Chương 1 TỔNG QUAN -3- 1. KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LAO 1. Đặc điểm chung về vi khuẩn lao Vi khuẩn lao đƣợc biết từ lâu tồn tại khoảng 15.400 năm, căn cứ vào tính đa dạng của chủng vi khuẩn và khả năng đột biến, cho thấy chúng là loài vi khuẩn tiến triển rất nhiều so với dạng nguyên thuỷ nhƣng vẫn thuộc giống Mycobacterium. Nhóm gây bệnh quan trọng nhất trong giống Mycobacterium là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex bao gồm 5 loài: (1) Mycobacterium tuberculosis là nguyên nhân chính gây bệnh lao ở ngƣời, đƣợc Rober Koch phân lập năm 1882, (2) Mycobacterium bovis có thể lây truyền bệnh từ bò sang ngƣời do sử dụng sữa bò mắc lao chƣa tiệt khuẩn.
Vi khuẩn cũng có thể lây truyền từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành, (3) Mycobacterium microti phân lập từ chuột đồng (Microtus agrestis) do Wells 1937 và đƣợc Reed đặt tên năm 1959, có độc lực rất thấp đối với chuột lang và ngƣời, (4) Mycobacterium africanum là một loài đƣợc cho là trung gian giữa M. bovis, thỉnh thoảng xuất hiện ở Châu Phi và thƣờng đề kháng tự nhiên với thioacetazone, (5) Mycobacterium canettii là một loài mới đƣợc bổ sung vào từ năm 1997, gây bệnh ở chuột đồng, chuột trù và chuột rừng. Các loài vi khuẩn lao trên đƣợc gọi là Mycobacterium tuberculosis complex, bởi vì trong bộ gen của chúng cùng có chung một hay nhiều đoạn gen IS 6110 đặc thù mà các loài vi khuẩn lao khác không có [1,5,6,32]. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao Vi khuẩn gây bệnh lao tại nhiều cơ quan trong cơ thể, nhƣng nhiều nhất là lao phổi.
Vi khuẩn xâm nhập qua đƣờng hô hấp. Ở lần xâm nhập đầu tiên vi khuẩn gây nên những tổn thƣơng tiết dịch tại phổi và nhanh chóng xâm nhập vào mạch bạch huyết và hạch bạch huyết. Những tổn thƣơng này thƣờng lành nhanh chóng và những hạch bạch huyết trở thành bả đậu và sau đó hóa canxi. Ở lần tái nhiễm sau, những tổn thƣơng trở nên mạn tính có ba vùng: ở trung tâm là lớp tế bào khổng lồ chứa vi khuẩn, ở giữa là tế bào giống biểu mô thƣờng xếp thành tia, ở ngoài là tế bào sợi, lympho bào, đơn bào.
Sau cùng, ở ngoài thành lập mô sợi và ở trung tâm bị -4- hoại tử bả đậu, đó hạt lao. Tổn thƣơng này có thể vỡ tạo thành một hang, hang này có thể lành bằng cách hóa sợi hay hóa vôi. Từ đây vi khuẩn có thể theo đƣờng bạch huyết, đƣờng máu đi khắp các cơ quan trong cơ thể, và gây nên lao xƣơng, lao khớp, lao màng não, lao ruột, lao thận, lao hạch. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao 1.
Đặc điểm cấu tạo vi khuẩn lao Vi khuẩn hình que cong, nhỏ, chiều dài từ 3 - 5 µm, rộng 0,3 - 0,5 µm, có nhiều hạt trên thân, không vỏ, không di động, không bào tử. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm: (1) Lớp lipid bên ngoài (2) Lớp acide mycolic (3) Lớp polysacharid (4) Lớp peptidoglycan (5) Lớp màng plasma (6) Lớp lipoarabinomannan (7) Lớp phosphatidylinositol mannoside (8) Lớp khung vách tế bào Hình 1.1: Cấu tạo vách tế bào vi khuẩn lao [6] -5- Cấu trúc vách tế bào và acide mycolic giúp vi khuẩn có sức chịu đựng cao, làm tăng tính kháng thuốc do làm phân hủy các hoá chất và ngăn chặn hiệu quả hoạt động của kháng sinh, giúp cho vi khuẩn phát triển đƣợc bên trong đại thực bào và lẩn tránh hệ thống miễn dịch của chủ thể. Cấu trúc vách tế bào vi khuẩn lao có lớp sáp không thấm nƣớc, chống lại sự xâm nhập của thuốc nhuộm nên rất khó phát hiện bằng các thuốc nhuộm thông thƣờng. Với phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen thuốc nhuộm Carbol fuchsin có thể thấm qua đƣợc vách sáp dày khi đốt nóng, chúng bắt màu đỏ fuchsin và không bị tẩy màu bởi acid alcohol, nên gọi tên là vi khuẩn kháng acid alcohol [1,5].
Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí, sinh sản chậm trong điều kiện bình thƣờng trung bình 20 - 24 giờ/1lần (E.coli chỉ mất 20 phút), có khi hàng tháng, thậm chí tồn tại ở tổn thƣơng rất lâu, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể phát triển trở lại. Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3 - 4 tháng, trong phòng thí nghiệm ngƣời ta có thể bảo quản vi khuẩn sống trong nhiều năm. Trong đàm của bệnh nhân lao ở phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ đƣợc độc lực. Dƣới ánh nắng mặt trời vi khuẩn bị chết sau 2 giờ.
Ở 42 0C vi khuẩn ngừng phát triển và ở 80 0C chết sau 10 phút. Vi khuẩn lao chỉ mọc đƣợc ở trong môi trƣờng nuôi cấy đặc biệt chứa đầy đủ đƣờng, đạm, dƣỡng khí, các loại muối, các vitamin, pH từ 6,8 đến 7,2 kích thích sự tăng trƣởng của vi khuẩn [5,6]. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Kháng thuốc là khả năng sống sót và sinh sản của các chủng vi khuẩn lao sau khi đã tiếp xúc với thuốc ở nồng độ có thể diệt hoặc ức chế vi khuẩn. Vi khuẩn lao có khả năng đề kháng với một số kháng sinh, kháng thuốc có thể là đặc tính của loài do đột biến gen.
Gen qui định tính kháng thuốc của vi khuẩn nằm trên nhiễm sắc thể và di truyền cho thế hệ sau. Hiện nay ngƣời ta đã xác định đƣợc bản đồ gen và nhiều mã gen kháng thuốc của vi khuẩn lao, gen kháng thuốc mã hoá thông tin từ đó vi sinh vật sử dụng để chống lại tác động của kháng sinh theo các cơ chế sau đây: - Làm giảm tính thấm của màng nguyên tƣơng. -6- - Làm thay đổi đích tác động của kháng sinh. - Tạo ra các isoenzym không có ái lực với kháng sinh nên bỏ qua tác động của kháng sinh.
- Tạo ra enzym: các enzym do gen đề kháng tạo ra có thể biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh. Một số gen kháng thuốc: - Vi khuẩn kháng Rifampin đột biến ở gen rpoB mã hóa sự tổng hợp ARN- polymerase - Vi khuẩn kháng Isoniazid đột biến ở gen KatG, InhA, ahpC. - Vi khuẩn kháng Streptomycin và các aminoglycozide: đột biến ở gen rrS, rpsL hoặc cả hai gen này. - Vi khuẩn kháng Pyrazinamid: đột biến ở gen pncA Trong đó Rifampin và Isoniazid là hai kháng sinh có hiệu lực diệt vi khuẩn mạnh nhất trong điều trị bệnh lao (phác đồ 1), nếu kết quả kháng sinh đồ vi khuẩn cùng kháng hai loại kháng sinh này thì kết luận là đa kháng thuốc và phải đổi phác đồ điều trị [1,5,6].
CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO 1. Quá trình phát triển các kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn lao Vi khuẩn lao gây bệnh lao cho ngƣời đƣợc biết từ rất lâu, để chống lại bệnh nguy hiểm này ngƣời ta đã tìm ra nhiều phƣơng pháp để phát hiện vi khuẩn lao và tính đề kháng thuốc của vi khuẩn với các loại kháng sinh, giúp chọn phác đồ điều trị hiệu quả, nhằm ngăn ngừa sự lây lan và tính đa kháng thuốc của vi khuẩn lao. Từ những năm 1882 Robert Koch đã phân lập đƣợc vi khuẩn lao. Dựa vào đặc điểm sinh học của vi khuẩn ngƣời ta tìm ra những phƣơng pháp chẩn đoán nhƣ: Phƣơng pháp nhuộm, soi KHV phát hiện vi khuẩn dụa vào cấu trúc và tính bắt màu của vi khuẩn.
Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể ngƣời, cơ thể sẽ phản ứng chống lại sự nhiễm khuẩn. Dựa vào những đặc điểm đó ngƣời ta tìm ra các phƣơng pháp miễn dịch vào những năm 1900s. Dựa vào đặc điển sinh học, phƣơng pháp nuôi cấy định danh và kháng sinh đồ cũng đƣợc thực hiện vào những năm 1920s và đến thập niên 1990s phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc ứng dụng. -7- Quá trình phát triển của các kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn lao 1880s Phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen Soi phát hiện AFB 1900s Mantoux test (tuberculin) Miễn dịch 1920s Purified Protein Derivative (PPD) Nuôi cấy 1930s Lowenstein-Jensen 1940s Dubos agar, Ogawa 1950s Middlebrook 1990s Khuếch đại Acid Nucleic SHPT 2000s ELISPOT, QuantiFERON 200X Bactec, MGIT 20XX DNA Strip, Xpert.
Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao 1. Phƣơng pháp nhuộm soi phát hiện vi khuẩn lao Phƣơng pháp soi phát hiện vi khuẩn lao thực hiện đơn giản, nhanh, phát hiện đánh giá đƣợc mật độ vi khuẩn lao, tuy nhiên mật độ vi khuẩn trong 1 ml đàm phải có từ 5,000 AFB thì mới phát hiện đƣợc. Các loại vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium có cấu trúc nhiều mỡ, acid béo và sáp trong tế bào. những chất này không thắm nƣớc, làm cho tế bào vi khuẩn không bắt màu trong các phƣơng pháp nhuộm thông thƣờng.
Nhƣng nếu sử dụng thuốc nhuộm chuyên biệt (thuốc nhuộm kiềm), cùng với sự hơ nóng thì màu nhuộm ngấm dễ dàng vào tế bào vi khuẩn. Khi đã bắt màu thì vi khuẩn không bị tẩy màu bởi acid alcohol. Hiện nay thƣờng sử dụng hai phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen và huỳnh quang (Fluorescence). Với nhuộm Ziehl Neelsen thuốc nhuộm là Carbol fuchsin kèm với sự đốt nóng, tẩy màu bởi acid alcohol và chất màu nền Methylen Blue, vi khuẩn lao sẽ bắt màu đỏ Fuchin trên nến xanh của Methylen blue.
Phƣơng pháp nhuộm huỳnh quang thuốc nhuộm là Auramin O, tẩy màu bở,i acid alcohol và chất màu Potassium Permanganate, vi khuẩn lao phát vàng (huỳnh quang) khi soi với -8- kính hiển vi huỳnh quang. Phƣơng pháp nhuộm huỳnh quang cho kết quả độ nhạy cao hơn phƣơng pháp Ziehl neelsen, nhƣng độ đặc hiệu không bằng nhuộm Ziehl Neelsen vì có một số bacilli không thuộc Mycobacteria cũng phát quang trong phƣơng pháp nhuộm huỳnh quang. Hai phƣơng pháp thực phiến phết nhuộm soi từ mẫu thử là phƣơng pháp trực tiếp và tập trung. Phƣơng trực tiếp thực hiện phiến phết trực tiếp tứ mẫu thử.
Phƣơng pháp tập trung mẫu thử dùng chất hòa tan mẫu thử, đánh tan thuần nhất mẫu thử sau đó ly tâm lấy cặn lắng làm phiến phết. Phƣơng pháp soi phát hiện vi khuẩn lao không phân biệt đƣợc MTBC với Non-tuberculous mycobateria (NTM), vi khuẩn sống hay chết và không biết đƣợc tính kháng thuốc của vi khuẩn [4,32,42,48]. Phƣơng pháp nuôi cấy và kháng sinh đồ Nuôi cấy là phƣơng pháp chẩn đoán chính xác để xác định có vi khuẩn lao ở trong mẫu thử của ngƣời nghi lao. Đây là một xét nghiệm có độ đặc hiệu rất cao, vì mỗi một vi khuẩn lao sẽ mọc thành một khuẩn lạc dễ quan sát bằng mắt thƣờng.
Nuôi cấy phát hiện dễ, sớm trƣớc cả giai đoạn lây và phát hiện tăng hơn 30 - 50% các trƣờng hợp so với phƣơng pháp soi phát hiện AFB. Phƣơng pháp nuôi cấy rất nhạy, chỉ cần vài đến 10 vi khuẩn là có thể phát hiện đƣợc vi khuẩn lao.
