Lời mở đầu - Áp dụng quy trình phát hiện HAV đã xây dựng để khảo sát mức độ hiện diện HAV trong các mẫu vùng nuôi và mẫu lô hàng của 2 vùng thu hoạch NT2MV đƣợc kiểm soát. - Áp dụng quy trình phát hiện HAV đã xây dựng để tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế về Norovirus và HAV. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 5 Tổng Quan 1. TỔNG QUAN GVHD: TS.
NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 6 Tổng Quan 1.1/ Tổng quan về virus viêm gan A 1.1/ Lịch sử phát hiện HAV Dựa theo lịch sử y khoa, bắt đầu từ thế kỷ thứ 5 trƣớc Công Nguyên loài ngƣời có những miêu tả về những trận dịch vàng da (jaundice outbreaks) xảy ra tại nhiều nơi khác nhau trên thế giới, nhất là ở những thành phố lớn đông dân cƣ hoặc ở những trại lính chật chội. Ngƣời bệnh đang sống rất khỏe mạnh, bỗng dƣng bị đau bụng, tiêu chảy và biểu hiện vàng da [7]. Trong Thế Chiến thứ 2, một cơn dịch cảm cúm đã lây lan nhanh chóng với khoảng 200.000 ngƣời Mỹ và hơn 5 triệu ngƣời dân địa phƣơng bỗng dƣng ngã bệnh. Lúc bấy giờ ngƣời ta chƣa hiểu rõ nguyên nhân một cách chính xác, họ cho rằng bệnh nhân bị ngộ nƣớc hoặc trúng độc.
Vào những năm 1930, với sự phẫu thuật lấy tế bào gan – sinh thiết gan (liver biopsy) để khám nghiệm dƣới kính hiển vi, y khoa đã tiến một bƣớc rất dài trong việc xác định bệnh viêm gan. Nhƣng tới năm 1973 ngƣời ta mới nhận ra đƣợc sự có mặt của virus viêm gan A trong cơ thể của ngƣời bệnh thông qua việc nuôi cấy tế bào. Một trong những nguyên nhân phổ biến của bệnh viêm gan cấp tính là do virus viêm gan A (HAV), đƣợc nghiên cứu bởi Purcell vào năm 1973. Năm 1980, các nhà khoa học khẳng định sự hiện diện của virus này bằng các phản ứng ngƣng kết huyết thanh.
Từ đó dịch tễ học, lâm sàng, sự phát hiện trong tự nhiên của virus viêm gan A đã trở nên rõ ràng hơn. Kết quả nghiên cứu này dẫn đến sự phát triển một phƣơng thức tiếp cận cho những cách phát hiện, kiểm soát, ngăn ngừa sự lây lan cũng nhƣ sự bùng phát thành dịch của virus viêm gan A này [7]. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 7 Tổng Quan 1.2/ Đặc điểm sinh học của HAV 1.1/ Phân loại Hepatitis A virus (HAV) là loài thuộc chi Hepatovirus, vị trí trong giới phân loại nhƣ sau: Họ: Picornaviridae Chi : Hepatovirus Loài: Hepatitis A virus Group: (+) ssRNA HAV là cá thể duy nhất trong chi Hepatovirus [26,52]. Có bảy kiểu gen khác nhau, đánh số từ I đến VII.
Bốn kiểu gen trong số này là I, II, III, và VII gây bệnh trên ngƣời, trong các kiểu gen gây bệnh trên ngƣời đƣợc phân thành 6 phân nhóm là IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB [17], 80% chủng HAV gây bệnh cho ngƣời có kiểu gen I [26]. Các kiểu gen IV, V, VI gây bệnh trên các động vật linh trƣởng nhƣ khỉ, tinh tinh. Những phát hiện đầu tiên của HAV là trên loài khỉ cú (owl monkey) [43].2/ Đặc điểm hình thái và cấu trúc HAV a) Đặc điểm hình thái Bộ gene HAV là RNA sợi đơn, đƣợc bao bọc trong vỏ capsid. HAV có cấu trúc hình khối với 20 mặt tam giác đều, đƣờng kính hạt virus là 27-32 nm [18,23,25,33].
HAV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử (x 400. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 8 Tổng Quan Virus chỉ chứa những gì cần thiết để chúng thực hiện sự xâm nhiễm vào tế bào chủ. HAV cũng không ngoại lệ, chúng chỉ tồn tại ở dạng nucleocapsid, không có vỏ bao ngoài. Capsid là lớp vỏ protein của virus bao bọc nucleic acid và đƣợc cấu thành từ các đơn vị hình thái.
Capsomere là các đơn vị hình thái quan sát đƣợc trên bề mặt của các hạt virus tƣơng ứng với tập hợp các đơn vị cấu trúc. Promoter là các đơn vị cấu trúc nhỏ nhất. Capsid của HAV đƣợc tạo thành từ các tiểu đơn vị hình thái gọi là capsomer. Mỗi capsomere bao gồm năm protomers.
Mỗi protomer của HAV đƣợc làm bằng ba protein là VP1, VP2 và VP3 [37]. Hình dạng hạt virus và cấu trúc các tiểu đơn vị tạo nên vỏ capsid HAV [67] b) Đặc điểm cấu trúc bộ gen HAV Chú thích vùng gen 2BC và P3 Tiền vỏ capsid 2B: tạo cơ chế ẩm bào 2C: tạo enzyme helicase 3A: tạo protein bám màng tế bào chủ 3B: tạo mồi phiên mã ngƣợc Hạt virus 3D: enzyme polymerase Hình 1. Tổ chức bộ gen của HAV [13,29] GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 9 Tổng Quan Bộ gen HAV gồm khoảng 7500 nucleotide.
Có ba khu vực chính trong bộ gen: - Vùng 5’ không dịch mã dài 742 nucleotide. Vùng này gắn với VPg đƣợc mã hóa từ vùng gen 3B. VPg là một protein của virus có điểm đẳng điện thấp hơn các picornavirus khác. VPg hỗ trợ cho quá trình bắt đầu sao chép của RNA virus [64].
- Vùng ORF dài 6681 nucleotide, gồm: + Vùng ORF gồm 3 phần chính là P1-2A, 2BC, P3. Vùng gen P1-2A đƣợc dịch mã và đồng thời xử lý bởi một protease của virus để tạo bốn loại protein có cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4; và bảy protein không có cấu trúc 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D. Bốn protein cấu trúc mã hóa cho các protein tạo vỏ capsid polypeptid và kháng nguyên của HAV. Các kháng nguyên của HAV chủ yếu nằm tại vùng VP1, VP3 [26].
Vùng gen 2BC và P3 mã hóa tạo 7 protein không cấu trúc là 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D. Trong đó, vùng 3C mã hóa tạo protease và vùng gen 3D mã hóa tạo RNA polymerase. Các yếu tố này giúp RNA virus thực hiện quá trình dịch mã tạo các thành phần cho quá trình lắp ráp và nhân lên trong tế bào chủ [26,58]. + Vỏ capsid của HAV gồm ba protein: VP1 là cấu trúc chính khoảng 33kDa, VP2 khoảng 27kDa và VP3 khoảng 29kDa [65].
Dựa trên trình tự nucleotide, một protein capsid thứ tƣ – VP4, khoảng 2,5 kDa đƣợc mã hóa nhƣng chƣa đƣợc xác định trong cấu trúc của virion trƣởng thành [65]. - Vùng 3' không mã hoá dài 63 nucleotide, gắn với đuôi poly A, đuôi poly A có chức năng bảo vệ sợi RNA virus tránh sự phân hủy của các RNase. - HAV xuất hiện trong vật chủ, cũng giống nhƣ các loài picornavirus khác. Locarniniet và cộng sự [36] đã phát hiện có khoảng 11 protein của virus trong các tế bào chủng HM175 bị nhiễm HAV.
Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác cho thấy chỉ có các protein cấu trúc của HAV trƣởng thành mới đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm bệnh [19,53]. Điều này đƣợc giải thích có thể là do sự ổn định của VPg hoặc tốc độ tăng trƣởng chậm và không đồng đều của HAV. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 10 Tổng Quan 1.3/ Vị trí kháng nguyên HAV Các loài trong họ picornavirus đƣợc phân biệt là do sự xuất hiện của các kháng nguyên khác nhau [9]. Những khác biệt này dựa trên hình dạng, độ lớn phân tử trên bề mặt của vỏ capsid virus [9,49].
Nghiên cứu bằng tia X trên bề mặt lớp vỏ capsid virus đã xác định protein VP1 là protein tiếp xúc lớn [20]. Sự sắp xếp trình tự acid amin trong vùng gen VP1 của HAV đã xác định đƣợc ba peptide tạo kháng nguyên [48]. Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng, HAV bị đột biến chủ yếu là do quá trình tiếp xúc với kháng thể hoặc bị kháng thể trung hòa. Vùng gen VP1, VP3 chứa các acid amin có thể thay đổi trình tự để tạo các epitope hạn chế quá trình nhận diện kháng nguyên của các kháng thể [60].
Các nghiên cứu về bộ gen của HAV cho rằng chỉ có 6 trong số 11 axit amin nằm ở vùng gen VP1 và VP3 là tạo các protein kết hợp đƣợc với kháng thể. Quá trình tiếp xúc này sẽ làm thay đổi các axit amin có thể giúp HAV tạo ra các biến thể, tránh đƣợc sự trung hòa kháng nguyên. Các locus VP1 và VP3 mã hóa các kháng nguyên đƣợc đặt khá xa nhau, nhƣng chúng cũng đã kết hợp lại với nhau để tạo thành một yếu tố quyết định tính kháng nguyên duy nhất [20].4/ Sự nhân bản trong tế bào nuôi cấy Hình 1. Sự nhân bản HAV trong tế bào chủ [67] GVHD: TS.
NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 11 Tổng Quan Ở mức độ tế bào, HAV đi vào tế bào chủ thông qua sự ẩm bào. Tiếp đó, lyzosome của tế bào chủ sẽ ly giải hạt virus, để giải phóng RNA vào bên trong tế bào chất. Quá trình phiên mã ngƣợc sẽ diễn ra để tạo cDNA của HAV. Tiếp đó, cDNA thực hiện tiếp 2 quá trình: - Dịch mã tạo polyprotein, các polyprotein này sẽ tạo ra các capsomer của vỏ capsid virus sau này.
- Phiên mã tạo ra mRNA, mRNA sẽ sử dụng các thành phần có sẵn của tế bào chủ nhƣ polymerase, ribosome… để tạo các yếu tố còn lại của virus. mRNA sẽ là vật liệu di truyền cho thế hệ HAV tiếp theo sau khi đƣợc giải phóng khỏi tế bào chủ. - Các capsomer sẽ liên kết với nhau và bao lấy mRNA bên trong. Hạt virus HAV hoàn chỉnh đƣợc hình thành và giải phóng khỏi tế bào chủ ban đầu.
Ở mức độ cơ thể, HAV đi vào máu thông qua các biểu mô của hầu họng hoặc ruột. Máu mang virus này tới gan, nơi mà virus sẽ nhân bản bên trong tế bào gan và các tế bào Kupffer (đại thực bào gan). Việc gắn vào tế bào chủ đƣợc thực hiện bằng tƣơng tác giữa kháng nguyên của HAV và các thụ thể đính trên tế bào chủ. Sau khi thực hiện quá trình nhân bản, virus ra khỏi các tế bào chủ bằng cách ly giải.
Lúc này virus tồn tại dƣới dạng virion. Các virion đƣợc tiết vào mật và đào thải trong phân. Theo các nghiên cứu cho thấy, HAV đƣợc đào thải với số lƣợng lớn khoảng 11 ngày trƣớc khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc xuất hiện kháng thể IgM trong máu. Các giai đoạn ủ bệnh là 15-50 ngày [20].
Trong các tế bào gan, bộ gen RNA đƣợc giải phóng từ lớp vỏ protein capsid của virus, sau đó sử dụng ribosome của tế bào chủ cho việc dịch mã. Không giống nhƣ các picornavirus khác, virus này đòi hỏi tế bào chủ phải có tiểu phần eIF4G cho việc khởi đầu sao chép [52]. Các nghiên cứu gần đây cũng cho rằng các đoạn gen tại đầu 5’ của HAV không tiếp xúc hiệu quả với ribosome của tế bào chủ, vì thế quá trình khởi sự dịch mã thƣờng GVHD: TS.
