Tổng quan luận án

Cây đậu tương (Glycine max L. Merill) giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp tại Việt Nam nhờ giá trị kinh tế, khả năng cố định đạm cải tạo độ phì của đất và cung cấp nguồn nguyên liệu cho chế biến thực phẩm, dầu ăn và thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, sản xuất đậu tương trong nước sụt giảm về cả diện tích và sản lượng, chỉ đáp ứng được khoảng 1/20 nhu cầu tiêu dùng nội địa, dẫn đến việc phải nhập khẩu số lượng lớn. Một trong những rào cản kỹ thuật lớn nhất là thiếu các giống đậu tương có năng suất cao và khả năng chống chịu sâu bệnh tốt. Hầu hết các giống gieo trồng trong sản xuất có năng suất bình quân chỉ đạt 1,4 - 1,5 tấn/ha, thấp hơn nhiều so với mức trung bình 2,5 - 3,0 tấn/ha của thế giới (FAO, 2017), đồng thời rất mẫn cảm với bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow gây ra. Bệnh gỉ sắt phá hại nghiêm trọng bộ lá, làm giảm quang hợp, tăng tỷ lệ hạt lép và có thể gây thất thu năng suất từ 10% đến 80%, thậm chí mất trắng nếu phát sinh nặng ở giai đoạn ra hoa kết quả.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án chỉ ra là: Các nghiên cứu trong nước trước đây chủ yếu tập trung đánh giá kiểu hình tập đoàn giống địa phương hoặc khảo sát đa dạng di truyền bằng các chỉ thị ngẫu nhiên; chưa có công trình sàng lọc quy mô lớn để phát hiện chính xác các alen/gen kháng đơn (Rpp1 đến Rpp5) trong nguồn vật liệu hiện có bằng chỉ thị phân tử ADN liên kết; chưa xác định rõ hiệu lực kháng thực tế của từng gen kháng đối với các chủng nấm gỉ sắt thu thập tại các vùng sinh thái ở Việt Nam; đồng thời khoảng cách di truyền của các chỉ thị đã công bố trên thế giới chưa được kiểm chứng lại trên nền di truyền vật liệu lai tạo trong nước để ứng dụng vào công tác chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và lai hồi giao nhờ chỉ thị phân tử (MABC).

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Xác định được mẫu giống đậu tương chứa gen kháng bệnh gỉ sắt và chỉ thị phân tử ADN liên kết chặt với các gen kháng hữu hiệu.
  2. Chọn tạo được một số dòng/giống đậu tương tốt, chứa gen kháng bệnh gỉ sắt hữu hiệu với các mẫu nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam bằng ứng dụng chỉ thị phân tử ADN.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: 70 mẫu giống đậu tương thu thập, nhập nội và chọn tạo trong nước; 5 giống chỉ thị quốc tế mang gen kháng đơn (PI200492 - Rpp1, PI230970 - Rpp2, PI462312 - Rpp3, PI459025B - Rpp4, PI200256 - Rpp5); giống đối chứng kháng ĐT2000; các giống đối chứng nhiễm ĐT12, V74; giống đối chứng nông học DT84; các thế hệ con lai phân ly; 3 chủng nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow đại diện cho 3 vùng sinh thái Việt Nam; 5 gen kháng bệnh gỉ sắt (Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5) và 12 chỉ thị phân tử ADN dạng SSR liên kết.
  • Phạm vi không gian: Các thí nghiệm nông sinh học đồng ruộng, lai tạo, chọn lọc và phân tích phòng thí nghiệm được thực hiện tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm (Gia Lộc, Hải Dương); thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo đánh giá kiểu hình kháng/nhiễm được thực hiện tại Khu nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật (Bắc Từ Liêm, Hà Nội) và Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm.
  • Phạm vi thời gian: Toàn bộ các nội dung nghiên cứu thực nghiệm được triển khai từ tháng 1/2013 đến tháng 3/2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã điểm luận hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến sản xuất đậu tương, bệnh học nấm Phakopsora pachyrhizi, di truyền tính kháng và ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn tạo giống:

Tình hình sản xuất đậu tương thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của FAO (2017), sản xuất đậu tương toàn cầu tăng trưởng mạnh từ 21,00 triệu ha (sản lượng 25,20 triệu tấn) năm 1960 lên 122,14 triệu ha (sản lượng 323,70 triệu tấn) năm 2016. Các quốc gia sản xuất hàng đầu gồm Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Ngược lại, tại Việt Nam (Phạm Văn Thiều, 2006; FAO, 2017), diện tích gieo trồng đạt đỉnh vào năm 2005 với 204,1 nghìn ha (sản lượng 292,7 nghìn tấn), sau đó giảm liên tục xuống còn 110,0 nghìn ha năm 2015 và 120,0 nghìn ha năm 2016 (năng suất 14,3 tạ/ha, sản lượng 170,0 nghìn tấn). Các nguyên nhân hạn chế sản xuất trong nước được các tác giả Ngô Thế Dân và cs. (1999), Nguyễn Văn Viết và cs. (2002), Nguyễn Văn Lâm và Lê Huy Nghĩa (2011), Trần Thị Trường và cs. (2015) xác định gồm: thiếu giống năng suất cao thích hợp từng vùng sinh thái, giống mẫn cảm với sâu bệnh (nhất là bệnh gỉ sắt), bất lợi thời tiết vụ Đông và công tác đầu tư, cung ứng giống chưa đồng bộ.

Năm Diện tích thế giới (triệu ha) Năng suất thế giới (tạ/ha) Sản lượng thế giới (triệu tấn) Diện tích VN (nghìn ha) Năng suất VN (tạ/ha) Sản lượng VN (nghìn tấn)
1995 - - - 121,1 10,3 125,5
2000 74,34 21,70 151,41 122,3 11,8 144,9
2005 - - - 204,1 14,4 292,7
2010 101,37 24,70 249,93 197,8 15,0 213,6
2015 119,73 26,10 312,36 110,0 14,6 172,0
2016 122,14 26,50 323,70 120,0 14,3 170,0

Bệnh học, tính đa dạng và biến chủng của nấm Phakopsora pachyrhizi

Bệnh gỉ sắt do hai loài nấm gây ra: Phakopsora pachyrhizi Sydow (chủng châu Á, độc tính cao) và Phakopsora meibomiae (chủng Tây bán cầu, ít gây hại) (Federick et al., 2002; Miles et al., 2006). Phạm vi ký chủ của nấm rộng, có thể ký sinh trên 31 loài thuộc 17 chi họ đậu (Chatasiri and Ono, 2008; Slaminko et al., 2008). Tính đa dạng và sự biến chủng của nấm P. pachyrhizi diễn ra liên tục trên toàn cầu, được ghi nhận qua hàng loạt nghiên cứu phân lập tại Đài Loan (Lin, 1966; Yeh, 1983; WVRDC, 1983), Úc (McLean and Byth, 1980; Burdon and Speer, 1984), Trung Quốc (Tan and Sun, 1989), Nhật Bản (Yamaoka et al., 2002, 2014), Mỹ (Bonde et al., 2006; Miles et al., 2006; Pham et al., 2009; Twizeyimana et al., 2011), châu Phi (Tukamuhabwa and Maphosa, 2012; Twizeyimana et al., 2009) và Brazil (Yamanaka et al., 2010; Akamatsu et al., 2013). Các nghiên cứu khẳng định không có đơn gen kháng nào kháng được tất cả các chủng nấm trong thời gian dài do xuất hiện các chủng sinh lý mới (Schmitz et al., 2014; Ries et al., 2015; Song et al., 2015). Tại Việt Nam, Pham et al. (2009, 2010) và Nguyễn Thị Bình (1990) ghi nhận giống ĐT2000 duy trì tính kháng cao và ổn định với vết bệnh kiểu RB và chỉ số AUDPC thấp.

Di truyền tính kháng và các chỉ thị phân tử ADN liên kết

Tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương được xác định là tính trạng trội đơn gen chi phối, gồm 7 gen trội và 3 alen lặn: Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6, Rpp1b (Bromfield and Hartwig, 1980; McLean and Byth, 1980; Hartwig and Bromfield, 1983; Garcia et al., 2008; Li et al., 2012; Hossain et al., 2014). Các nghiên cứu lập bản đồ di truyền quốc tế (Hyten et al., 2007, 2009; Silva et al., 2008; Abdelnoor et al., 2009; Garcia et al., 2008; Rosa et al., 2015) đã định vị các gen trên nhiễm sắc thể (NST):

  • Gen Rpp1 trên NST số 18 liên kết với chỉ thị Sct187, Sat064 (0,4 cM), Sat372.
  • Gen Rpp2 trên NST số 16 liên kết với Sat255 (8,1 cM), Satt620 (4,3 cM), Satt215 (4,3 cM).
  • Gen Rpp3 trên NST số 6 liên kết với Satt460 (0,5 cM), Sat263 (0,9 cM), Sat251 (4,1 cM).
  • Gen Rpp4 trên NST số 18 liên kết với Satt288 (1,19 cM), Sat_191 (6,24 - 24,8 cM).
  • Gen Rpp5 trên NST số 3 liên kết với Sat275 (4,6 cM), Sat280 (6,3 cM).
  • Gen Rpp6 trên NST số 18 liên kết với Satt324, Satt394.

Chiến lược quy tụ nhiều gen kháng (gen pyramiding) hoặc tìm kiếm gen kháng đơn hữu hiệu được chứng minh giúp tăng độ bền vững và phổ kháng của giống (Lemos et al., 2011; Kendrick et al., 2011; Yamanaka et al., 2013, 2015; Bhor et al., 2014).

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Trong khi các nước đã ứng dụng MAS và MABC để tạo các dòng đa gen kháng gỉ sắt, các nghiên cứu trong nước (Nguyễn Thị Bình, 1990; Vũ Thanh Trà và cs., 2006; Lê Thị Ngọc Vi và Nguyễn Thị Lang, 2006; Nguyễn Thúy Kiều Tiên và Nguyễn Thị Lang, 2011; Khanh et al., 2013; Bùi Chí Bửu và cs., 2013) mới đánh giá sơ bộ hoặc lai hồi giao ở phạm vi hẹp. Luận án này định vị việc giải quyết khoảng trống: Đánh giá toàn diện 70 mẫu giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR để lập danh mục nguồn gen kháng; xác định hiệu lực thực tế của 5 gen Rpp đối với các chủng nấm gỉ sắt Việt Nam; tái xác định khoảng cách di truyền của các chỉ thị liên kết trên quần thể lai phân ly; và ứng dụng MAS, MABC để chọn tạo dòng đậu tương triển vọng vừa mang gen kháng hữu hiệu vừa đạt năng suất cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

  • Lý thuyết di truyền tính kháng đơn gen: Phản ứng kháng của cây đậu tương tuân theo quan hệ tương tác ký chủ - thể gây bệnh (gen-for-gen hypothesis), trong đó gen kháng trội quy định khả năng ngăn chặn sự xâm nhiễm và hình thành bào tử của nấm Phakopsora pachyrhizi.
  • Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và lai hồi giao nhờ chỉ thị phân tử (MABC): Dựa trên nguyên lý liên kết di truyền giữa đoạn trình tự lặp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeats) với locus gen kháng mục tiêu để chọn lọc cá thể mang gen mong muốn ở mức kiểu gen ngay từ giai đoạn sớm, loại bỏ tác động nhiễu của môi trường (Shaokal, 1995; Collard and Mackill, 2008; Septiningsih et al., 2009).
  • Phân loại phản ứng bệnh gỉ sắt: Phản ứng kháng biểu hiện bằng kiểu vết bệnh nâu đỏ (Reddish Brown - RB), ít hoặc không hình thành bào tử hạ; phản ứng nhiễm biểu hiện bằng kiểu vết bệnh nâu vàng (TAN), hình thành nhiều ổ bào tử và bào tử hạ; kiểu trung gian (MIX) có cả hai loại vết bệnh xen kẽ.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng tập đoàn mẫu giống

  • Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đồng ruộng vụ Xuân 2013 tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm. Bố trí theo phương pháp tuần tự không nhắc lại, diện tích mỗi ô thí nghiệm là 10 m², sử dụng giống DT84 làm đối chứng.
  • Tiêu chuẩn áp dụng: Theo dõi và đánh giá theo Quy phạm khảo nghiệm giống đậu tương 10 TCN 339-2006 và Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-58: 2011/BNNPTNT. Các chỉ tiêu bao gồm: đặc điểm hình thái thân lá, thời gian sinh trưởng, khả năng chống chịu sâu bệnh đồng ruộng, các yếu tố cấu thành năng suất (số quả/cây, tỷ lệ quả 3 hạt, khối lượng 1000 hạt) và năng suất thực thu.

2. Kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích chỉ thị ADN

  • Chiết tách ADN: Thu mẫu lá non từ các mẫu giống và con lai, chiết tách ADN tổng số bằng phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide).
  • Phản ứng PCR và điện di: Sử dụng 12 cặp chỉ thị SSR đã công bố liên kết với các gen kháng từ Rpp1 đến Rpp5. Sản phẩm PCR được khuếch đại trên máy luân nhiệt và phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide hoặc agarose, nhuộm ethidium bromide hoặc bạc để đọc kích thước đoạn ADN (bp) đặc trưng.
  • Xác định độ liên kết di truyền: Đánh giá kiểu gen bằng chỉ thị phân tử kết hợp kiểu hình lây nhiễm nhân tạo trên quần thể phân ly F2. Khoảng cách di truyền giữa chỉ thị và gen kháng được tính toán bằng tần số tái tổ hợp theo đơn vị CentiMorgan (cM).

3. Phương pháp đánh giá kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo

Thực hiện tại nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật theo quy trình của Nguyễn Thị Bình (1990) và cs.:

  • Nguồn bệnh: 3 chủng nấm Phakopsora pachyrhizi phân lập từ 3 vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam.
  • Lây nhiễm: Phun huyền phù hạ bào tử nấm (mật độ chuẩn) lên cây ở giai đoạn 2 - 3 lá kép.
  • Tiêu chí đánh giá tính kháng/nhiễm:
    1. Mức độ nhiễm bệnh (% diện tích lá bị hại): Chia 7 cấp (Cấp 1: 0%; Cấp 2: <10%; Cấp 3: 10-20%; Cấp 4: 20-30%; Cấp 5: 30-50%; Cấp 6: 50-75%; Cấp 7: >75%). Tính chỉ số diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC).
    2. Màu sắc vết bệnh: RB (kháng - nâu đỏ/nâu đậm), TAN (nhiễm - nâu vàng), MIX (nhiễm vừa - có cả RB và TAN).
    3. Mức độ hình thành bào tử: Thang điểm từ 0 đến 5 (0: không có bào tử; 1: không hình thành bào tử; 2: ≤25%; 3: 25-50%; 4: 50-75%; 5: >75% vết bệnh có bào tử).
    • Tiêu chuẩn giống kháng: Diện tích lá bị bệnh bằng hoặc thấp hơn đối chứng kháng (ĐT2000), vết bệnh kiểu RB, mức hình thành bào tử đạt điểm 1 - 3.

4. Phương pháp lai tạo và chọn lọc dòng

  • Lai đơn và chọn lọc MAS: Thiết lập các tổ hợp lai giữa bố mẹ có nông sinh học tốt/năng suất cao với bố mẹ mang gen kháng. Đánh giá F1, gieo F2 và dùng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể F2 mang gen kháng. Tiếp tục chọn lọc vườn dòng qua các thế hệ F3, F4, F5, F6, F7 kết hợp kiểu hình đồng ruộng và kiểm tra lại kiểu gen.
  • Lai hồi giao và chọn lọc MABC: Thực hiện lai trở lại với bố/mẹ nhận liên tục qua các thế hệ BC1, BC2, BC3. Dùng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể nhận gen kháng mục tiêu ở thế hệ BC3F2, tiếp tục theo dõi, tách dòng qua BC3F4 và kiểm tra tính ổn định ở BC3F5.

Nguồn vật liệu và dữ liệu nghiên cứu

Tập đoàn 70 mẫu giống đậu tương nghiên cứu tại Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm gồm:

  • Mẫu địa phương (4 mẫu): Cúc BH nâu, Như khê, Cao Bằng U8325, Nhất tiến HLLS.
  • Mẫu nhập nội (34 mẫu): PI647083, Parent, MAC01, Dòng 1 OT, PI647082, PI647084, Dòng 4 OT, Dòng 3 OT, C5C6, Dòng 2 OT, CLVR 64, 104 Tím, 104 Trắng, D43, Chandra, LS16, LS14, AK03, ĐH4, VX-1, DT99, M103, PI457023, L098-11, MTĐ750, Dòng 1-2, MTĐ652-5, PI200492, PI230970, PI462312, PI459025B, PI200256, V74, ĐT12.
  • Mẫu chọn tạo trong nước (32 mẫu): OMDN112, DT96, DT95, OMDN29, ĐT26, HL203, DT2001, HL07-5, HL07-2, DT2008, HL07-15, DT90, ĐT2000, ĐVN12, DT2007, ĐVN11, Đ9804, Đ2501, ĐVN10, TL2901, Đ2101, TL2902, Đ2102, Đ8, ĐT92, Đ2601, TL7, ĐT20, DT84, ĐT22, HLĐN1, HLĐN29.

Nội dung chính theo từng chương

PHẦN 1. Tính cấp thiết của đề tài

Nội dung chương đặt vấn đề về thực trạng suy giảm sản xuất đậu tương ở Việt Nam do thiếu giống tốt và thiệt hại nặng nề từ bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi). Trình bày cơ sở khoa học của việc ứng dụng chỉ thị phân tử ADN liên kết với các gen kháng (Rpp1 đến Rpp5) để nâng cao độ chính xác và rút ngắn thời gian chọn giống so với phương pháp truyền thống. Xác định rõ mục tiêu, đối tượng, phạm vi nghiên cứu, tính mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

PHẦN 2. Tổng quan tài liệu nghiên cứu

Chương tổng quan gồm 6 mục lớn:

  1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam; phân tích các yếu tố hạn chế sản xuất trong nước.
  2. Bệnh gỉ sắt, phân bố và tầm quan trọng: triệu chứng đặc trưng (vết bệnh RB và TAN), phạm vi ký chủ (31 loài thuộc 17 chi họ đậu), tác hại làm giảm năng suất tới 80%.
  3. Tương tác ký chủ - thể gây bệnh: đặc điểm sinh học của nấm P. pachyrhizi (kích thước ổ hạ bào tử 197-258 x 97-108 µm; hạ bào tử 4,7-13 x 2,1-5,6 µm).
  4. Đa dạng và tính biến chủng của nấm P. pachyrhizi: tổng hợp 23 nghiên cứu phân lập nấm tại 11 quốc gia từ năm 1966 đến 2016.
  5. Đánh giá nguồn gen và các phương pháp đánh giá bệnh gỉ sắt trên thế giới và tại Việt Nam (thang đánh giá của Hartman, Singh & Thaplyal, Hinoroxa & Hadain, Nguyễn Thị Bình).
  6. Di truyền tính kháng, chỉ thị phân tử liên kết (Rpp1 - Rpp6) và các thành tựu chọn giống ứng dụng MAS, MABC trong nước và quốc tế.

PHẦN 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương trình bày chi tiết về địa điểm (Gia Lộc - Hải Dương và Bắc Từ Liêm - Hà Nội), thời gian (2013 - 2017) và danh mục 70 mẫu giống đậu tương, 3 chủng nấm gỉ sắt, 12 chỉ thị SSR. Mô tả các bước tiến hành:

  • Đánh giá nông sinh học và tính chống chịu của tập đoàn 70 mẫu giống vụ Xuân 2013 (tiêu chuẩn 10 TCN 339-2006 và QCVN 01-58: 2011/BNNPTNT).
  • Kỹ thuật chiết tách ADN, chạy PCR xác định gen kháng.
  • Phương pháp lây nhiễm nhân tạo xác định gen kháng hữu hiệu.
  • Đánh giá độ liên kết giữa chỉ thị SSR và gen kháng trên quần thể F2.
  • Quy trình lai đơn, chọn lọc vườn dòng MAS từ F2 đến F7 và quy trình lai hồi giao MABC từ BC1 đến BC3F5.

PHẦN 4. Kết quả và thảo luận

1. Đánh giá tập đoàn vật liệu khởi đầu

  • Đặc điểm hình thái, nông sinh học và năng suất (Vụ Xuân 2013): Khảo sát 70 mẫu giống, phân nhóm theo dạng sinh trưởng, màu hoa, màu lông, màu vỏ hạt, thời gian sinh trưởng (ngắn ngày <85 ngày, trung bình 85-95 ngày, dài ngày >95 ngày), khối lượng 1000 hạt và chất lượng hạt.
  • Phát hiện gen kháng bằng chỉ thị SSR: Trong 70 mẫu giống, đã phát hiện 28 mẫu giống mang từ 1 đến 3 gen kháng (Rpp1 đến Rpp5). Ảnh điện di sản phẩm PCR với các chỉ thị Satt620, Satt288, Sat_275 xác định rõ các băng ADN đặc trưng cho các alen kháng.
  • Xác định gen kháng hữu hiệu: Đánh giá kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo 3 chủng nấm gỉ sắt Việt Nam trên các mẫu giống mang gen kháng. Kết quả xác định 3 gen kháng hữu hiệu tại Việt Nam là Rpp2, Rpp4 và Rpp5 (trong đó Rpp2 và Rpp4 kháng tốt với cả 3 chủng nấm; Rpp5 kháng hữu hiệu với chủng nấm thu thập ở phía Nam). Các gen Rpp1 và Rpp3 không thể hiện hiệu lực kháng.
  • Lựa chọn bố mẹ lai tạo: Chọn các giống có đặc tính nông sinh học tốt, năng suất cao kết hợp với các giống mang gen kháng hữu hiệu (Rpp2, Rpp4, Rpp5).

2. Kết quả lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết chặt

Khảo sát tính đa hình và phân tích trên quần thể phân ly F2 giữa kiểu gen (bằng PCR-SSR) và kiểu hình (lây nhiễm nhân tạo), luận án xác định được 3 chỉ thị liên kết chặt:

Gen kháng mục tiêu Chỉ thị phân tử ADN Nhiễm sắc thể (Nhóm liên kết) Khoảng cách di truyền xác định trong luận án
Rpp2 Satt620 NST 16 (J) 3,33 cM
Rpp4 Satt288 NST 18 (G) 2,50 cM
Rpp5 Sat_275 NST 3 (N) 4,16 cM

3. Kết quả chọn tạo dòng đậu tương bằng MAS và MABC

  • Chọn lọc MAS: Thiết lập các tổ hợp lai trong vụ Xuân 2013 và Xuân 2014. Chọn cá thể F2 mang gen kháng bằng chỉ thị phân tử ở vụ Thu Đông 2013. Chọn lọc vườn dòng F3, F4 (năm 2014), F5 (Thu Đông 2014) và đánh giá các dòng chọn lọc F6 (Xuân 2015), F7 (Hè 2015). Đã chọn tạo được 13 dòng đậu tương tốt chứa 1 hoặc 2 gen kháng hữu hiệu.
  • Khảo nghiệm dòng triển vọng (Đông 2015 và Xuân 2016): Hai dòng triển vọng nổi bật là VD1-2-1 (đặt tên là Đ9) và VD1-9-1 (đặt tên là Đ10) mang gen kháng hữu hiệu Rpp2, có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất thực thu vụ Xuân đạt ≥ 2,5 tấn/ha, được gửi tham gia mạng lưới Khảo nghiệm Quốc gia.
  • Kết quả chọn giống MABC: Thực hiện lai hồi giao và chọn lọc cá thể mang gen kháng ở thế hệ BC3F2 (vụ Xuân 2016), tiếp tục chọn và tách dòng ở BC3F4 (Thu Đông 2016) và kiểm tra lại kiểu gen, khả năng kháng nấm ở thế hệ BC3F5 (vụ Xuân 2017), tạo ra các dòng mang gen kháng mục tiêu trên nền di truyền của giống tốt.

PHẦN 5. Kết luận và đề nghị

Tổng kết toàn bộ 4 kết luận lớn về nguồn gen, gen kháng hữu hiệu, chỉ thị liên kết và các dòng giống chọn tạo thành công. Đưa ra các đề nghị cụ thể về khảo nghiệm sản xuất và hướng ứng dụng tiếp theo.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về nguồn gen: Sàng lọc và phát hiện được 28/70 mẫu giống đậu tương mang từ 1 đến 3 gen kháng bệnh gỉ sắt (Rpp1 đến Rpp5), xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử phục vụ công tác lai tạo giống đậu tương kháng bệnh.
  2. Về xác định gen kháng hữu hiệu: Xác định chính xác 3 gen kháng hữu hiệu với các chủng nấm gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi) tại Việt Nam là Rpp2, Rpp4 và Rpp5.
  3. Về chỉ thị phân tử liên kết: Xác định được 3 chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với 3 gen kháng hữu hiệu trên nguồn vật liệu nghiên cứu:
    • Chỉ thị Satt620 liên kết chặt với gen Rpp2 (khoảng cách di truyền 3,33 cM).
    • Chỉ thị Satt288 liên kết chặt với gen Rpp4 (khoảng cách di truyền 2,50 cM).
    • Chỉ thị Sat_275 liên kết chặt với gen Rpp5 (khoảng cách di truyền 4,16 cM).
  4. Về sản phẩm giống: Chọn tạo thành công 13 dòng đậu tương tốt mang 1 hoặc 2 gen kháng hữu hiệu. Trong đó, 2 dòng triển vọng Đ9 (VD1-2-1) và Đ10 (VD1-9-1) mang gen kháng Rpp2, sinh trưởng ngắn ngày, năng suất vụ Xuân đạt ≥ 2,5 tấn/ha, chống chịu sâu bệnh tốt, đã được gửi khảo nghiệm Quốc gia nhằm đa dạng hóa bộ giống đậu tương phía Bắc.

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

  • Tiếp tục khảo nghiệm sản xuất và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác cho 2 giống đậu tương triển vọng Đ9 và Đ10 tại các vùng sinh thái phía Bắc.
  • Tiếp tục ứng dụng bộ chỉ thị phân tử đã lựa chọn (Satt620, Satt288, Sat_275) để quy tụ nhiều gen kháng (Rpp2 + Rpp4, Rpp2 + Rpp5) vào cùng một nền giống nhằm nâng cao tính bền vững đối với bệnh gỉ sắt.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Khảo nghiệm đồng ruộng và đánh giá kiểu hình tập trung chủ yếu ở vùng sinh thái đồng bằng sông Hồng (Hải Dương, Hà Nội); phạm vi khảo nghiệm sản xuất của các dòng mới ở các vùng sinh thái khác còn hạn chế.
    • Các dòng triển vọng được chọn tạo gửi khảo nghiệm quốc gia (Đ9, Đ10) chủ yếu mang đơn gen kháng Rpp2, có nguy cơ bị suy giảm hiệu lực nếu xuất hiện biến chủng nấm mới trong tương lai.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng khảo nghiệm sinh thái các dòng chọn lọc tại các tỉnh miền núi phía Bắc và miền Trung.
    • Tiếp tục phát triển các tổ hợp lai quy tụ đa gen (gene pyramiding) kết hợp đồng thời 2 đến 3 gen kháng (Rpp2, Rpp4, Rpp5) trên các dòng đậu tương thế hệ sau để tạo tính kháng bền vững.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và nhà chọn giống cây trồng: Cung cấp quy trình hoàn chỉnh về ứng dụng kỹ thuật MAS và MABC trên cây họ đậu; cung cấp thông số chính xác về khoảng cách di truyền của 3 chỉ thị SSR (Satt620, Satt288, Sat_275).
  • Đối với giảng viên và cơ sở đào tạo: Là tài liệu tham khảo thực nghiệm điển hình cho các học phần Di truyền học phân tử, Chọn giống cây trồng ứng dụng công nghệ sinh học và Bệnh học thực vật.
  • Đối với cơ quan quản lý và sản xuất nông nghiệp: Cung cấp 2 dòng giống đậu tương triển vọng (Đ9, Đ10) ngắn ngày, năng suất cao (≥ 2,5 tấn/ha), kháng bệnh gỉ sắt để bổ sung vào cơ cấu cây trồng vụ Xuân và Đông ở các tỉnh phía Bắc.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện bao nhiêu mẫu giống mang gen kháng gỉ sắt trong tập đoàn nghiên cứu?

Bằng kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị phân tử SSR, luận án đã xác định được 28 trong tổng số 70 mẫu giống đậu tương nghiên cứu (chiếm 40%) mang từ 1 đến 3 gen kháng bệnh gỉ sắt trong số các gen từ Rpp1 đến Rpp5.

2. Các gen kháng nào có hiệu lực đối với các chủng nấm gỉ sắt tại Việt Nam?

Kết quả lây nhiễm nhân tạo với 3 chủng nấm Phakopsora pachyrhizi thu thập từ 3 vùng sinh thái Việt Nam xác định 3 gen kháng hữu hiệu gồm: Rpp2, Rpp4 và Rpp5. Trong đó, Rpp2 và Rpp4 kháng tốt với tất cả các chủng nấm thử nghiệm; Rpp5 kháng hữu hiệu với chủng nấm thu thập ở phía Nam. Hai gen Rpp1 và Rpp3 không có hiệu lực kháng với các chủng nấm gỉ sắt ở Việt Nam.

3. Ba chỉ thị phân tử liên kết chặt được lựa chọn trong luận án là những chỉ thị nào?

Ba chỉ thị SSR được xác định liên kết chặt với 3 gen kháng hữu hiệu gồm:

  • Chỉ thị Satt620 liên kết với gen Rpp2 (khoảng cách di truyền 3,33 cM trên NST 16).
  • Chỉ thị Satt288 liên kết với gen Rpp4 (khoảng cách di truyền 2,50 cM trên NST 18).
  • Chỉ thị Sat_275 liên kết với gen Rpp5 (khoảng cách di truyền 4,16 cM trên NST 3).

4. Hai dòng đậu tương triển vọng Đ9 và Đ10 có đặc tính nông sinh học và năng suất như thế nào?

Hai dòng Đ9 (nguồn gốc VD1-2-1) và Đ10 (nguồn gốc VD1-9-1) mang gen kháng hữu hiệu Rpp2, có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng chống chịu sâu bệnh đồng ruộng tốt và đạt năng suất thực thu vụ Xuân ≥ 2,5 tấn/ha (cao hơn đáng kể so với mức trung bình sản xuất 1,4 - 1,5 tấn/ha). Cả hai dòng đã được gửi tham gia khảo nghiệm Quốc gia.

5. Tiêu chuẩn đánh giá một giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt theo phương pháp của Nguyễn Thị Bình (1990) gồm những gì?

Giống được đánh giá là kháng bệnh gỉ sắt khi thỏa mãn đồng thời 3 tiêu chí:

  1. Mức độ nhiễm bệnh (% diện tích lá bị hại) bằng hoặc thấp hơn giống đối chứng kháng (ĐT2000), có chỉ số AUDPC thấp.
  2. Vết bệnh biểu hiện màu nâu đỏ hoặc nâu đậm đặc trưng (kiểu RB - Reddish Brown).
  3. Mức độ hình thành bào tử hạ trên vết bệnh đạt điểm từ 1 đến 3 (tỷ lệ vết bệnh có bào tử ≤ 50%).

Kết luận

Luận án của tác giả Nguyễn Văn Khởi đã hoàn thành việc đánh giá nguồn gen đậu tương, phát hiện 28/70 mẫu giống mang gen kháng và xác định được 3 gen kháng hữu hiệu (Rpp2, Rpp4, Rpp5) đối với các chủng nấm gỉ sắt tại Việt Nam. Công trình đã lựa chọn và kiểm chứng được 3 chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt gồm Satt620 (3,33 cM), Satt288 (2,50 cM) và Sat_275 (4,16 cM) phục vụ công tác chọn giống phân tử. Ứng dụng thành công phương pháp MAS và MABC, luận án đã tạo ra 13 dòng đậu tương mang gen kháng hữu hiệu, nổi bật là hai dòng triển vọng Đ9 và Đ10 mang gen Rpp2, ngắn ngày, năng suất vụ Xuân đạt ≥ 2,5 tấn/ha đã được gửi khảo nghiệm Quốc gia, đóng góp thiết thực cho công tác chọn giống cây trồng tại Việt Nam.