HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN KHỞI ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT (Phakopsora pachyrhizi Sydow) NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP – 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN KHỞI ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT (Phakopsora pachyrhizi Sydow) Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 9 62 01 11 Người hướng dẫn khoa học: GS. Phan Hữu Tôn TS. Nguyễn Thanh Tuấn HÀ NỘI – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng sử dụng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày.năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Văn Khởi i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. Phan Hữu Tôn và TS. Nguyễn Thanh Tuấn đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm, các đồng nghiệp thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án. Tác giả luận án Nguyễn Văn Khởi ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình x Trích yếu của luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN 1.
Tính cấp thiết của đề tài 1 1. Mục tiêu nghiên cứu 2 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 1. Tính mới và những đóng góp của luận án 3 1.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4 2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng 4 2. Tình hình sản xuất trên thế giới 4 2.
Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam 5 2. Một số yếu tố hạn chế sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam 6 2. Bệnh gỉ sắt, phân bố và tầm quan trọng 6 2. Triệu chứng bệnh 6 2.
Phạm vi và tác hại của bệnh gỉ sắt 8 2. Tƣơng tác ký chủ - thể gây bệnh 9 2. Đa dạng và tính biến chủng của nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow 9 2. Các phƣơng pháp đánh giá bệnh 13 2.
Đánh giá nguồn gen đậu tƣơng 15 2. Di truyền tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng và chỉ thị phân tử liên kết 18 2. Di truyền tính kháng và hiệu lực kháng của các gen 18 2. Chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng 21 iii 2.
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 24 2. Chỉ thị phân tử ADN 24 2. Ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn tạo giống cây trồng 26 2. Một số thành tựu trong chọn tạo giống đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt 30 PHẦN 3.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3. Địa điểm nghiên cứu 33 3. Thời gian nghiên cứu 33 3. Vật liệu nghiên cứu 33 3.
Nội dung nghiên cứu 36 3. Đánh giá vật liệu khởi đầu phục vụ công tác lai tạo và chọn lọc các dòng đậu tƣơng năng suất cao, kháng bệnh gỉ sắt 36 3. Lựa chọn chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với gen kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng 36 3. Lai tạo và chọn lọc dòng đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt 36 3.
Phƣơng pháp nghiên cứu 37 3. Đánh giá vật liệu khởi đầu phục vụ công tác lai tạo và chọn lọc các dòng đậu tƣơng năng suất cao, kháng bệnh gỉ sắt 37 3. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng bệnh gỉ sắt 42 3. Lai tạo và chọn lọc dòng đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt 43 3.
Phƣơng pháp xử lý số liệu 46 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 4. Kết quả đánh giá vật liệu khởi đầu phục vụ công tác lai tạo và chọn lọc dòng đậu tƣơng năng suất cao, kháng bệnh gỉ sắt 47 4. Đặc điểm hình thái, nông sinh học và năng suất các mẫu giống đậu tƣơng 47 4.
Phát hiện nguồn gen đậu tƣơng kháng gỉ sắt bằng chỉ thị phân tử ADN 59 4. Xác định gen kháng hữu hiệu với bệnh gỉ sắt đậu tƣơng Việt Nam 63 4. Lựa chọn bố mẹ trong định hƣớng lai tạo 66 4. Kết quả lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen quy định tính kháng 67 4.
Đa hình các mẫu giống đậu tƣơng sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen quy định tính kháng bệnh gỉ sắt 68 4. Xác định độ liên kết giữa chỉ thị phân tử ADN với gen kháng gỉ sắt 69 4. Lai tạo và chọn lọc dòng đậu tƣơng theo mục tiêu 71 iv 4. Thiết lập các tổ hợp lai đậu tƣơng theo mục tiêu 72 4.
Kết quả chọn tạo dòng đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt ứng dụng MAS 73 4. Kết quả lai backcross và chọn lọc MABC 91 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 97 5. Đề nghị 98 Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 99 Tài liệu tham khảo 100 Phụ lục 116 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ ADN Axit desoxiribonucleic AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism (Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc) AUDPC Area Under Disease Progess Curve (Chỉ số nhiễm bệnh tích lũy theo thời gian) BNN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn bp Base pair (Cặp nucleotide) cM Centi Morgarn (Đơn vị chiều dài bản đồ di truyền) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CTP Cây thực phẩm dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates Đ/c Đối chứng FAO Food and Agriculte Organization of the United Nations (Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc) MABC Marker Assisted Backcrossing (Lai lại nhờ chỉ thị phân tử) MAS Marker Assisted Selection (Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử) NST Nhiễm sắc thể KL Khối lƣợng KKN Khảo kiểm nghiệm PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) TCN Tiêu chuẩn ngành TGST Thời gian sinh trƣởng RAPD Random Amplified Polymophic DNA (Đa hình các đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn) SNP Single Nucleotide Polymorphism (Đa hình các Nucleotide đơn) SSR Simple Sequence Repeats (Những trình tự lặp lại đơn giản) STS Sequence Tagged Site (Vị trí trình tự đƣợc đánh dấu) WVRDC World Vegetable Research Development Center (Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau màu thế giới) vi DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.
Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới qua một số năm 4 2. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam qua một số năm 5 2. Chủng Phakopsora pachyrhizi phân lập đƣợc ở một số quốc gia 11 2. Nguồn gen đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt châu Á (ASR) đƣợc công bố 17 2.
Chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tƣơng đã đƣợc công bố 22 3. Danh sách các mẫu giống đậu tƣơng nghiên cứu 34 3. Danh sách chỉ thị phân tử liên kết gen kháng gỉ sắt ở đậu tƣơng 35 3. Danh sách mẫu nấm gỉ sắt phân lập sử dụng lây nhiễm nhân tạo 36 4.
Phân nhóm theo đặc điểm hình thái các mẫu giống đậu tƣơng tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 48 4. Phân nhóm theo các chỉ tiêu sinh trƣởng và phát triển các mẫu giống đậu tƣơng vụ xuân 2013, tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 50 4. Phân nhóm theo khối lƣợng 1000 hạt các mẫu giống đậu tƣơng vụ Xuân 2013 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 55 4. Chất lƣợng hạt các mẫu giống đậu tƣơng vụ Xuân 2013 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 58 4.
Kết quả phát hiện gen kháng bệnh gỉ sắt bằng ứng dụng chỉ thị phân tử ADN vụ Xuân 2013 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 61 4. Kết quả đánh giá tính kháng/nhiễm bệnh gỉ sắt bằng nhiễm bệnh nhân tạo năm 2013 tại Từ Liêm, Hà Nội 62 4. Phản ứng với bệnh gỉ sắt của các mẫu giống đậu tƣơng vật liệu mang gen kháng 64 4. Mẫu giống đậu tƣơng bố mẹ lai tạo có nông sinh học tốt năng suất cao 66 4.
Mẫu giống đậu tƣơng bố mẹ lai tạo kháng bệnh gỉ sắt 67 4. Phân ly kiểu gen kháng xác định bằng chỉ thị phân tử ở thế hệ F2 70 4. Kết quả phân tích kiểu gen kháng bằng chỉ thị phân tử kết hợp với đánh giá kiểu hình bằng nhiễm bệnh nhân tạo trên quần thể phân ly F2 70 4. Một số kết quả xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng gỉ sắt đậu tƣơng đã đƣợc công bố 71 vii 4.
Các tổ hợp lai đậu tƣơng đƣợc thiết lập vụ xuân 2013 và xuân 2014 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 72 4. Kết quả chọn cá thể F2 tốt mang gen kháng từ các tổ hợp lai tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm vụ Thu Đông 2013 73 4. Kết quả chọn lọc vƣờn dòng đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt thế hệ F3, F4 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm vụ Xuân và Hè 2014 74 4. Kết quả chọn lọc vƣờn dòng đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt thế hệ F5 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm vụ Thu Đông 2014 75 4.
Đặc điểm hình thái dòng đậu tƣơng chọn lọc vụ Xuân 2015 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 77 4. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển và chống chịu các dòng chọn lọc Xuân 2015 tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm 78 4.