Đặt vấn đề Cây Sả (Cymbopogon nardus Rendl) thuộc họ lúa (Poaceae) được trồng nhiều ở Việt Nam theo tính chất gia đình, trên thế giới phân bố tại Indonesia, Xrilanca, Ấn Độ, Trung Quốc. Rễ hoặc toàn thân cây sả được sử dụng làm nguyên liệu trong nấu ăn và là một vị thuốc dân gian. Tinh dầu sả được dùng như một loại nguyên liệu phục vụ cho y học hiện đại, là thành phần tạo nước hoa [6]. Đối với người dân, lá và thân được dùng để nấu ăn.
Cây xả được dùng để xông hơi, lá sả dùng làm thuốc pha nước uống cho mát và tiêu, củ xả có tác dụng thông tiểu tiện, ra mồ hôi, chữa cảm sốt [6]. Đối với các ngành công nghiệp và y học, tinh dầu xả có công dụng rất đa dạng. Tuy nhiên, các loại sả và thành phần hoạt chất của tinh dầu thay đổi và có giá trị khác nhau như tinh dầu sả các từ cây sả Cymbopogon nardus (L. (sả Xrilanca) và cây Cymbopogon winterianus Jowitt (sả Java) có từ 20 đến 40% geraniola và citronellola, 40 đến 60% xitronellala.
Sả chanh Cymbopogon fexuosus và Cymbopogon citratus chứa từ 70 đến 80% xitral [6]. Một số nghiên cứu dịch tế học đã chứng minh rằng một số chất có trong cây sả có khả năng chống lại được một số các hoạt động chống oxy hóa, tăng sinh, chống viêm và trong ngành công nghiệp mỹ phẩm [16], [21]. Vì thế nhu cầu về tinh dầu sả trên thế giới khoảng 3.000 tấn/ năm mới đáp ứng đủ nhu cầu cho thị trường. Trên thế giới giá trị của tinh dầu sả là 6,48 USD tương đương 149,688 đồng, tinh dầu sả chanh có giá 7,50 USD tương đương 173,250 đồng [6], [20].
Thực tế, số lượng các mẫu sả rất đa dạng và phong phú do được phân bố rộng khắp Việt Nam. Có những mẫu sả đã được công bố có thể sử dụng phục vụ nhiều mục đích như cho nhiều tinh dầu, làm thuốc, thức ăn. Nhưng, rất nhiều mẫu sả khác chưa được nghiên cứu cụ thể, các thông tin như đặc điểm hình thái, sự đa dạng di truyền còn chưa được biết đến. 2 Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một số giống sả Việt Nam”.
Với mục tiêu nhằm chăm xác định đặc điểm của các mẫu sả Việt Nam. Từ đó phục vụ các nghiên cứu tiếp theo về công tác giống và sản xuất. Mục tiêu của đề tài 1. Mục tiêu tổng quát - Sưu tầm các mẫu sả tại Việt Nam.
- Xác định đặc điểm của các mẫu sả tại Việt Nam. - Đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu sả. Mục tiêu cụ thể - Sưu tầm được các mẫu sả tại các địa phương. - Xác định được đặc điểm hình thái và hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả.
- Xác định sự đa dạng về đặc điểm di truyền của cây sả.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Có tên các mẫu sả phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Các đặc điểm sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng tinh dầu của các mẫu sả phục vụ định hướng nghiên cứu các sản phẩm khác. Bộ dữ liệu về đa dạng di truyền của các mẫu sả phục vụ cho công tác về giống.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Cung cấp thông tin về đặc điểm hình thái của các mẫu sả phục vụ công tác giống cũng như truy xuất nguồn gốc tinh dầu sả của các địa phương. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về cây sả 2. Đặc điểm cây sả Cây sả là cây thân thảo, thuộc họ hoà thảo và mọc thành các bụi có chiều cao khoảng 1 mét đến 1,5 mét.
Lá cây hẹp dài, mép lá hơi bị nhám. Thân cây có màu trắng hoặc hơi tím. Bẹ lá ôm chặt với nhau rất chắc tạo thành một thân giả mà người ta thường gọi là củ sả. Rễ cây sả là kiểu rễ chùm, mọc sâu vào đất phát triển mạnh khi đất tơi và xốp.
Sả sinh sản bằng cách nảy chồi ở nách tạo thành nhánh như nhánh lúa, vì thế từ một nhánh trồng có thể sinh sôi phát triển ra nhiều nhánh tạo thành bụi sả [10]. Phân bố Trên thế giới, chi sả có khoảng 55 loài sả khác nhau, được phân bố ở các vùng nhiệt đới như Châu Phi, Nam Á, Đông Á, Australia. Ở Trung Quốc và Đông Nam Á phổ biến loài Cymbopogon citratus [10]. Tại Việt Nam, cây sả có 15 loài trong đó 11 loài có mùi thơm.
Về mặt hoá học có ba nhóm chính [5]: - Sả chi xitronelal: Sả Java còn gọi là sả xoè (Cymbopogon winterianus Jawitt), sả Xrilanca còn gọi là sả bẹ (Cymbopogon nardus (L. Hai loài này được để trống nhiều ở Việt Nam. - Sả chi geraniol: Sả hoa hồng (Cymbopogon martinii var motia Burk). Đang được nghiên cứu và trồng lớn để khai thác.
- Sả chi xitral: Sả chanh gồm hai loài: Cymbopogon tortilis A.Camus và Cymbopogon flexnosus Stapf. Các chủng loại này cũng đang được nghiên cứu để đưa vào trồng trọt. Phân loại Giới (Kingdom): Thực vật (Plantae) Ngành (Division): Thực vật có hoa (Angiosperms) Lớp (Class): Thực vật một lá mầm (Monocots) Phân lớp (Subclass): Cây hạt kín (Commenlinids) 4 Bộ (ordo): Hoà thảo (Poales) Họ (Family): Hoà thảo (Poaceae) Phân họ (Subfamily) Panicoideae Tộc (Tribe): Andropogoneae Phân tộc (Subtribe): Andropogoninae Chi (genus): Cympogon spreng (khoảng 55 loài) Loài (Species): Cympogon citratus Các loài quan trọng trong chi sả gồm [10]: - Cymbopogon ambiguus: Sả chanh Úc (bản địa Úc). - Cymbopogon citratus: Sả ta hay sả chanh Tàu (bản địa Trung Quốc).
- Cymbopogon citriodora: Sả chanh Tây Ấn Độ (bản địa Ấn Độ). - Cymbopogon flexuosus: Sả Đông Ấn Độ (bản địa Ấn Độ). - Cymbopogon martinii: Sả Palmarosa. - Cymbopogon nardus: Cỏ sả Thái (Ta-khrai Hom).
- Cymbopogon Proximus: Sả Ai Cập. - Cymbopogon schoenanthus: Sả hoang mạc (miền Nam Châu Á và Bắc Phi). Giá trị của cây sả Theo nghiên cứu của Christopher E Ekpenyong và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng sả được sử dụng trong y học trên toàn thế giới cho nhiều ứng dụng bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, chống nhiễm trùng, chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, chống ho, sát trùng và chống thấp khớp. Nó cũng đã được sử dụng trong dự phòng tiểu cầu trong điều trị bệnh tiểu đường, rối loạn mỡ máu, rối loạn tiêu hóa, lo lắng, sốt rét, cúm, sốt và viêm phổi trong liệu pháp mùi hương và thẩm mỹ được đưa ra thông qua bảng 2.
ngoài công dụng chữa bệnh, sả còn được thêm vào đồ uống có cồn và không cồn, thực phẩm nướng, làm hương liệu, chất bảo quản trong bánh kẹo và ẩm thực [24]. 5 a) Thành phần hoá học trong tinh dầu sả [24]: Bảng 2. Thành phần hoá học trong tinh dầu sả Isolongifolene-4- Citral d-Cadinene 5-9-10-dehydro t-Muurolol Levo--elemenne Burneol Viridiflorol -Amorphene tran-Chrysanthemal 3-Undencyne -Pinene oxide -Gualene -Elemonl 3-carvomenthenone (E, E)-Farnesal Linalool Germacrene-D Geraniol pimelyl dihydrazide Citronellal -Terpineol Hunmulene Citronellol Nerol -O-Cimene t-Cadinol Geranic-acid Geranial Myrcenol Myrcene Muurolene Methyl-n- 1-Octyn-3-ol Allo-o-cimene Sesquiphellandrene nonylketone -Bergamotene Neral -Selinene Gurjunene Muurolene Nerol -eudesmol Valencene Farnesene Dextro-carvone Geranyl-acetate b) Thành phần hoạt chất sinh học trong sả [24] Bảng 2.Thành phần hoạt chất sinh học trong sả Phytonutrients Chất khoáng Vitamins Flavonoids Sodium Vitamin A Alkaloids Potassium Vitamin C Viatmins Calcium Vitamin E Tannins Iron Folate Phenols Phosphorus Thiamine 6 Phytonutrients Chất khoáng Vitamins Saponins Selenium Niacin Essential oils Zinc Pyridoxine Steroids Magnesium riboflavin 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 2.
Giới thiêụ sơ lược về kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là kỹ thuật khuếch đại đa hình sản phẩm DNA sử dụng các cặp mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật này được William phát triển năm 1900 và Welsh và cộng sự năm 1991 dựa trên nền tảng của kỹ thuật PCR [32]. Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi ngắn có kích thước dao động trong khoảng 10 nucleotide với trình tự biết trước bắt cặp và nhân bản một cách ngẫu nhiên các đoạn DNA có trình tự bổ sung tạo các các khác nhau tùy thuộc vào trình tự DNA đích. Do đó, các cá thể giống nhau sẽ hình thành các sản phẩm có kích thước như nhau, các cả thể khác nhau sẽ hình thành các sản phẩm khuếch đại khác nhau.
Kỹ thuật RAPD gồm 4 bước như sau: + Tách chiết DNA tổng số + Nhân bản DNA bằng phương pháp PCR + Điện di trên gel agarose + Dùng phần mềm thông dụng để xác định tính đa dạng di truyền [18]. RAPD đang được ứng dụng phổ biến sử dụng dấu hiệu đa hình DNA trong sinh thái học phân tử để xác định phân loại, đánh giá các mối quan hệ họ hàng, phân tích các mẫu bộ gen không giống nhau, xác định đa hình cây tái sinh từ mô sẹo nhằm mục đích phân loại và lai tạo giống [25]. Giới thiệu về kỹ thuật ISSR. Kĩ thuật ISSR dựa trên cơ sở của phản ứng PCR dùng để nhân đoạn gen nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều nhau liền kề có kích thước 100-3000 bp.
Kĩ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi trong kĩ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide. Các mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh. Kĩ thuật ISSR 7 được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai [1].
Một số kĩ thuật khác 2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại. Đây là kỹ thuật được sử dụng trong phát hiện ra đa hình DNA. AFLP được kết hợp với PCR và RFLP bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi.
Các căp mồi thường được tạo từ 50-100 băng trong một phân tích. Kỹ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào [26]. Kỹ thuật AFLP tạo ra các nhóm đa hình DNA gọi là đa hình chiều dài đoạn khuếch đại hay AFLP. Bước đầu tiên (phần A) là cắt DNA hệ gen bằng enzyme giới hạn; ví dụ này sử dụng enzyme EcoRI với vị trí giới hạn là 5-GAATTC-3’.
Phản ứng phân cắt tạo ra số lượng lớn đoạn giới hạn với hai đầu chứa vị trí cắt của EcoRI.