Đánh Giá Khả Năng Biểu Hiện HNF - 4α Trong Tế Bào Gốc Cuống Rốn Người

Bài viết phân tích khả năng biểu hiện hnf 4α trong tế bào gốc cuống rốn người, cung cấp cái nhìn sâu sắc về tiềm năng ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Phùng Minh Tuấn
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Đức
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Biểu Hiện Gen HNF - 4α Trong Tế Bào Gốc Cuống Rốn Người
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 1.3. DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 1.4. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1.5. THESIS ABSTRACT
• 2. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 3. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU
• 4. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 4.1. TẾ BÀO GỐC
• 4.1.1. Định nghĩa tế bào gốc
• 4.1.2. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc
• 4.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc
• 4.2. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
• 4.2.1. Cấu tạo, chức năng của dây rốn
• 4.2.2. Tế bào gốc dây rốn
• 4.2.3. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs
• 4.3. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS
• 4.3.1. Đặc điểm gen HNF - 4α
• 4.3.2. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc
• 5. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 5.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 5.2.1. Mẫu xét nghiệm
• 5.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất
• 5.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.3.1. Thu nhận và xử lí dây cuống rốn
• 5.3.2. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn
• 5.3.3. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR)
• 5.3.4. Điện di trên gel agarose
• 5.3.5. Phân lập gen HNF - 4α
• 5.3.6. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit
• 6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 6.1. PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO
• 6.1.1. Phân lập tế bào
• 6.1.2. Cấy chuyển tế bào
• 6.1.3. Đông lạnh tế bào
• 6.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
• 6.2.1. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM
• 6.2.2. Tách chiết RNA tổng số
• 6.2.3. Định lượng RNA tổng số
• 6.2.4. Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa
• 6.2.5. Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa
• 6.3. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α
• 6.3.1. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α
• 6.3.2. Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Biểu Hiện Gen HNF 4α Ở Tế Bào Gốc

Tế bào gốc, với khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, mở ra tiềm năng lớn trong y học tái tạo. Trong số đó, tế bào gốc cuống rốn người nổi lên như một nguồn tế bào đầy hứa hẹn, dễ dàng thu thập và ít gây tranh cãi về mặt đạo đức so với tế bào gốc phôi. Nghiên cứu về biểu hiện gen trong quá trình biệt hóa tế bào gốc là chìa khóa để kiểm soát và tối ưu hóa quá trình này. Gen HNF-4α (Human Hepatocyte Nuclear Factor - 4α) đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và chức năng của gan. Việc đánh giá biểu hiện gen HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người có ý nghĩa quan trọng trong việc định hướng biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan, mở ra cơ hội điều trị các bệnh lý về gan như viêm gan và ung thư gan. Các phương pháp như qPCR và Western Blot thường được sử dụng để phân tích biểu hiện gen này.

1.1. Tế Bào Gốc Cuống Rốn Người Nguồn Tiềm Năng

Tế bào gốc cuống rốn người sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội so với các nguồn tế bào gốc khác. Việc thu thập tế bào gốc từ cuống rốn không xâm lấn, không gây đau đớn cho người mẹ và em bé. Cuống rốn người thường bị coi là rác thải y tế sau sinh, nhưng lại chứa đựng nguồn tế bào gốc dồi dào. Ứng dụng tế bào gốc cuống rốn đang được nghiên cứu rộng rãi trong điều trị nhiều bệnh lý khác nhau, đặc biệt là các bệnh liên quan đến gan. Y học tái tạo đang ngày càng chú trọng đến việc khai thác tiềm năng của tế bào gốc cuống rốn.

1.2. Vai Trò Của Gen HNF 4α Trong Biệt Hóa Tế Bào Gan

Gen HNF-4α là một yếu tố phiên mã quan trọng, đóng vai trò then chốt trong sự hình thành và duy trì chức năng của tế bào gan. Vai trò HNF-4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu. Biểu hiện protein HNF-4α tăng lên khi tế bào gốc bắt đầu biệt hóa thành tế bào gan. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF-4α giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế biệt hóa và tìm ra các phương pháp điều khiển quá trình này một cách hiệu quả. Biomarker HNF-4α có thể được sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình biệt hóa.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen HNF 4α

Mặc dù tiềm năng của tế bào gốc cuống rốn người và vai trò của HNF-4α đã được chứng minh, việc nghiên cứu và ứng dụng chúng vẫn còn nhiều thách thức. Cơ chế điều hòa biểu hiện gen HNF-4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc chưa được hiểu rõ hoàn toàn. Việc kiểm soát quá trình biệt hóa để tạo ra các tế bào gan chức năng một cách hiệu quả và an toàn vẫn là một bài toán khó. Ngoài ra, việc đảm bảo tính ổn định và khả năng sống sót của các tế bào gan được biệt hóa sau khi cấy ghép vào cơ thể cũng là một vấn đề cần được giải quyết. Các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử và di truyền học là cần thiết để vượt qua những thách thức này.

2.1. Cơ Chế Điều Hòa Biểu Hiện Gen HNF 4α Bí Ẩn Cần Giải Mã

Cơ chế điều hòa biểu hiện gen HNF-4α là một quá trình phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố khác nhau như các yếu tố phiên mã khác, các tín hiệu ngoại bào và các biến đổi epigenetic. Việc giải mã cơ chế này sẽ giúp các nhà khoa học có thể điều khiển biểu hiện gen một cách chính xác và hiệu quả hơn. Các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử như qPCR, Western Blot và miễn dịch huỳnh quang đóng vai trò quan trọng trong việc khám phá cơ chế này. Hiểu rõ cơ chế điều hòa biểu hiện gen HNF-4α sẽ mở ra cơ hội phát triển các phương pháp điều trị bệnh gan hiệu quả hơn.

2.2. Kiểm Soát Biệt Hóa Tế Bào Gốc Bài Toán Khó

Việc kiểm soát quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan là một bài toán khó, đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này. Các yếu tố như môi trường nuôi cấy, các yếu tố sinh trưởng và các yếu tố phiên mã đều có thể ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là chìa khóa để tạo ra các tế bào gan chức năng một cách hiệu quả và an toàn. Sự biệt hóa tế bào gốc cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo các tế bào gan được tạo ra có đầy đủ chức năng và không gây ra các tác dụng phụ không mong muốn.

III. Phương Pháp Đánh Giá Biểu Hiện Gen HNF 4α Hiệu Quả

Để đánh giá biểu hiện gen HNF-4α một cách chính xác và tin cậy, cần sử dụng các phương pháp phù hợp và kết hợp nhiều kỹ thuật khác nhau. Các phương pháp phổ biến bao gồm qPCR (Real-time PCR), Western Blot, và miễn dịch huỳnh quang. qPCR cho phép định lượng mức độ biểu hiện gen một cách chính xác. Western Blot giúp xác định mức độ biểu hiện protein HNF-4α. Miễn dịch huỳnh quang cho phép quan sát sự phân bố của protein HNF-4α trong tế bào. Việc kết hợp các phương pháp này giúp có được cái nhìn toàn diện về biểu hiện gen HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người.

3.1. qPCR Real time PCR Định Lượng Biểu Hiện Gen Chính Xác

qPCR là một kỹ thuật sinh học phân tử mạnh mẽ, cho phép định lượng mức độ biểu hiện gen một cách chính xác và nhanh chóng. Kỹ thuật này dựa trên việc khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu bằng phản ứng PCR và theo dõi sự gia tăng của sản phẩm PCR trong thời gian thực. qPCR được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu tế bào gốc để phân tích biểu hiện gen của các gen quan trọng, bao gồm cả HNF-4α. Kết quả qPCR cung cấp thông tin quan trọng về mức độ hoạt động của gen trong các điều kiện khác nhau.

3.2. Western Blot Xác Định Mức Độ Biểu Hiện Protein HNF 4α

Western Blot là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để xác định mức độ biểu hiện protein của một protein cụ thể trong mẫu tế bào hoặc mô. Kỹ thuật này dựa trên việc tách các protein bằng điện di trên gel, chuyển các protein lên màng và sau đó sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện protein mục tiêu. Western Blot là một công cụ quan trọng để xác nhận kết quả qPCR và cung cấp thông tin về mức độ biểu hiện protein HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen HNF 4α Trong Y Học

Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người có nhiều ứng dụng tế bào gốc cuống rốn quan trọng trong y học. Một trong những ứng dụng tiềm năng nhất là điều trị các bệnh về gan như viêm gan, xơ gan và ung thư gan. Bằng cách điều khiển biểu hiện gen HNF-4α, các nhà khoa học có thể biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành các tế bào gan chức năng và sử dụng chúng để thay thế các tế bào gan bị tổn thương. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị các bệnh khác như đái tháo đường và các bệnh liên quan đến chức năng gan.

4.1. Điều Trị Bệnh Gan Hướng Đi Mới

Các bệnh về gan như viêm gan, xơ gan và ung thư gan là những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người mở ra một hướng đi mới trong điều trị các bệnh này. Bằng cách sử dụng tế bào gốc để thay thế các tế bào gan bị tổn thương, các nhà khoa học hy vọng có thể chữa khỏi hoặc cải thiện đáng kể tình trạng của bệnh nhân. Y học tái tạo đang ngày càng chứng minh tiềm năng to lớn trong việc điều trị các bệnh nan y.

4.2. Y Học Cá Nhân Hóa Tương Lai Của Điều Trị

Y học cá nhân hóa là một xu hướng phát triển trong y học hiện đại, tập trung vào việc điều trị bệnh dựa trên đặc điểm di truyền và sinh học của từng cá nhân. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF-4α có thể đóng góp vào sự phát triển của y học cá nhân hóa trong điều trị các bệnh về gan. Bằng cách phân tích biểu hiện gen của bệnh nhân, các bác sĩ có thể lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp nhất và dự đoán khả năng đáp ứng điều trị của bệnh nhân.

V. Kết Luận Tiềm Năng To Lớn Của Nghiên Cứu HNF 4α

Nghiên cứu về đánh giá biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người là một lĩnh vực đầy hứa hẹn, có tiềm năng to lớn trong y học tái tạo và điều trị các bệnh về gan. Mặc dù vẫn còn nhiều thách thức, những tiến bộ trong lĩnh vực này đang mở ra những cơ hội mới để cải thiện sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc giải mã cơ chế điều hòa biểu hiện gen HNF-4α, tối ưu hóa quá trình biệt hóa tế bào gốc và phát triển các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Giải Mã Cơ Chế Điều Hòa

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc giải mã cơ chế điều hòa biểu hiện gen HNF-4α một cách chi tiết. Điều này đòi hỏi sự kết hợp của nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và di truyền học khác nhau. Hiểu rõ cơ chế này sẽ giúp các nhà khoa học có thể điều khiển biểu hiện gen một cách chính xác và hiệu quả hơn, mở ra cơ hội phát triển các phương pháp điều trị bệnh gan hiệu quả hơn.

5.2. Tối Ưu Hóa Biệt Hóa Tế Bào Gốc Mục Tiêu Quan Trọng

Tối ưu hóa quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan là một mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu tế bào gốc. Điều này đòi hỏi việc tìm ra các yếu tố và điều kiện nuôi cấy tối ưu để tạo ra các tế bào gan chức năng một cách hiệu quả và an toàn. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc cải thiện hiệu suất biệt hóa, đảm bảo tính ổn định của các tế bào gan được tạo ra và giảm thiểu nguy cơ gây ra các tác dụng phụ không mong muốn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới, các bệnh lý mạn tính về gan như viêm gan, xơ gan và ung thư gan đang đe dọa tính mạng của hơn 500 triệu bệnh nhân trên toàn cầu, trong khi nguồn tạng hiến tặng luôn ở tình trạng khan hiếm nghiêm trọng. Liệu pháp tế bào gốc mở ra hướng đi đột phá khi có thể ứng dụng điều trị trên 70 bệnh lý hiểm nghèo khác nhau. Trong các nguồn tế bào, tế bào gốc trung mô từ lớp thạch Wharton của dây rốn người (hWJSCs) được đánh giá là nguồn sinh phẩm vượt trội nhờ khả năng thu thập không xâm lấn từ phụ phẩm y tế, tốc độ tăng sinh mạnh và ít gây tranh cãi đạo đức so với tế bào gốc phôi.

Vấn đề then chốt hiện nay là việc kiểm soát và làm sáng tỏ cơ chế biệt hóa định hướng từ tế bào gốc trung mô thành tế bào gan chức năng. Đề tài tập trung vào yếu tố phiên mã HNF-4α (Human Hepatocyte Nuclear Factor 4-alpha) - một công tắc sinh học chủ chốt điều hòa sự phát triển của gan. Mục tiêu của công trình là phân lập, nhân nuôi ổn định tế bào gốc dây rốn người, đánh giá trạng thái biểu hiện của gen HNF-4α trước và sau khi xử lý biệt hóa, đồng thời nhân dòng thành công trình tự mã hóa của gen này nhằm tạo tiền đề làm tác nhân gây biệt hóa.

Nghiên cứu được triển khai trong thời gian 9 tháng, từ tháng 8/2016 đến tháng 4/2017, tại Phòng Công nghệ phôi thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mẫu dây rốn có chiều dài tối thiểu 7 cm được thu thập từ những sản phụ có kết quả xét nghiệm âm tính với các tác nhân truyền nhiễm nguy hiểm. Kết quả công trình đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng, nâng cao độ tin cậy của quy trình biệt hóa tế bào gan in vitro với độ chính xác di truyền đạt mức tuyệt đối 100%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng lý thuyết tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) và sinh học phân tử về điều hòa phiên mã. Đầu tiên, tiêu chuẩn quốc tế của Hiệp hội Liệu pháp Tế bào xác định MSCs qua ba đặc tính: khả năng bám dính trên bề mặt giá thể nuôi cấy, biểu hiện dương tính mạnh với các dấu ấn bề mặt CD73, CD90, CD105, đồng thời âm tính với các chỉ thị dòng tạo máu như CD14, CD34, CD45.

Thứ hai, mô hình điều hòa biệt hóa biểu mô gan khẳng định HNF-4α là yếu tố phiên mã thuộc siêu họ thụ thể nhân tế bào NR2A1, định vị tại nhiễm sắc thể 20q13. Cấu trúc gen HNF-4α có kích thước trên 70 kb gồm 10 exon và 9 intron, trong đó trình tự mã hóa hoàn chỉnh (CDS) dài 1339 bp mã hóa 442 axit amin. Yếu tố phiên mã này trực tiếp kiểm soát hoạt động của khoảng 100 gen chuyên biệt tại gan như Albumin (ALB), Glucose-6-Phosphatase (G6P) và HNF-1α.

Thứ ba, lý thuyết chuyển đổi biểu mô - trung mô (EMT) giải thích sự tương tác giữa các yếu tố kìm hãm như Snail và HNF-4α trong việc tái lập mạng lưới sao chép tế bào gan.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 5 mẫu dây rốn tươi thu nhận ngay sau sinh, bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý ở nhiệt độ 4°C và xử lý trong vòng 12 đến 24 giờ. Phương pháp phân lập được lựa chọn là kỹ thuật nuôi cấy mảnh mô sơ cấp (explant culture) cải tiến. Mô thạch Wharton được bóc tách tỉ mỉ, loại bỏ toàn bộ 1 tĩnh mạch và 2 động mạch, cắt nhỏ thành các khối 2-3 mm² và gieo với mật độ 3-4 mảnh mỗi giếng trên đĩa 4 giếng. Môi trường nuôi cấy là DMEM/F12 bổ sung 15% huyết thanh thai bò (FBS) cùng các yếu tố tăng trưởng EGF, bFGF, duy trì trong tủ ấm 37°C và 5% CO2.

Phương pháp nuôi cấy mảnh mô được lựa chọn thay vì phân giải enzyme vì giúp tế bào duy trì khả năng tăng sinh bền bỉ tới 80 ngày, hạn chế tối đa nguy cơ tổn thương màng tế bào. Để đánh giá kiểu hình phân tử, phương pháp phiên mã ngược kết hợp phản ứng chuỗi polymerase (RT-PCR) được tiến hành với các cặp mồi chuyên biệt cho từng dấu ấn tế bào gốc và tế bào gan. Sản phẩm khuếch đại được kiểm tra qua kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% và 1% ở hiệu điện thế 70V trong 40 phút. Đoạn gen HNF-4α được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET và giải trình tự để đối chiếu độ tương đồng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, quá trình phân lập ghi nhận tế bào bắt đầu di cư ra khỏi rìa mảnh mô thạch Wharton từ ngày nuôi cấy thứ 20. Tế bào nhanh chóng bám dính, tăng sinh tạo thành các mảng đơn lớp cuộn xoắn song song và đạt mật độ bao phủ bề mặt 80% sau khoảng 25 đến 28 ngày nuôi cấy.

Thứ hai, đặc tính động học tăng sinh đạt tốc độ cực đại ở các thế hệ cấy chuyển P3 đến P4, duy trì ổn định đến thế hệ P6, sau đó suy giảm dần từ thế hệ P10 và ngừng phân chia hoàn toàn sau lần cấy chuyển thứ 13. Tỷ lệ sống của tế bào trước khi bảo quản lạnh đạt 100% khi kiểm tra bằng thuốc nhuộm Trypan Blue 0,4%, chứng minh chất lượng nguồn tế bào ban đầu đạt tiêu chuẩn tối ưu.

Thứ ba, phân tích biểu hiện phân tử qua RT-PCR cho thấy quần thể tế bào sau phân lập biểu hiện dương tính 100% với các chỉ thị tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105. Đồng thời, mẫu hoàn toàn âm tính với chỉ thị CD34, CD86 cũng như các chỉ thị tế bào gan trưởng thành gồm ALB, G6P và HNF-4α.

Thứ tư, sau 4 tuần cảm ứng biệt hóa với DMSO, phản ứng RT-PCR xác nhận gen HNF-4α đã được kích hoạt biểu hiện rõ nét. Đoạn trình tự mã hóa CDS của gen HNF-4α với kích thước 1339 bp được phân lập và tinh sạch thành công, cho kết quả đối chiếu độ tương đồng đạt tỷ lệ 100% so với dữ liệu chuẩn trên GenBank.

Thảo luận kết quả

Kết quả nuôi cấy mảnh mô cho thấy sự vượt trội về độ tinh sạch và tính đồng nhất hình thái so với phương pháp phân giải enzyme CHT hay CT. Trong khi phân giải enzyme chỉ thu được các cụm tế bào tròn nhỏ lơ lửng và ngừng tăng sinh sau 30 ngày, phương pháp mảnh mô tạo ra quần thể tế bào dạng nguyên bào sợi trải rộng, duy trì ổn định di truyền qua nhiều thế hệ. Động học sinh trưởng này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế, khẳng định thế hệ P4 là thời điểm vàng để thu hoạch và trữ đông tế bào trong nitơ lỏng ở -196°C.

Dữ liệu thực nghiệm có thể được hệ thống hóa rõ ràng thông qua bảng đối chiếu ma trận chỉ thị phân tử trước và sau biệt hóa, kết hợp với biểu đồ đường mô tả tốc độ tăng sinh tế bào từ thế hệ P1 đến P13. Việc HNF-4α chuyển từ trạng thái âm tính sang dương tính sau 4 tuần cảm ứng chứng minh tế bào gốc trung mô dây rốn đã bước vào giai đoạn tiền biệt hóa gan. Kết quả khuếch đại thành công đoạn CDS dài 1339 bp với độ chính xác 100% cung cấp vật liệu di truyền hoàn hảo để thiết kế các vector biểu hiện phục vụ chuyển gen trực tiếp.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô theo hướng loại bỏ hoàn toàn huyết thanh động vật. Đơn vị nghiên cứu cần thay thế 15% FBS bằng môi trường không huyết thanh chuyên dụng (serum-free media) trong vòng 12 tháng tới nhằm giảm thiểu nguy cơ lây truyền prion và hạ tỷ lệ phản ứng miễn dịch xuống dưới 5% khi ứng dụng trên động vật thử nghiệm.

Thứ hai, tối ưu hóa công nghệ chuyển gen thông qua vector tái tổ hợp mang trình tự mã hóa HNF-4α dài 1339 bp. Nhóm nghiên cứu thuộc bộ môn Công nghệ sinh học cần thiết kế hệ thống vector lentivirus hoặc plasmid biểu hiện để chuyển trực tiếp HNF-4α vào tế bào hWJSCs thế hệ P3-P4, đặt mục tiêu nâng hiệu suất biệt hóa tế bào gan lên trên 85% trong khung thời gian 18 tháng.

Thứ ba, thiết lập hệ thống ngân hàng lưu trữ tế bào gốc trung mô đạt chuẩn thực hành sản xuất tốt (GMP). Ban quản lý phòng thí nghiệm cần ban hành quy trình thao tác chuẩn về rã đông nhanh, giảm thiểu thời gian tiếp xúc của tế bào với chất bảo vệ DMSO ở nhiệt độ phòng xuống dưới 3 phút, bảo đảm tỷ lệ tế bào sống sót sau rã đông đạt trên 90%.

Thứ tư, ứng dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR và Western Blot để định lượng chính xác mức độ biểu hiện protein HNF-4α. Các nghiên cứu viên cần triển khai đánh giá động học nồng độ protein theo từng tuần nuôi cấy trong giai đoạn 6 tháng tiếp theo, tạo cơ sở so sánh định lượng đa chiều với các dòng tế bào gan nguyên thủy.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm nghiên cứu y sinh học và công nghệ phôi: Luận văn cung cấp quy trình chi tiết từng bước về bóc tách thạch Wharton, kỹ thuật nuôi cấy mảnh mô sơ cấp và thông số chu trình nhiệt PCR chuẩn xác cho 10 cặp mồi chỉ thị. Đây là tài liệu tham khảo giá trị để tối ưu hóa quy trình phân lập tế bào gốc tại các phòng thí nghiệm chuyên sâu.

Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia ghép tạng: Tài liệu mang lại cái nhìn toàn diện về tiềm năng tái tạo mô gan từ nguồn phụ phẩm dây rốn, giúp các bác sĩ xây dựng các đề cương thử nghiệm tiền lâm sàng điều trị suy gan cấp và xơ gan giai đoạn cuối.

Chuyên viên vận hành ngân hàng tế bào gốc: Luận văn cung cấp dữ liệu thực nghiệm về phương pháp đông lạnh cực nhanh tế bào ở -70°C qua đêm trước khi chuyển sang nitơ lỏng -196°C, hỗ trợ xây dựng tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng mẫu lưu trữ dài hạn.

Giảng viên và học viên sau đại học ngành Công nghệ sinh học: Công trình là tài liệu học thuật mẫu mực về phương pháp luận nghiên cứu, từ thiết kế mồi RT-PCR, xử lý điện di gel agarose đến phân tích đối chiếu trình tự gen trên cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI GenBank.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao phương pháp nuôi cấy mảnh mô được ưu tiên hơn phân giải enzyme? Phương pháp nuôi cấy mảnh mô sơ cấp giúp bảo tồn cấu trúc vi môi trường tự nhiên của tế bào, cho phép tế bào duy trì khả năng tăng sinh bền bỉ tới 80 ngày. Ngược lại, việc xử lý bằng enzyme phân giải mạnh dễ làm đứt gãy các thụ thể bề mặt màng và khiến tế bào ngừng sinh trưởng chỉ sau 30 ngày nuôi cấy.

Làm thế nào để xác định chính xác tế bào thu được là tế bào gốc trung mô? Tế bào được nhận diện dựa trên tổ hợp dấu ấn phân tử qua RT-PCR: biểu hiện dương tính rõ rệt với CD73, CD90, CD105 và âm tính hoàn toàn với các chỉ thị dòng tạo máu CD34, CD86. Đồng thời, tế bào có hình thái nguyên bào sợi đặc trưng và bám dính chắc chắn trên bề mặt đĩa nuôi cấy.

Vai trò then chốt của gen HNF-4α trong quá trình biệt hóa tế bào gan là gì? HNF-4α là yếu tố phiên mã bậc cao điều hòa mạng lưới hơn 100 gen chuyên biệt tại gan, kiểm soát sự tổng hợp Albumin và các enzyme chuyển hóa quan trọng. Sự kích hoạt biểu hiện của HNF-4α đóng vai trò như công tắc quyết định chuyển hướng tế bào gốc trung mô thành tế bào có chức năng tương tự tế bào gan.

Tại sao nên tiến hành bảo quản đông lạnh tế bào ở thế hệ cấy chuyển P4? Tế bào ở thế hệ P3 và P4 đạt tốc độ phân chia cực đại và có tính đồng nhất di truyền cao nhất với tỷ lệ sống đạt 100%. Sau thế hệ P6, tốc độ phân chia bắt đầu suy giảm và tế bào sẽ ngừng phân chia hoàn toàn sau thế hệ P13 do hiện tượng lão hóa tế bào.

Nguy cơ chính khi rã đông tế bào bảo quản lạnh là gì và cách khắc phục? Chất bảo quản DMSO có thể gây độc cho màng tế bào khi ở nhiệt độ phòng, làm suy giảm tỷ lệ tế bào sống. Biện pháp khắc phục là thao tác rã đông thật nhanh trong bể ổn nhiệt 37°C, ly tâm loại bỏ ngay môi trường chứa DMSO và hoàn nguyên tế bào trong môi trường nuôi cấy mới trong vòng dưới 3 phút.

Kết luận

• Phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ lớp thạch Wharton dây rốn người bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô sơ cấp, tế bào bắt đầu mọc từ ngày thứ 20 và đạt độ bao phủ 80%.
• Xác định chính xác kiểu hình tế bào gốc trung mô với kết quả dương tính CD73, CD90, CD105 và âm tính với CD34, CD86, ALB, G6P, HNF-4α trước khi biệt hóa.
• Kích hoạt thành công sự biểu hiện của gen chỉ thị HNF-4α trong tế bào gốc trung mô sau 4 tuần xử lý biệt hóa với DMSO.
• Nhân dòng và tinh sạch hoàn chỉnh đoạn trình tự mã hóa CDS của gen HNF-4α dài 1339 bp, đạt độ tương đồng chính xác 100% so với trình tự chuẩn trên GenBank.
• Tạo lập cơ sở khoa học vững chắc cho các nghiên cứu ứng dụng vector tái tổ hợp mang gen HNF-4α phục vụ điều trị tái tạo tổn thương gan trong tương lai.

Độc giả và các nhóm nghiên cứu quan tâm có thể khai thác toàn bộ dữ liệu thực nghiệm và quy trình kỹ thuật trong luận văn để tiếp tục phát triển các thử nghiệm biệt hóa tế bào chức năng gan trên mô hình động vật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG MINH TUẤN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN HNF - 4α TRONG TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS. Nguyễn Văn Hạnh – Quyền trưởng phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS.Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn theo sát, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Đỗ Trung Kiên, em Nguyễn Thị Nga và các anh chị cán bộ phòng Công nghệ phôi, viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào chức năng gan từ tế bào gốc người và chuột”, Mã số: VAST.03/16-17, đề tài trọng điểm cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. V DANH MỤC HÌNH ẢNH. VI DANH MỤC BẢNG BIỂU. VII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .VIII THESIS ABSTRACT.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TẾ BÀO GỐC.

Định nghĩa tế bào gốc. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc. Ứng dụng của tế bào gốc. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN.

Cấu tạo, chức năng của dây rốn. Tế bào gốc dây rốn. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS.

Đặc điểm gen HNF - 4α. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.

NGUYÊN VẬT LIỆU. Mẫu xét nghiệm. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Thu nhận và xử lí dây cuống rốn. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR). Điện di trên gel agarose.

Phân lập gen HNF - 4α. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO.

Phân lập tế bào. Cấy chuyển tế bào. Đông lạnh tế bào. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN.

Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM. Tách chiết RNA tổng số. Định lượng RNA tổng số. Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa.

Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α. Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 53 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HNF - 4α Human hepatocyte nuclear factor - 4 MSC Mesenchymal Stem Cell iPS cell Induced pluripotent stem cell ES Embryonic stem cells EG Embryonic germ cells DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complement deoxyribonucleic acid Bp Base pair Kb Kilo base bFGF Basic fibroblast growth factor CHT Collagenase / hyaluronidase trypsin CT Collagenase/ trypsin DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EGF Epidermal growth factor FBS Fetal bovine serum HSC Hemapoietic stem cell hWJSCs (human umbilical cord Wharton’s jelly Stem Cell) Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người ICM Inner cell mass IVF In vitro fertilization ITS Insulin – transferin – selenium ICSI Intracytop plasmide sperm injecti TBGTM Tế bào gốc trung mô RT – PCR Reverse-transcription Polymerase chain reaction TBG Tế bào gốc WJ Wharton’s jelly E.coli Escherichia coli Taq Thermus aquaticus UV Ultra violet (tia cực tím) CDS Coding sequence (trình tự mã hóa) TAE Tris-axit axetic-EDTA v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2. Chức năng của tế bào gốc. Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải).

Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc. Cấu tạo của dây rốn. Mẫu dây rốn trước khi xử lý. Sử dụng dao và panh để chọn lọc phần mô cần sử dụng.

Mẫu dây rốn trước khi xử lý. Tủ nuôi cấy tế bào 37oC, 5% CO2. Quy trình tách RNA tổng số bằng kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN). Nguyên lý RT-PCR.

Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô. Tế bào trước khi cấy chuyển (trái) và ở lần cấy chuyển thứ 4 (phải). Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối lên nhau. Tế bào mọc kín đĩa nuôi.

Tế bào sau khi được ủ với trypsin 0. Tế bào soi trên kính hiển vi sau khi nhuộm Trypan Blue. Nhiễm sắc thể (NST) ở lần cấy chuyển thứ 2. Điện di đồ tách chiết RNA tổng số.

Điện di đồ RT – PCR mẫu TBGTM sau phân lập. Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau xử lý biệt hóa. Điện di đồ PCR khuếch đại CDS của gen HNF - 4α. Kết quả kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank.

52 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3. Trang thiết bị và dụng cụ. Hóa chất thí nghiệm. Thành phần phản ứng PCR.

Trình tự các cặp mồi sử dụng đánh giá chỉ thị TBGTM. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α. Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết. Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng.

Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc. Trình tự được đọc bằng mồi vector (PacI–HNF-4α và PacI–HNF-4α). 51 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể. Khả năng biệt hóa cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa.

TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008). Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa.

Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu sau: Phương pháp phân lập tế bào (Được áp dụng theo A. Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được kết quả: nghiên cứu đã phân lập được tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng của tế bào gốc trung mô như: dương tính CD90, CD73, CD105, âm tính với các chỉ thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α, G6P. Kết quả nghiên cứu cho thấy biểu hiện của gen HNF - 4α âm tính ở tế bào gốc cuống rốn trước xử lý biệt hóa. Sau xử lý biệt hóa với DMSO, chỉ thị gen HNF - 4α đã biểu hiện sau 4 tuần nuôi cấy.

Nghiên cứu đã phân lập thành công gen HNF - 4α với mức độ tương thích 100% với trình tự gen được kiểm tra trên genbank. viii THESIS ABSTRACT Stem cells are the potential cells in the body. The cell's ability to differentiate into other specialized cell types. The umbilical cord stem cells are capable of having all characteristics of pluripotent stem cells such as bone marrow stem cells (Phan Kim Ngoc, 2009).

Recently a series of studies have demonstrated to differentiate the umbilical cord stem cells into liver cells, giving hope for the hundreds of millions of patients with hepatitis and liver cancer (Cai et al., 2007; Cantz et al. However, the exact mechanism of the differentiation from umbilical cord blood stem cells into hepatocytes still need to be clarified. We conducted a study on the topic of "Evaluating the ability of expression HNF - 4α in the umbilical cord stem cells" to serve the study of differentiation from the umbilical cord stem cells into hepatocytes oriented as both an indicator and differentiation. In this thesis, we have used the following research methods: Cellular isolation (Applied by A.

After the implementation of the project, we have obtained the following results: Research has isolated cord stem cells with characterized mesenchymal stem cells such as positive with the CD90, CD73, CD105 markers, negative with specific indicators for hepatocellular carcinoma are: ALB, HNF - 4α, G6P. Results show that the expression of the HNF-4α gene is negative in cord blood stem cells prior to differentiation. After DMSO treatment and 4 weeks of culture, the HNF-4α gene expression was demonstrated.