường hợp được nghiên cứu. Một trung tâm lớn như Mayo Clinic Rochester, Mỹ đã báo cáo độ chính xác lên tới 97,8% khi nghiên cứu 24.880 trường hợp cắt lạnh trong một năm. Độ chính xác 97,56% được ghi nhận tại một bệnh viện đa khoa ở Malaysia có 215 mẫu FS trong thời gian 4 năm [10], [11].