Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện hepatitis a virus hav trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật reverse transcription pcr

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học trình bày quy trình phát hiện Hepatitis A Virus (HAV) trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật Reverse Transcription PCR.

• Tác giả: Đoàn Minh Quân
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Dũng
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện Hepatitis A Virus (HAV) trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật Reverse Transcription PCR
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• Danh mục Bảng
• Danh mục Hình ảnh, Sơ đồ
• Danh mục chữ viết tắt
• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về virus viêm gan A
• 1.1.1. Lịch sử phát hiện HAV
• 1.1.2. Đặc điểm sinh học của HAV
• 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc HAV
• 1.1.2.2. Vị trí kháng nguyên HAV
• 1.1.2.3. Sự nhân bản trong tế bào nuôi cấy
• 1.1.2.4. Khả năng tồn tại của HAV
• 1.1.3. Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm gan siêu vi A
• 1.1.3.1. Bệnh mẫu và bệnh sinh
• 1.1.3.2. Dịch tễ học
• 1.1.4. Tình hình nhiễm virus HAV trên thế giới và Việt Nam
• 1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
• 1.1.5. Ngăn ngừa HAV
• 1.2. Các phương pháp phát hiện HAV
• 1.2.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào và phát hiện kháng nguyên
• 1.2.2. Phương pháp phát hiện bằng khuếch đại nucleic acid
• 1.3. Xác nhận hiệu lực phương pháp
• 1.3.1. Sơ lược về xác nhận hiệu lực phương pháp
• 1.3.2. Các bước xác nhận hiệu lực phương pháp
• 1.3.3. Các thông số kỹ thuật trong xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp định tính
• 1.3.3.1. Âm tính giả (False negative)
• 1.3.3.2. Dương tính giả (False positive)
• 1.3.4. Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thiết bị chính
• 2.2. Hóa chất, môi trường
• 2.2.1. Hóa chất dùng cho tách chiết RNA virus
• 2.2.2. Hóa chất dùng cho phản ứng Reverse Transcription (RT)
• 2.2.3. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
• 2.3. Vật liệu thí nghiệm
• 2.3.1. Trình tự các cặp mồi phát hiện HAV
• 2.3.2. Nền mẫu NT2MV sử dụng cho nghiên cứu
• 2.4. Chủng virus, vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp
• 2.5.1. Công cụ tin sinh học
• 2.5.1.1. Cơ sở dữ liệu NCBI
• 2.5.1.2. Chương trình BLAST
• 2.5.2. Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 2.5.2.1. Phương pháp chiết tách và tinh sạch RNA virus
• 2.5.2.2. Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR
• 2.5.2.3. Điện di và phân tích sản phẩm khuếch đại
• 2.5.3. Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích HAV trong NT2MV bằng kỹ thuật RT-PCR
• 2.5.3.1. Xác định giới hạn phát hiện (LOD50)
• 2.5.3.2. Tỷ lệ Âm tính giả (False negative – FN) và tỷ lệ Dương tính giả (False positive - FP)
• 2.5.4. Khảo sát sơ bộ phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR 1 bước (One-Step RT-PCR)
• 2.5.5. Khảo sát tỷ lệ lưu hành HAV trong mẫu NT2MV tại Cần Giờ và Bến Tre
• 2.5.6. Tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế về HAV
• 2.5.7. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
• 3.1. Kiểm tra tính chuyên biệt và đặc hiệu của cặp mồi đã chọn bằng công cụ BLAST
• 3.1.1. Kiểm tra tính chuyên biệt của cặp mồi khuếch đại gen VP3-VP1 của HAV bằng công cụ BLAST
• 3.1.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại đoạn gen VP3-VP1 với các vi sinh vật khác bằng công cụ BLAST
• 3.1.3. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi phát hiện HAV đã chọn
• 3.2. Xây dựng quy trình phân tích HAV bằng phương pháp RT-PCR
• 3.2.1. Khảo sát thời gian ủ mẫu với dung dịch làm việc (working solution)
• 3.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 đến phản ứng RT
• 3.2.3. Khảo sát đồng thời ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi đến phản ứng PCR
• 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA trong phản ứng PCR
• 3.3. Đề xuất quy trình phát hiện HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR
• 3.3.1. Xử lý nền mẫu nhuyễn thể và tách chiết, tinh sạch RNA virus
• 3.3.2. Phản ứng RT
• 3.3.2.1. Ủ mẫu với mồi ngẫu nhiên (Random primer)
• 3.3.2.2. Phản ứng RT
• 3.3.3. Phản ứng PCR
• 3.3.4. Phân tích sản phẩm PCR
• 3.3.5. Diễn giải kết quả
• 3.4. Đánh giá hiệu lực sơ cấp của quy trình phát hiện HAV trên mẫu NT2MV bằng kỹ thuật RT-PCR đã đề xuất
• 3.4.1. Xác định giới hạn phát hiện (LOD50)
• 3.4.2. Xác định các thông số kỹ thuật khác của phương pháp RT-PCR đã được thiết lập
• 3.4.3. Tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả
• 3.5. Đánh giá hiệu lực thứ cấp của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR thông qua tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế
• 3.6. Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật One-step RT-PCR
• 3.7. Khảo sát tỷ lệ lưu hành HAV trong mẫu NT2MV tại Cần Giờ và Bến Tre
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• TÀI LIỆU WEB
• PHỤ LỤC
• LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Hepatitis A Virus HAV và nhuyễn thể

Hepatitis A Virus (HAV) là một trong những tác nhân gây bệnh viêm gan A ở người, thường lây truyền qua đường tiêu hóa. Nhuyễn thể, đặc biệt là nhuyễn thể hai mảnh vỏ, được xem là vật chủ trung gian tích tụ HAV do khả năng lọc nước của chúng. Việc phát hiện HAV trong nhuyễn thể là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm và kiểm soát dịch bệnh. RT-PCR là phương pháp phân tử hiệu quả để phát hiện HAV trong các mẫu thực phẩm, đặc biệt là nhuyễn thể.

1.1. Đặc điểm sinh học của HAV

HAV thuộc họ Picornaviridae, có cấu trúc RNA đơn chuỗi. Virus này có khả năng tồn tại lâu trong môi trường nước và tích tụ trong nhuyễn thể. HAV gây bệnh viêm gan cấp tính, với các triệu chứng như vàng da, mệt mỏi và buồn nôn. Việc phát hiện sớm HAV trong nhuyễn thể giúp ngăn ngừa dịch bệnh và đảm bảo an toàn thực phẩm.

1.2. Vai trò của nhuyễn thể trong lây truyền HAV

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ, như nghêu và sò, có khả năng lọc nước và tích tụ HAV từ môi trường ô nhiễm. Khi con người tiêu thụ nhuyễn thể chưa được nấu chín kỹ, HAV có thể gây bệnh. Việc phát hiện virus trong thực phẩm như nhuyễn thể là bước quan trọng trong kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn thực phẩm.

II. Phương pháp RT PCR trong phát hiện HAV

RT-PCR là kỹ thuật sinh học phân tử hiệu quả để phát hiện HAV trong nhuyễn thể. Phương pháp này bao gồm các bước: tách chiết RNA, phiên mã ngược thành cDNA, và khuếch đại DNA bằng PCR. RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để phát hiện mầm bệnh trong thực phẩm.

2.1. Quy trình tách chiết RNA

Quy trình tách chiết RNA từ nhuyễn thể là bước đầu tiên trong phương pháp RT-PCR. RNA được tách chiết từ mẫu nội tạng nhuyễn thể bằng các hóa chất chuyên dụng. Độ tinh khiết của RNA ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phát hiện virus.

2.2. Tối ưu hóa phản ứng RT PCR

Việc tối ưu hóa các thông số như nồng độ MgCl2, nhiệt độ bắt cặp và nồng độ mồi là cần thiết để đảm bảo hiệu quả của phương pháp RT-PCR. Các thông số này được điều chỉnh để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu tối đa trong phát hiện HAV.

III. Đánh giá quy trình phát hiện HAV

Quy trình phát hiện HAV bằng RT-PCR được đánh giá thông qua các thông số kỹ thuật như giới hạn phát hiện (LOD), độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu. Kết quả cho thấy quy trình này có hiệu quả cao trong phát hiện virus trong hải sản.

3.1. Giới hạn phát hiện LOD

Giới hạn phát hiện (LOD) của quy trình RT-PCR là 5 PFU/g nội tạng nhuyễn thể. Điều này cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện HAV ở nồng độ thấp, phù hợp với yêu cầu kiểm tra vi sinh trong thực phẩm.

3.2. Độ chính xác và độ nhạy

Quy trình RT-PCR đạt độ chính xác 99.2% và độ nhạy 100%. Điều này khẳng định hiệu quả của phương pháp trong phát hiện mầm bệnh và đảm bảo an toàn thực phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình

Quy trình phát hiện HAV bằng RT-PCR đã được áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm để phân tích mẫu nhuyễn thể từ các vùng nuôi và xuất khẩu. Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ nhiễm HAV trong nhuyễn thể dao động từ 5-15%, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế.

4.1. Khảo sát mức độ nhiễm HAV

Quy trình RT-PCR được sử dụng để khảo sát mức độ nhiễm HAV trong nhuyễn thể tại các vùng nuôi Cần Giờ và Bến Tre. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm HAV là 5-15%, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế.

4.2. Thử nghiệm liên phòng quốc tế

Quy trình RT-PCR đã tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế và đạt kết quả loại A. Điều này khẳng định tính tương đồng và hiệu quả của phương pháp so với các tiêu chuẩn quốc tế.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê từ các tổ chức y tế quốc tế, từ năm 1980 đến năm 2012 đã ghi nhận 359 đợt bùng phát dịch bệnh do virus qua đường tiêu thụ động vật thân mềm, trong đó Hepatitis A Virus (HAV) chiếm 12,8% và Norovirus chiếm 83,7%. Tại Việt Nam, các khảo sát dịch tễ tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long từng chỉ ra tỷ lệ người dân có kháng thể kháng HAV lên tới 97%, phản ánh mức độ lưu hành rất cao trong môi trường tự nhiên. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NT2MV), đặc biệt là loài nghêu (Meretrix lyrata), có tập tính ăn lọc sinh học đặc thù, tích lũy lượng virus trong cơ quan tiêu hóa cao gấp 100 lần so với nồng độ trong môi trường nước xung quanh. Khi người tiêu dùng ăn phải các sản phẩm chưa qua xử lý nhiệt triệt để, nguy cơ bùng phát viêm gan A cấp tính là rất lớn.

Vấn đề kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm đối với mặt hàng nhuyễn thể xuất khẩu ngày càng cấp thiết khi thị trường Liên minh Châu Âu (EU) – nơi chiếm gần 70% tổng kim ngạch xuất khẩu nhuyễn thể của Việt Nam – áp dụng nghiêm ngặt Chỉ thị số 854/2004/EC về kiểm soát vùng thu hoạch và dư lượng mầm bệnh sinh học. Tuy nhiên, phần lớn các phòng kiểm nghiệm trong nước trước đây thiếu một quy trình phân tích phân tử chuẩn hóa, có độ nhạy cao và được xác nhận hiệu lực đầy đủ.

Nghiên cứu của tác giả Đoàn Minh Quân (Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.HCM, hoàn thành năm 2017) được triển khai nhằm xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định quy trình phát hiện HAV trên nền mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng kỹ thuật Reverse Transcription PCR (RT-PCR). Đề tài tập trung xác định các thông số kỹ thuật cốt lõi tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học thuộc Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 (NAFIQAD 4), tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế và khảo sát thực địa tại các vùng nuôi trọng điểm gồm Cần Giờ (TP.HCM) và Bến Tre (Bình Đại, Ba Tri, Thạnh Phú). Nghiên cứu mang lại ý nghĩa kinh tế - kỹ thuật thiết thực, cung cấp công cụ phân tích có giới hạn phát hiện LOD50 đạt 5 PFU/g nội tạng, độ nhạy chẩn đoán đạt 100%, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và gỡ bỏ rào cản kỹ thuật xuất khẩu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết chuyên sâu:

Thứ nhất, đặc điểm sinh học phân tử của họ Picornaviridae, chi Hepatovirus. HAV là virus dạng hạt hình khối 20 mặt đối xứng (đường kính 27 - 32 nm), không có vỏ bao ngoài, mang bộ gen RNA sợi đơn dương (+ssRNA) dài khoảng 7.500 nucleotide. Cấu trúc bộ gen bao gồm vùng 5’ không dịch mã liên kết với protein VPg, khung đọc mở ORF mã hóa tiền chất polyprotein để cắt thành các protein cấu trúc capsid (VP1, VP2, VP3, VP4) và protein phi cấu trúc (2A - 3D), cùng đuôi poly(A) ở đầu 3’. Vùng tiếp giáp giữa gen VP3 và VP1 chứa các đoạn nucleotide có tính bảo tồn rất cao giữa các kiểu gen (genotype I đến VII), tạo tiền đề vững chắc cho việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu.

Thứ hai, nguyên lý khuếch đại acid nucleic in vitro thông qua phản ứng phiên mã ngược (RT) kết hợp chuỗi trùng hợp polymerase (PCR). Kỹ thuật này chuyển đổi bộ gen ssRNA của virus thành cDNA bổ sung nhờ enzyme Reverse Transcriptase, sau đó khuếch đại hàng triệu lần đoạn gen mục tiêu 248 bp bằng DNA Polymerase chịu nhiệt.

Thứ ba, khung hướng dẫn xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích định tính vi sinh vật theo tiêu chuẩn quốc tế ISO/IEC 17025. Khung lý thuyết này chia quy trình thẩm định thành hai cấp độ: xác nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation tại phòng thí nghiệm nội bộ) và xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation thông qua thử nghiệm liên phòng quốc tế).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu thực nghiệm bao gồm 11 chủng vi sinh vật chuẩn và đối chứng: chủng chuẩn HAV ATCC VR-1357, Norovirus nhóm GI và GII, Mengovirus ATCC VR-2310, các virus thủy sản (WSSV, YHV từ bộ kit IQ2000), cùng các vi khuẩn đường ruột phổ biến gồm Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) và Listeria monocytogenes (ATCC 13932). Nền mẫu khảo sát là nghêu thương phẩm (Meretrix lyrata) thu thập định kỳ từ các vùng nuôi có kiểm soát và các lô hàng kiểm tra xuất khẩu của NAFIQAD 4.

Phương pháp chọn mẫu áp dụng là phương pháp lấy mẫu phân tầng có chủ đích, tập trung bóc tách riêng phần khối nội tạng tiêu hóa (digestive gland) – nơi tích tụ mật độ virus cao nhất. Quy trình phân tích gồm các bước chuẩn hóa:

• Xử lý mẫu và ly giải bằng Proteinase K (hoạt độ ≥ 30 U/mg), kết hợp bộ kit High Pure Viral RNA để chiết tách và tinh sạch RNA virus.
• Phản ứng RT sử dụng enzyme GoScript Reverse Transcriptase kết hợp mồi ngẫu nhiên (Random Primer) và MgCl2 ở nồng độ tối ưu.
• Phản ứng PCR sử dụng GoTaq G2 Hot Start Polymerase cùng cặp mồi khuếch đại vùng VP3-VP1 (mã số GenBank M14707): Mồi xuôi F (5’-GTT TTG CTC CTC TTT ATC ATG CTA TG-3’, Tm 57°C) và Mồi ngược R (5’-GGA AAT GTC TCA GGT ACT TTC TTG-3’, Tm 54,5°C), kích thước sản phẩm 248 bp.
• Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm huỳnh quang và đối chiếu kích thước bằng thang chuẩn 100bp DNA Ladder Plus.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích phân tử RT-PCR thay vì phương pháp nuôi cấy tế bào hay huyết thanh học truyền thống là vì HAV phát triển rất chậm trên nuôi cấy mô, không gây hiệu ứng hủy hoại tế bào rõ rệt (non-cytopathic) và đòi hỏi thời gian 3 - 4 tuần. RT-PCR cho phép rút ngắn thời gian phát hiện xuống còn 3 - 4 giờ với độ nhạy và tính đặc hiệu vượt trội.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã chứng minh các phát hiện quan trọng mang tính thực tiễn cao:

1. Độ đặc hiệu tuyệt đối của cặp mồi: Kiểm tra in silico bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI và thử nghiệm in vitro trên 10 chủng vi sinh vật không mục tiêu cho thấy cặp mồi khuếch đại đoạn gen VP3-VP1 chỉ bắt cặp chính xác với bộ gen HAV, tạo đúng một vạch điện di duy nhất tại kích thước 248 bp mà không xảy ra hiện tượng phản ứng chéo hay xuất hiện vạch mờ ngoài ý muốn.

2. Xác nhận hiệu lực sơ cấp với các chỉ số kỹ thuật vượt trội: Thử nghiệm xác định giới hạn phát hiện LOD50 đạt mức 5 PFU/g khối lượng nội tạng. Các thông số thẩm định phương pháp định tính ghi nhận: độ chính xác đạt 99,2%; độ nhạy chẩn đoán đạt 100%; độ đặc hiệu đạt 98,4%; tỷ lệ dương tính giả được kiểm soát ở mức 1,6% và tỷ lệ âm tính giả đạt 0,0%.

3. Đạt chuẩn xuất sắc trong thử nghiệm liên phòng quốc tế: Quy trình đã tham gia chương trình thử nghiệm thành thạo liên phòng quốc tế do Trung tâm Khoa học Môi trường, Thủy sản và Nuôi trồng Thủy sản Vương quốc Anh (CEFAS) tổ chức. Kết quả phân tích trên 6 mẫu mù mã hóa (SF1, SF2, SF3, SF4, L1, L2) đạt kết quả Loại A (Class A), hoàn toàn tương thích và đồng nhất với công bố của các phòng thí nghiệm tham chiếu hàng đầu thế giới.

4. Thực trạng ô nhiễm HAV trên thực địa: Ứng dụng quy trình khảo sát trên các mẫu nghêu tại 2 vùng nuôi trọng điểm cho thấy tỷ lệ nhiễm HAV dao động từ 5,0% đến 15,0%. Đối với các lô hàng nghêu thành phẩm chuẩn bị xuất khẩu, tỷ lệ phát hiện mẫu dương tính với HAV là 12,5%.

Thảo luận kết quả

Khả năng phát hiện mẫu ở mức nồng độ thấp 5 PFU/g khẳng định việc tối ưu hóa nồng độ ion MgCl2 trong phản ứng RT và phản ứng PCR, cùng việc sử dụng enzyme Hot Start Polymerase, đã triệt tiêu hiện tượng ức chế phản ứng từ các tạp chất hữu cơ có trong nội tạng nhuyễn thể. Tỷ lệ âm tính giả đạt 0,0% là yếu tố then chốt, đảm bảo không bỏ sót các lô hàng nhiễm bệnh khi xuất nhập khẩu.

So sánh với các nghiên cứu trước đây tại miền Nam Việt Nam (tiêu biểu như khảo sát của một nhóm tác giả năm 2010 ghi nhận tỷ lệ nhiễm HAV tại vùng nuôi Cần Giờ lên tới 57,1% và trên thị trường tiêu dùng là gần 77%), tỷ lệ nhiễm 5,0% - 15,0% trong nghiên cứu này cho thấy chất lượng môi trường vùng nuôi đã có cải thiện nhờ các chương trình kiểm soát nguồn nước. Tuy nhiên, mức độ hiện diện 12,5% trên các lô hàng xuất khẩu vẫn là một cảnh báo lớn. Nguyên nhân chủ yếu xuất phát từ nguồn nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý triệt để xả thẳng ra các cửa sông ven biển, cộng với tập tính ăn lọc làm virus tích tụ trong tuyến tiêu hóa của nghêu.

Trong thực tế báo cáo, các dữ liệu phân tích này có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ nhiễm giữa các vùng địa lý (Cần Giờ, Bình Đại, Ba Tri, Thạnh Phú) và bảng ma trận tổng hợp các thông số kỹ thuật (LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu) so với các tiêu chuẩn quốc tế công bố. Điều này giúp các nhà quản lý chất lượng dễ dàng nhận diện điểm nóng rủi ro và đánh giá năng lực kiểm nghiệm một cách trực quan.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể được đề xuất nhằm nâng cao năng lực kiểm soát an toàn sinh học:

1. Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kiểm nghiệm: Ban hành và áp dụng thống nhất quy trình thao tác chuẩn (SOP) RT-PCR phát hiện HAV tại hệ thống các phòng kiểm nghiệm của Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản trên toàn quốc; hướng tới mục tiêu duy trì độ chính xác kiểm nghiệm trên 99,5% trong giai đoạn 2017 - 2020 do NAFIQAD chủ trì triển khai.

2. Mở rộng chương trình giám sát quốc gia định kỳ: Tích hợp chỉ tiêu HAV vào chương trình quan trắc quốc gia về kiểm soát vùng nuôi và thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ có kiểm soát tại các tỉnh ven biển Nam Bộ; thực hiện quan trắc định kỳ 1 tháng/lần nhằm giảm tỷ lệ nhiễm mầm bệnh tại vùng nuôi xuống dưới 3,0% trước năm 2022 dưới sự quản lý của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

3. Bắt buộc kiểm soát khâu chế biến và truy xuất nguồn gốc: Yêu cầu 100% doanh nghiệp chế biến nghêu xuất khẩu sang thị trường EU, Nhật Bản và Bắc Mỹ áp dụng quy trình xử lý nhiệt tâm sản phẩm đạt tối thiểu 85 - 90°C trong thời gian 90 giây trở lên, hoặc lưu giữ làm sạch trong hệ thống nước khử trùng bằng ozone/tia cực tím tối thiểu 42 giờ; hoàn thành kiểm toán hệ thống HACCP trong quý 3/2017 do Chi cục Thủy sản địa phương giám sát.

4. Nghiên cứu tối ưu hóa kỹ thuật One-step RT-PCR: Đẩy mạnh thử nghiệm và hoàn thiện quy trình One-step RT-PCR (phối hợp phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại trong cùng một ống nghiệm) tại các viện nghiên cứu và trường đại học; hướng đến mục tiêu rút ngắn 40% thời gian chạy máy (từ 4 giờ xuống còn 2,5 giờ) và giảm 25% chi phí hóa chất thử nghiệm trong chu kỳ nghiên cứu 12 - 18 tháng tiếp theo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Cán bộ kỹ thuật và chuyên viên kiểm nghiệm tại các phòng phân tích thực phẩm: Cung cấp tài liệu chi tiết về thành phần hóa chất, chu trình nhiệt và phương pháp đánh giá hiệu lực phương pháp theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, giúp xây dựng và thẩm định các phép thử sinh học phân tử đạt chứng nhận quốc tế.

2. Các doanh nghiệp nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu thủy hải sản: Giúp đội ngũ QA/QC nắm vững cơ chế tích tụ virus của động vật thân mềm, hiểu rõ các thông số gia nhiệt (85 - 90°C) và thời gian lưu giữ làm sạch để thiết lập hệ thống kiểm soát tới hạn (CCP) trong chuỗi cung ứng.

3. Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học và Bệnh học thủy sản: Sử dụng làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp thiết kế mồi, kỹ thuật tối ưu hóa nồng độ ion MgCl2, mồi ngẫu nhiên và quy trình thực hiện thử nghiệm liên phòng quốc tế với CEFAS.

4. Cơ quan quản lý nhà nước và hoạch định chính sách an toàn thực phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học và số liệu thực tế về tỷ lệ nhiễm mầm bệnh (5,0% - 15,0%) để hoàn thiện khung tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao vị thế thủy sản Việt Nam trên trường quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần kiểm tra trực tiếp HAV bằng kỹ thuật RT-PCR thay vì chỉ đánh giá các vi khuẩn chỉ thị vệ sinh? Các vi khuẩn chỉ thị truyền thống như Coliforms hay E. coli không phản ánh chính xác sự tồn tại của HAV. Virus có kích thước nhỏ, vỏ capsid bền vững, có khả năng tồn tại tới 12 tuần trong môi trường đất/nước và chịu được các điều kiện xử lý hóa chất nhẹ. Nhiều mẫu nhuyễn thể có mật độ vi khuẩn chỉ thị đạt ngưỡng an toàn (dưới 70 Coliforms/100g) nhưng vẫn ghi nhận sự hiện diện của HAV, do đó việc phân tích trực tiếp bằng RT-PCR là giải pháp bắt buộc để loại trừ rủi ro.

Quy trình RT-PCR này có ưu thế gì so với phương pháp nuôi cấy tế bào virus truyền thống? HAV rất khó nuôi cấy, phát triển chậm và không tạo hiệu ứng hủy hoại tế bào rõ rệt trên các dòng tế bào như FRhK-4 hay BSC-1, đòi hỏi thời gian theo dõi từ 7 ngày đến 4 tuần với trang thiết bị đắt tiền. Quy trình RT-PCR rút ngắn thời gian phân tích xuống còn 3 - 4 giờ, phát hiện chính xác trình tự gen 248 bp với độ nhạy chẩn đoán tuyệt đối 100%.

Giới hạn phát hiện LOD50 là 5 PFU/g nội tạng có ý nghĩa như thế nào trong thực tiễn kiểm nghiệm? LOD50 ở mức 5 PFU/g (Plaque Forming Unit trên mỗi gam khối lượng nội tạng) chứng minh phương pháp có khả năng phát hiện mầm bệnh ngay từ mật độ cực thấp. Điều này cho phép cảnh báo sớm tình trạng ô nhiễm virus tại các vùng nuôi trước khi tích tụ thành liều lượng gây dịch, đáp ứng hoàn toàn các tiêu chuẩn kỹ thuật khắt khe của các nước nhập khẩu khó tính như EU và Hoa Kỳ.

Kết quả xếp loại A trong thử nghiệm liên phòng quốc tế của CEFAS chứng minh điều gì? Kết quả Loại A khẳng định quy trình phân tích được xây dựng tại Việt Nam có độ chính xác, độ lặp lại và độ tái lặp tương đương với các phòng kiểm nghiệm tham chiếu hàng đầu thế giới. Đây là bằng chứng pháp lý và khoa học vững chắc giúp các chứng thư kiểm nghiệm chất lượng của Việt Nam được công nhận trên thị trường quốc tế.

Người tiêu dùng và cơ sở chế biến cần xử lý nhiệt như thế nào để bất hoạt hoàn toàn HAV trong nhuyễn thể? HAV có khả năng chịu nhiệt cao, sống sót được ở 70°C trong 10 phút. Theo khuyến cáo từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và dữ liệu thực nghiệm, nhuyễn thể hai mảnh vỏ từ các vùng có nguy cơ phải được gia nhiệt sao cho tâm sản phẩm đạt nhiệt độ 85 - 90°C và duy trì liên tục từ 90 giây đến 4 phút để phá hủy hoàn toàn cấu trúc capsid và bất hoạt bộ gen virus.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình RT-PCR chuyên biệt phát hiện Hepatitis A Virus trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên đoạn gen bảo tồn VP3-VP1 có kích thước 248 bp.
• Xác lập bộ thông số kỹ thuật tối ưu với LOD50 đạt 5 PFU/g nội tạng, độ chính xác 99,2%, độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 98,4% và tỷ lệ âm tính giả 0,0%.
• Đạt chứng nhận Loại A trong chương trình thử nghiệm thành thạo liên phòng quốc tế do CEFAS (Vương quốc Anh) tổ chức, khẳng định độ tin cậy mang tầm quốc tế.
• Khảo sát thực tế cung cấp bức tranh dịch tễ rõ nét với tỷ lệ nhiễm HAV từ 5,0% đến 15,0% tại vùng nuôi Cần Giờ, Bến Tre và 12,5% trên các lô hàng xuất khẩu.
• Hoàn thiện các bước nghiên cứu ban đầu cho kỹ thuật One-step RT-PCR, mở ra hướng đi tinh gọn hóa quy trình xét nghiệm trong tương lai.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là tạo ra một công cụ kiểm nghiệm sinh học phân tử có độ tin cậy cao, giải quyết triệt để bài toán rào cản kỹ thuật cho ngành thủy sản Việt Nam. Kế hoạch tiếp theo trong giai đoạn 2017 - 2020 là chuyển giao quy trình thành công nghệ phân tích thường quy tại các trung tâm kiểm nghiệm vùng và mở rộng giám sát quốc gia. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp thủy hải sản hãy chủ động áp dụng quy trình kiểm chuẩn này vào hệ thống kiểm soát chất lượng nội bộ để đảm bảo an toàn tuyệt đối cho người tiêu dùng và nâng cao giá trị thương hiệu xuất khẩu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Lời mở đầu - Áp dụng quy trình phát hiện HAV đã xây dựng để khảo sát mức độ hiện diện HAV trong các mẫu vùng nuôi và mẫu lô hàng của 2 vùng thu hoạch NT2MV đƣợc kiểm soát. - Áp dụng quy trình phát hiện HAV đã xây dựng để tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế về Norovirus và HAV. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 5 Tổng Quan 1. TỔNG QUAN GVHD: TS.

NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 6 Tổng Quan 1.1/ Tổng quan về virus viêm gan A 1.1/ Lịch sử phát hiện HAV Dựa theo lịch sử y khoa, bắt đầu từ thế kỷ thứ 5 trƣớc Công Nguyên loài ngƣời có những miêu tả về những trận dịch vàng da (jaundice outbreaks) xảy ra tại nhiều nơi khác nhau trên thế giới, nhất là ở những thành phố lớn đông dân cƣ hoặc ở những trại lính chật chội. Ngƣời bệnh đang sống rất khỏe mạnh, bỗng dƣng bị đau bụng, tiêu chảy và biểu hiện vàng da [7]. Trong Thế Chiến thứ 2, một cơn dịch cảm cúm đã lây lan nhanh chóng với khoảng 200.000 ngƣời Mỹ và hơn 5 triệu ngƣời dân địa phƣơng bỗng dƣng ngã bệnh. Lúc bấy giờ ngƣời ta chƣa hiểu rõ nguyên nhân một cách chính xác, họ cho rằng bệnh nhân bị ngộ nƣớc hoặc trúng độc.

Vào những năm 1930, với sự phẫu thuật lấy tế bào gan – sinh thiết gan (liver biopsy) để khám nghiệm dƣới kính hiển vi, y khoa đã tiến một bƣớc rất dài trong việc xác định bệnh viêm gan. Nhƣng tới năm 1973 ngƣời ta mới nhận ra đƣợc sự có mặt của virus viêm gan A trong cơ thể của ngƣời bệnh thông qua việc nuôi cấy tế bào. Một trong những nguyên nhân phổ biến của bệnh viêm gan cấp tính là do virus viêm gan A (HAV), đƣợc nghiên cứu bởi Purcell vào năm 1973. Năm 1980, các nhà khoa học khẳng định sự hiện diện của virus này bằng các phản ứng ngƣng kết huyết thanh.

Từ đó dịch tễ học, lâm sàng, sự phát hiện trong tự nhiên của virus viêm gan A đã trở nên rõ ràng hơn. Kết quả nghiên cứu này dẫn đến sự phát triển một phƣơng thức tiếp cận cho những cách phát hiện, kiểm soát, ngăn ngừa sự lây lan cũng nhƣ sự bùng phát thành dịch của virus viêm gan A này [7]. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 7 Tổng Quan 1.2/ Đặc điểm sinh học của HAV 1.1/ Phân loại Hepatitis A virus (HAV) là loài thuộc chi Hepatovirus, vị trí trong giới phân loại nhƣ sau: Họ: Picornaviridae Chi : Hepatovirus Loài: Hepatitis A virus Group: (+) ssRNA HAV là cá thể duy nhất trong chi Hepatovirus [26,52]. Có bảy kiểu gen khác nhau, đánh số từ I đến VII.

Bốn kiểu gen trong số này là I, II, III, và VII gây bệnh trên ngƣời, trong các kiểu gen gây bệnh trên ngƣời đƣợc phân thành 6 phân nhóm là IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB [17], 80% chủng HAV gây bệnh cho ngƣời có kiểu gen I [26]. Các kiểu gen IV, V, VI gây bệnh trên các động vật linh trƣởng nhƣ khỉ, tinh tinh. Những phát hiện đầu tiên của HAV là trên loài khỉ cú (owl monkey) [43].2/ Đặc điểm hình thái và cấu trúc HAV a) Đặc điểm hình thái Bộ gene HAV là RNA sợi đơn, đƣợc bao bọc trong vỏ capsid. HAV có cấu trúc hình khối với 20 mặt tam giác đều, đƣờng kính hạt virus là 27-32 nm [18,23,25,33].

HAV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử (x 400. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 8 Tổng Quan Virus chỉ chứa những gì cần thiết để chúng thực hiện sự xâm nhiễm vào tế bào chủ. HAV cũng không ngoại lệ, chúng chỉ tồn tại ở dạng nucleocapsid, không có vỏ bao ngoài. Capsid là lớp vỏ protein của virus bao bọc nucleic acid và đƣợc cấu thành từ các đơn vị hình thái.

Capsomere là các đơn vị hình thái quan sát đƣợc trên bề mặt của các hạt virus tƣơng ứng với tập hợp các đơn vị cấu trúc. Promoter là các đơn vị cấu trúc nhỏ nhất. Capsid của HAV đƣợc tạo thành từ các tiểu đơn vị hình thái gọi là capsomer. Mỗi capsomere bao gồm năm protomers.

Mỗi protomer của HAV đƣợc làm bằng ba protein là VP1, VP2 và VP3 [37]. Hình dạng hạt virus và cấu trúc các tiểu đơn vị tạo nên vỏ capsid HAV [67] b) Đặc điểm cấu trúc bộ gen HAV Chú thích vùng gen 2BC và P3 Tiền vỏ capsid 2B: tạo cơ chế ẩm bào 2C: tạo enzyme helicase 3A: tạo protein bám màng tế bào chủ 3B: tạo mồi phiên mã ngƣợc Hạt virus 3D: enzyme polymerase Hình 1. Tổ chức bộ gen của HAV [13,29] GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 9 Tổng Quan Bộ gen HAV gồm khoảng 7500 nucleotide.

Có ba khu vực chính trong bộ gen: - Vùng 5’ không dịch mã dài 742 nucleotide. Vùng này gắn với VPg đƣợc mã hóa từ vùng gen 3B. VPg là một protein của virus có điểm đẳng điện thấp hơn các picornavirus khác. VPg hỗ trợ cho quá trình bắt đầu sao chép của RNA virus [64].

- Vùng ORF dài 6681 nucleotide, gồm: + Vùng ORF gồm 3 phần chính là P1-2A, 2BC, P3. Vùng gen P1-2A đƣợc dịch mã và đồng thời xử lý bởi một protease của virus để tạo bốn loại protein có cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4; và bảy protein không có cấu trúc 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D. Bốn protein cấu trúc mã hóa cho các protein tạo vỏ capsid polypeptid và kháng nguyên của HAV. Các kháng nguyên của HAV chủ yếu nằm tại vùng VP1, VP3 [26].

Vùng gen 2BC và P3 mã hóa tạo 7 protein không cấu trúc là 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D. Trong đó, vùng 3C mã hóa tạo protease và vùng gen 3D mã hóa tạo RNA polymerase. Các yếu tố này giúp RNA virus thực hiện quá trình dịch mã tạo các thành phần cho quá trình lắp ráp và nhân lên trong tế bào chủ [26,58]. + Vỏ capsid của HAV gồm ba protein: VP1 là cấu trúc chính khoảng 33kDa, VP2 khoảng 27kDa và VP3 khoảng 29kDa [65].

Dựa trên trình tự nucleotide, một protein capsid thứ tƣ – VP4, khoảng 2,5 kDa đƣợc mã hóa nhƣng chƣa đƣợc xác định trong cấu trúc của virion trƣởng thành [65]. - Vùng 3' không mã hoá dài 63 nucleotide, gắn với đuôi poly A, đuôi poly A có chức năng bảo vệ sợi RNA virus tránh sự phân hủy của các RNase. - HAV xuất hiện trong vật chủ, cũng giống nhƣ các loài picornavirus khác. Locarniniet và cộng sự [36] đã phát hiện có khoảng 11 protein của virus trong các tế bào chủng HM175 bị nhiễm HAV.

Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác cho thấy chỉ có các protein cấu trúc của HAV trƣởng thành mới đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm bệnh [19,53]. Điều này đƣợc giải thích có thể là do sự ổn định của VPg hoặc tốc độ tăng trƣởng chậm và không đồng đều của HAV. NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 10 Tổng Quan 1.3/ Vị trí kháng nguyên HAV Các loài trong họ picornavirus đƣợc phân biệt là do sự xuất hiện của các kháng nguyên khác nhau [9]. Những khác biệt này dựa trên hình dạng, độ lớn phân tử trên bề mặt của vỏ capsid virus [9,49].

Nghiên cứu bằng tia X trên bề mặt lớp vỏ capsid virus đã xác định protein VP1 là protein tiếp xúc lớn [20]. Sự sắp xếp trình tự acid amin trong vùng gen VP1 của HAV đã xác định đƣợc ba peptide tạo kháng nguyên [48]. Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng, HAV bị đột biến chủ yếu là do quá trình tiếp xúc với kháng thể hoặc bị kháng thể trung hòa. Vùng gen VP1, VP3 chứa các acid amin có thể thay đổi trình tự để tạo các epitope hạn chế quá trình nhận diện kháng nguyên của các kháng thể [60].

Các nghiên cứu về bộ gen của HAV cho rằng chỉ có 6 trong số 11 axit amin nằm ở vùng gen VP1 và VP3 là tạo các protein kết hợp đƣợc với kháng thể. Quá trình tiếp xúc này sẽ làm thay đổi các axit amin có thể giúp HAV tạo ra các biến thể, tránh đƣợc sự trung hòa kháng nguyên. Các locus VP1 và VP3 mã hóa các kháng nguyên đƣợc đặt khá xa nhau, nhƣng chúng cũng đã kết hợp lại với nhau để tạo thành một yếu tố quyết định tính kháng nguyên duy nhất [20].4/ Sự nhân bản trong tế bào nuôi cấy Hình 1. Sự nhân bản HAV trong tế bào chủ [67] GVHD: TS.

NGUYỄN TIẾN DŨNG HVTH: ĐOÀN MINH QUÂN Luận văn Thạc sĩ 11 Tổng Quan Ở mức độ tế bào, HAV đi vào tế bào chủ thông qua sự ẩm bào. Tiếp đó, lyzosome của tế bào chủ sẽ ly giải hạt virus, để giải phóng RNA vào bên trong tế bào chất. Quá trình phiên mã ngƣợc sẽ diễn ra để tạo cDNA của HAV. Tiếp đó, cDNA thực hiện tiếp 2 quá trình: - Dịch mã tạo polyprotein, các polyprotein này sẽ tạo ra các capsomer của vỏ capsid virus sau này.

- Phiên mã tạo ra mRNA, mRNA sẽ sử dụng các thành phần có sẵn của tế bào chủ nhƣ polymerase, ribosome… để tạo các yếu tố còn lại của virus. mRNA sẽ là vật liệu di truyền cho thế hệ HAV tiếp theo sau khi đƣợc giải phóng khỏi tế bào chủ. - Các capsomer sẽ liên kết với nhau và bao lấy mRNA bên trong. Hạt virus HAV hoàn chỉnh đƣợc hình thành và giải phóng khỏi tế bào chủ ban đầu.

Ở mức độ cơ thể, HAV đi vào máu thông qua các biểu mô của hầu họng hoặc ruột. Máu mang virus này tới gan, nơi mà virus sẽ nhân bản bên trong tế bào gan và các tế bào Kupffer (đại thực bào gan). Việc gắn vào tế bào chủ đƣợc thực hiện bằng tƣơng tác giữa kháng nguyên của HAV và các thụ thể đính trên tế bào chủ. Sau khi thực hiện quá trình nhân bản, virus ra khỏi các tế bào chủ bằng cách ly giải.

Lúc này virus tồn tại dƣới dạng virion. Các virion đƣợc tiết vào mật và đào thải trong phân. Theo các nghiên cứu cho thấy, HAV đƣợc đào thải với số lƣợng lớn khoảng 11 ngày trƣớc khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc xuất hiện kháng thể IgM trong máu. Các giai đoạn ủ bệnh là 15-50 ngày [20].

Trong các tế bào gan, bộ gen RNA đƣợc giải phóng từ lớp vỏ protein capsid của virus, sau đó sử dụng ribosome của tế bào chủ cho việc dịch mã. Không giống nhƣ các picornavirus khác, virus này đòi hỏi tế bào chủ phải có tiểu phần eIF4G cho việc khởi đầu sao chép [52]. Các nghiên cứu gần đây cũng cho rằng các đoạn gen tại đầu 5’ của HAV không tiếp xúc hiệu quả với ribosome của tế bào chủ, vì thế quá trình khởi sự dịch mã thƣờng GVHD: TS.