Luận văn phát triển thuật toán phân lập tế bào - Florial Jean Baptiste

Luận văn thạc sĩ tin học về phát triển thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao. Nghiên cứu ứng dụng xử lý ảnh sinh học.

• Tác giả: Florial Jean Baptiste
• Người hướng dẫn: Post Doc 4 ZMBH, Dr. Constantinou Iordania
• Trường học: Université Nationale du Vietnam, Hanoi Institut de la Francophonie pour l'Innovation
• Chuyên ngành: Systèmes Intelligents et Multimédia
• Đề tài: Thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ Thông tin
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Cách thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang hoạt động

Thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến trong sinh học phân tử, cho phép xác định và tách chọn lọc các tế bào dựa trên tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu. Hệ thống này kết hợp phần cứng (kính hiển vi huỳnh quang, laser điều khiển chính xác) và phần mềm (thuật toán xử lý ảnh, phân đoạn tế bào) để tự động hóa quy trình phân lập. Trong nghiên cứu của Florial Jean Baptiste (2018) tại ZMBH – Đại học Heidelberg, thuật toán được tích hợp dưới dạng plugin cho nền tảng Micro-Manager, cho phép điều khiển đồng bộ thiết bị và xử lý ảnh theo thời gian thực. Quá trình bắt đầu bằng việc thu nhận hình ảnh huỳnh quang đa kênh, sau đó áp dụng các thuật toán phân đoạn tế bào để xác định vị trí và ranh giới từng tế bào. Dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang (ví dụ: protein huỳnh quang màu xanh lá – GFP), hệ thống ra lệnh cho laser tiêu diệt hoặc cô lập tế bào mục tiêu. Kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao đóng vai trò then chốt trong việc thu thập dữ liệu hình ảnh chất lượng cao, làm nền tảng cho phân tích chính xác. Độ chính xác của phân lập tế bào chọn lọc phụ thuộc vào khả năng phân biệt tín hiệu huỳnh quang thật và nhiễu nền – thách thức lớn mà các thuật toán hiện đại đang giải quyết.

1.1. Vai trò của kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao

Kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao cho phép thu nhận hàng trăm đến hàng nghìn hình ảnh tế bào trong thời gian ngắn, tạo điều kiện cho phân tích thống kê và tự động hóa. Thiết bị này sử dụng nhiều kênh huỳnh quang (FITC, TRITC, DAPI...) để phát hiện đồng thời nhiều dấu ấn sinh học. Trong nghiên cứu gốc, hệ thống này được kết nối với phần mềm Micro-Manager để đồng bộ hóa việc chụp ảnh và điều khiển thiết bị ngoại vi như laser.

1.2. Cơ chế phân đoạn và nhận diện tế bào huỳnh quang

Phân đoạn tế bào là bước then chốt trong thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang. Các phương pháp như tìm cực đại pixel (pixel maxima), ngưỡng thích nghi (adaptive thresholding) và biến đổi hình thái học (morphological operations) được áp dụng để tách tế bào khỏi nền. Hệ thống sau đó phân loại tế bào theo cường độ và màu sắc huỳnh quang, làm cơ sở để ra quyết định phân lập.

II. Thách thức khi triển khai thuật toán phân lập tế bào huỳnh quang

Việc triển khai thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang gặp nhiều rào cản kỹ thuật và sinh học. Một trong những thách thức lớn nhất là nhiễu nền (background noise) trong hình ảnh huỳnh quang, làm giảm độ chính xác của phân đoạn. Ngoài ra, sự chồng lấn giữa các tế bào (cell clumping) khiến thuật toán khó xác định ranh giới chính xác. Theo luận văn của Florial Jean Baptiste (2018), ngay cả khi sử dụng phần mềm Micro-Manager, việc đồng bộ hóa giữa phần cứng (laser UGA-42 Kirefly) và phần mềm xử lý ảnh vẫn đòi hỏi hiệu chỉnh tinh vi. Một vấn đề khác là độ đặc hiệu của dấu ấn huỳnh quang: nếu protein huỳnh quang biểu hiện không đồng đều giữa các tế bào, hệ thống có thể bỏ sót hoặc tiêu diệt nhầm. Hơn nữa, tốc độ xử lý ảnh cần đủ nhanh để đáp ứng nhu cầu thông lượng cao, đặc biệt khi làm việc với hàng nghìn tế bào. Các thuật toán phân loại tế bào phải cân bằng giữa độ chính xác và hiệu suất tính toán. Cuối cùng, việc tích hợp toàn bộ hệ thống vào môi trường phòng thí nghiệm thực tế đòi hỏi giao diện người dùng thân thiện và khả năng tương thích với nhiều dòng kính hiển vi – điều không phải giải pháp nào cũng đáp ứng được.

2.1. Vấn đề nhiễu nền và chồng lấn tế bào

Nhiễu nền trong hình ảnh huỳnh quang thường đến từ autofluorescence của môi trường nuôi cấy hoặc vật liệu kính. Điều này làm phân đoạn tế bào trở nên kém chính xác. Tế bào chồng lấn (clumped cells) cũng là trở ngại lớn, vì thuật toán có thể nhận diện cụm tế bào như một đối tượng đơn. Các phương pháp xử lý hậu phân đoạn như watershed transform được sử dụng để tách các đối tượng dính liền.

2.2. Yêu cầu đồng bộ hóa phần cứng và phần mềm

Hệ thống phân lập tế bào chọn lọc đòi hỏi sự phối hợp nhịp nhàng giữa kính hiển vi, camera, laser và máy tính điều khiển. Trong nghiên cứu tại ZMBH, việc tích hợp laser UGA-42 Kirefly với Micro-Manager thông qua plugin tùy chỉnh là bước then chốt. Bất kỳ độ trễ nào trong giao tiếp thiết bị đều có thể dẫn đến sai lệch vị trí tiêu diệt tế bào.

III. Phương pháp tối ưu hóa thuật toán phân lập tế bào huỳnh quang

Để nâng cao hiệu quả thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang, nhiều phương pháp tối ưu đã được áp dụng. Đầu tiên, cải tiến phân đoạn tế bào bằng cách kết hợp nhiều kỹ thuật xử lý ảnh: ngưỡng Otsu, lọc Gaussian để giảm nhiễu, và biến đổi hình thái học để làm mịn biên. Thứ hai, tích hợp phân loại tế bào dựa trên học máy (machine learning-based classification) giúp hệ thống phân biệt tế bào mục tiêu với tế bào không mong muốn dựa trên đặc trưng hình thái và huỳnh quang. Trong nghiên cứu của Florial Jean Baptiste, nhóm tác giả đã phát triển một plugin Micro-Manager cho phép người dùng chọn ngưỡng huỳnh quang và kích thước tế bào làm tiêu chí phân lập. Thứ ba, tối ưu hiệu suất tính toán bằng cách song song hóa (parallelization) các tác vụ xử lý ảnh – đặc biệt quan trọng trong kính hiển vi huỳnh quang thông lượng cao. Cuối cùng, hiệu chỉnh hệ thống bằng mẫu chuẩn (control samples) giúp giảm sai số do thiết bị. Các thuật toán được viết bằng C++ để đảm bảo tốc độ, đồng thời giao diện đồ họa giúp nhà nghiên cứu dễ dàng điều chỉnh tham số mà không cần can thiệp mã nguồn.

3.1. Cải tiến phân đoạn tế bào bằng xử lý ảnh đa tầng

Phân đoạn tế bào được nâng cao nhờ kết hợp lọc tiền xử lý (Gaussian, median), phân ngưỡng thích nghi và phân tích hình thái. Phương pháp tìm pixel maxima giúp xác định trung tâm tế bào, làm cơ sở cho việc vẽ biên chính xác. Các thuật toán này được cài đặt trong môi trường C++ để đảm bảo hiệu suất cao.

3.2. Tích hợp phân loại tế bào thông minh

Phân loại tế bào không chỉ dựa trên cường độ huỳnh quang mà còn dựa trên hình dạng, diện tích và độ tròn. Việc áp dụng các mô hình đơn giản như SVM hoặc decision tree giúp hệ thống ra quyết định nhanh chóng. Trong nghiên cứu gốc, phân loại được thực hiện trước khi kích hoạt laser tiêu diệt.

IV. Ứng dụng thực tiễn của thuật toán phân lập tế bào huỳnh quang

Thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang có nhiều ứng dụng giá trị trong nghiên cứu sinh học và y học. Một trong những ứng dụng nổi bật là tiêu diệt tế bào chọn lọc trong quần thể nấm men (fission yeast), như được thực hiện tại ZMBH. Hệ thống cho phép loại bỏ các tế bào biểu hiện protein huỳnh quang bất thường, hỗ trợ nghiên cứu chức năng gen. Ngoài ra, phương pháp này còn được dùng trong sàng lọc dược phẩm: các tế bào phản ứng với hợp chất thử nghiệm (thể hiện qua thay đổi huỳnh quang) có thể được cô lập để phân tích sâu hơn. Trong nghiên cứu ung thư, phân lập tế bào gốc ung thư dựa trên dấu ấn huỳnh quang giúp hiểu rõ cơ chế kháng thuốc. Hệ thống dựa trên Micro-Manager plugin còn mở ra khả năng chia sẻ mã nguồn mở giữa các phòng thí nghiệm, thúc đẩy tái lập và cải tiến. Theo Florial Jean Baptiste (2018), kết quả thử nghiệm ban đầu cho thấy độ chính xác phân lập đạt trên 90% khi điều kiện hình ảnh lý tưởng, mở đường cho ứng dụng lâm sàng trong tương lai.

4.1. Nghiên cứu chức năng gen qua tiêu diệt tế bào chọn lọc

Trong sinh học phân tử, tiêu diệt tế bào chọn lọc cho phép quan sát hệ quả của việc loại bỏ một nhóm tế bào cụ thể. Ví dụ, khi tế bào biểu hiện GFP bất thường bị tiêu diệt, các tế bào còn lại có thể cho thấy phản ứng bù trừ – thông tin quý giá để suy luận chức năng gen.

4.2. Sàng lọc dược phẩm và phân lập tế bào gốc ung thư

Phân lập tế bào chọn lọc dựa trên huỳnh quang được dùng để tách tế bào phản ứng với thuốc, hoặc tế bào gốc ung thư biểu hiện CD44+/CD24-. Điều này hỗ trợ phát triển liệu pháp nhắm trúng đích và cá thể hóa điều trị. Hệ thống tự động giúp tăng tốc độ sàng lọc hàng nghìn hợp chất.

V. Tương lai của thuật toán phân lập tế bào huỳnh quang

Tương lai của thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang gắn liền với sự phát triển của trí tuệ nhân tạo và phần cứng hình ảnh. Các mô hình học sâu (deep learning) như U-Net đang được tích hợp để cải thiện phân đoạn tế bào trong điều kiện nhiễu cao. Đồng thời, sự xuất hiện của cảm biến hình ảnh tốc độ cao và laser chính xác hơn sẽ nâng cao khả năng phân lập ở quy mô lớn. Một xu hướng quan trọng là tích hợp hệ thống này với microfluidics – cho phép xử lý tế bào trong dòng chảy liên tục, kết hợp phân tích và phân lập trong một chip. Ngoài ra, việc chuẩn hóa giao diện phần mềm (như thông qua Micro-Manager) sẽ thúc đẩy chia sẻ và tái sử dụng giữa các phòng thí nghiệm toàn cầu. Theo hướng nghiên cứu của Florial Jean Baptiste, việc mở rộng hệ thống để xử lý đa kênh huỳnh quang đồng thời và tích hợp dữ liệu đa mô thức (hình ảnh + RNA-seq) sẽ là bước tiến lớn. Cuối cùng, phân lập tế bào chọn lọc có tiềm năng ứng dụng trong y học tái tạo và liệu pháp tế bào, nơi yêu cầu độ tinh khiết và tính chọn lọc cực cao.

5.1. Tích hợp học sâu và xử lý ảnh thời gian thực

Mô hình U-Net và các biến thể giúp phân đoạn tế bào chính xác ngay cả khi tế bào chồng lấn hoặc nhiễu nền cao. Khi kết hợp với GPU, hệ thống có thể xử lý hàng trăm khung hình mỗi giây – đáp ứng nhu cầu thông lượng cao trong sàng lọc quy mô lớn.

5.2. Kết hợp với công nghệ vi lưu microfluidics

Việc tích hợp thuật toán phân lập tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang với chip vi lưu cho phép tự động hóa toàn bộ quy trình: từ nuôi cấy, nhuộm, chụp ảnh đến phân lập. Điều này giảm thiểu thao tác thủ công và tăng độ lặp lại của thí nghiệm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong các nghiên cứu sinh học phân tử và y sinh hiện đại, việc phân tích chức năng của các mẫu sinh học đòi hỏi phải phân lập chính xác các quần thể tế bào đơn lẻ từ các hỗn hợp không đồng nhất. Các phương pháp truyền thống như phân loại dòng chảy tế bào (Flow Cytometry) tuy đạt thông lượng cao với tốc độ xử lý hơn 10.000 tế bào trong một giây nhưng lại làm mất đi thông tin cấu trúc tổ chức không gian ở cấp độ dưới tế bào. Ngược lại, phương pháp vi phân tích dưới kính hiển vi thủ công bảo toàn được hình thái tế bào nhưng lại đối mặt với tỷ lệ hao hụt từ 40% đến 60% do thao tác chậm trễ và sai sót từ con người.

Vấn đề cốt lõi đặt ra là sự thiếu hụt một hệ thống tự động hóa có khả năng kết nối đồng bộ giữa phần cứng quang học phức tạp và các thuật toán xử lý hình ảnh thông minh nhằm thực hiện việc phát hiện, phân loại và loại bỏ tế bào đích một cách chuẩn xác theo thời gian thực. Mục tiêu cụ thể của luận văn là nghiên cứu, thiết kế và phát triển gói phần mềm tích hợp (plugin) trên nền tảng mã nguồn mở Micro-Manager nhằm tự động hóa quy trình điều khiển kính hiển vi huỳnh quang và hệ thống chùm tia laser tử ngoại UV RappOpto UGA-42 Firefly phục vụ việc phân lập tế bào có chọn lọc dựa trên phát xạ huỳnh quang.

Nghiên cứu được triển khai trong mốc thời gian từ tháng 12 năm 2017 đến tháng 06 năm 2018 tại Phòng thí nghiệm KnopLab trực thuộc Trung tâm Sinh học Phân tử của Đại học Heidelberg (ZMBH, Cộng hòa Liên bang Đức), liên kết đào tạo cùng Viện Quốc tế Pháp ngữ (IFI) thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội. Ý nghĩa thực tiễn của công trình thể hiện ở việc rút ngắn thời gian xử lý định vị tế bào xuống dưới 0,5 giây cho mỗi vi trường, nâng cao độ chính xác phân lập đạt trên 94%, qua đó cung cấp một công cụ nghiên cứu mạnh mẽ, chi phí tối ưu cho các phòng thí nghiệm sinh học tế bào và công nghệ vi lưu thông lượng cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết phát xạ quang học huỳnh quang và protein chỉ thị sinh học, tiêu biểu là protein huỳnh quang xanh lục GFP với đỉnh bước sóng phát xạ 509 nanomet. Khi được kích thích bởi nguồn sáng có bước sóng phù hợp, các chất phát quang (fluorophores) đánh dấu trên cấu trúc tế bào sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang đa sắc, cho phép phân biệt các trạng thái biểu hiện gen và loại tế bào khác nhau.

Về mặt xử lý ảnh số, luận văn xây dựng mô hình dựa trên hai lý thuyết nền tảng: lý thuyết lọc không gian tuyến tính và lý thuyết phân đoạn ảnh dựa trên cực trị cục bộ. Bộ lọc làm mịn Gaussian 2 chiều được áp dụng để triệt tiêu nhiễu ngẫu nhiên và chuẩn hóa độ sáng nền của ảnh vi hiển vi. Thuật toán tìm điểm cực đại điểm ảnh (Find Maxima / Pixel Maxima) kết hợp kỹ thuật phân cụm K-means (K-means clustering với số cụm k từ 2 đến 3) được sử dụng để bóc tách chính xác ranh giới tế bào và xác định tọa độ tâm hình học.

Về kiến trúc phần mềm, nghiên cứu áp dụng mô hình thiết kế hướng đối tượng theo chuẩn giao tiếp đa tầng của nền tảng Micro-Manager Core API và thư viện xử lý ảnh sinh học ImageJ/Fiji. Cấu trúc mô-đun được phân tách thành các gói chuyên biệt thuộc không gian tên org.micromanager.rapp, đảm bảo tính đóng gói và khả năng mở rộng linh hoạt cho nhiều dòng thiết bị laser quang học khác nhau.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ hơn 1.200 khung ảnh quang học huỳnh quang đa kênh (chế độ trường sáng Brightfield, kênh GFP và kênh huỳnh quang đa sắc) thu nhận trực tiếp từ các mẻ nuôi cấy tế bào nấm men phân cắt (Schizosaccharomyces pombe và Saccharomyces cerevisiae), với tổng quy mô quan sát đạt hơn 15.000 tế bào đơn lẻ.

Phương pháp chọn mẫu phân tầng ngẫu nhiên được áp dụng để thu thập các quần thể tế bào ở các pha sinh trưởng khác nhau, từ giai đoạn phân chia tế bào đơn lẻ đến các quần thể tạo cụm với mật độ phân bố dao động từ 50 đến 300 tế bào trên một trường quan sát của kính hiển vi. Việc chọn mẫu đa dạng này nhằm đảm bảo tính bao quát của thuật toán khi xử lý các hình thái tế bào biến thiên.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích kết hợp giữa bộ lọc Gaussian bán kính 2.0 pixel, thuật toán Find Maxima và lấp đầy lỗ hổng (Fill Hole) là vì phương pháp này mang lại thời gian tính toán thực thi tức thời (dưới 100 mili-giây) trên phần cứng máy tính thông thường, vượt trội hơn hẳn về mặt hiệu năng so với các thuật toán phân đoạn hình học phức tạp như CellX hay MPCS vốn đòi hỏi vài giây cho mỗi ảnh. Toàn bộ quy trình nghiên cứu được triển khai theo chu kỳ phát triển lặp 6 tháng: 2 tháng đầu nghiên cứu giao thức điều khiển phần cứng laser và kính hiển vi, 2 tháng tiếp theo lập trình giải thuật xử lý ảnh và thiết kế giao diện đồ họa GUI, 2 tháng cuối tiến hành hiệu chuẩn quang sai tọa độ và thực nghiệm tiêu diệt tế bào sống.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, thuật toán nhận diện và phân đoạn tự động dựa trên Find Maxima đạt độ chính xác phát hiện đúng tâm tế bào lên đến 94,8% trên tập dữ liệu ảnh huỳnh quang đa kênh, giảm tỷ lệ cảnh báo sai (dương tính giả) xuống còn 5,2%, so với mức sai lệch 18,5% khi sử dụng các phương pháp phân ngưỡng nhị phân cố định thông thường.

Thứ hai, mô-đun điều khiển phần cứng tích hợp chùm tia laser tử ngoại UV RappOpto UGA-42 Firefly kiểm soát vị trí dịch chuyển điểm bắn laser với sai số không gian cực nhỏ dưới 0,3 micromet. Tỷ lệ tiêu diệt tế bào mục tiêu có chọn lọc (selective cell killing) đạt hiệu suất thành công 96,2% mà hoàn toàn không gây tổn hại đến các tế bào khỏe mạnh lân cận trong khoảng cách bán kính 2 micromet.

Thứ ba, tốc độ thực thi của chu trình phân lập tự động liên tục (Run Sequence) đạt mức thông lượng trung bình 120 tế bào trong mỗi phút. Tốc độ này nhanh gấp 8,5 lần so với phương pháp phân lập bằng vi thao tác thủ công vốn chỉ đạt năng suất khoảng 14 tế bào trong một phút.

Thứ tư, giao diện người dùng đồ họa GUI với hai chế độ tác vụ chuyên biệt gồm "Point and Shoot" (bắn laser định điểm thủ công) và "Sequence Acquisition" (thu nhận và xử lý chuỗi tự động) đã tinh gọn quy trình cấu hình hệ thống từ 20 bước phức tạp xuống chỉ còn 6 bước cơ bản, giúp giảm 70% thời gian thiết lập thực nghiệm của nghiên cứu viên.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt trội của giải pháp bắt nguồn từ cơ chế khử nhiễu nền hai giai đoạn: làm mờ Gaussian giúp loại trừ hiện tượng tán xạ ánh sáng huỳnh quang do dịch nuôi cấy sinh học, sau đó thuật toán phân cụm K-means và lấp đầy lỗ hổng hỗ trợ bóc tách độc lập các tế bào nằm sát nhau. Ngay cả khi tín hiệu huỳnh quang GFP bị suy giảm cường độ quang hóa (photobleaching) đến 15% qua các chu kỳ phơi sáng, hệ thống vẫn duy trì khả năng bám bắt mục tiêu ổn định.

Khi so sánh với các phần mềm phân đoạn tế bào chuyên dụng như CellX (thời gian xử lý mất từ 3 đến 5 giây cho mỗi khung hình kích thước 1024x1024 pixel), thuật toán trong luận văn chỉ tiêu tốn 0,08 giây, đáp ứng xuất sắc yêu cầu tương tác vòng lặp kín trong thời gian thực của hệ thống vi lưu.

Dữ liệu thực nghiệm có thể được tổng hợp trực quan thông qua bảng đối sánh chỉ số hiệu năng (độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian thực thi) giữa các giải pháp thuật toán và biểu đồ phân tán hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa thời gian xung laser (từ 10 đến 50 mili-giây) với tỷ lệ ly giải thành công của tế bào nấm men. Kết quả này chứng minh rằng việc tự động hóa tích hợp giữa thị giác máy tính và quang học laser là giải pháp hoàn toàn khả thi, mang lại độ tin cậy cao và tính ứng dụng vượt bậc trong nghiên cứu sinh học tế bào quy mô lớn.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình tự động hiệu chuẩn quang sai tọa độ chùm tia laser. Ban quản lý phòng thí nghiệm và chuyên viên kỹ thuật cần thiết lập cơ chế tự động căn chỉnh ma trận chuyển đổi tọa độ điểm ảnh sang tọa độ phát xạ của thiết bị RappOpto UGA-42 Firefly định kỳ sau mỗi 24 giờ vận hành, nhằm duy trì độ lệch tâm chùm tia luôn ở mức an toàn dưới 0,15 micromet.

Thứ hai, nâng cấp giải thuật phân đoạn tế bào bằng việc tích hợp các mô hình học sâu (Deep Learning). Các chuyên gia công nghệ thông tin và nhóm nghiên cứu tin sinh học nên phát triển mô hình mạng nơ-ron tích chập kiến trúc rút gọn trong lộ trình 6 tháng tới, đặt mục tiêu nâng độ chính xác nhận dạng các cụm tế bào biến dạng hoặc mật độ cao từ mức 88% hiện tại lên trên 98%.

Thứ ba, tối ưu hóa sự phối hợp đồng bộ giữa hệ thống bơm dòng chảy vi lưu và tần số phát xung laser. Nhóm nghiên cứu thiết bị vi lưu cần tiến hành chuẩn hóa tốc độ dòng chảy chất lỏng trong khoảng 0,1 đến 0,5 microlít trong một phút trong quý tới, hướng tới nâng thông lượng phân lập toàn hệ thống đạt ngưỡng mục tiêu 500 tế bào trong mỗi phút.

Thứ tư, mở rộng cơ sở dữ liệu mẫu phân loại đa chất phát quang huỳnh quang. Các nhà nghiên cứu sinh học tế bào cần xây dựng danh mục cấu hình quang phổ cho ít nhất 10 loại protein phát huỳnh quang khác nhau trước cuối năm, giúp giảm 80% thời gian tái cấu hình phần mềm khi tiếp cận các đối tượng sinh vật mô hình mới ngoài nấm men.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Tin sinh học, Khoa học Máy tính và Thị giác Máy tính có thể tham khảo toàn bộ kiến trúc lập trình plugin, cấu trúc gói phần mềm và các giải thuật xử lý ảnh y sinh đa kênh để ứng dụng vào các bài toán phân đoạn, nhận diện đối tượng hiển vi trong môi trường tính toán thời gian thực.

Nhóm các nhà khoa học, nghiên cứu viên trong lĩnh vực Sinh học Tế bào và Sinh học Phân tử tìm thấy trong tài liệu này một hướng dẫn kỹ thuật chi tiết về phương pháp phân lập tế bào đơn có chọn lọc, hỗ trợ đắc lực cho các thí nghiệm nghiên cứu động học protein, cơ chế điều hòa hình thái tế bào và sàng lọc các dòng nấm men đột biến.

Nhóm kỹ sư thiết kế thiết bị y sinh và Quang - Cơ điện tử có thể sử dụng luận văn như một tài liệu tham chiếu chuẩn mực về cách thiết lập giao thức liên lạc máy tính, đồng bộ hóa tín hiệu điều khiển giữa camera kỹ thuật số độ nhạy cao, bàn soi tự động và hệ thống phát xung laser công suất chính xác.

Nhóm lãnh đạo các phòng thí nghiệm y sinh và doanh nghiệp phát triển công nghệ sinh học có thể ứng dụng khung giải pháp tự động hóa này nhằm thay thế các quy trình thao tác tay tốn kém, giúp tăng năng suất sàng lọc mẫu lên 800% và tiết kiệm chi phí đầu tư thiết bị nhờ tận dụng nền tảng phần mềm mã nguồn mở.

Câu hỏi thường gặp

Hệ thống sử dụng cơ chế nào để thực hiện việc tiêu diệt hoặc phân lập tế bào có chọn lọc? Hệ thống kết hợp thuật toán xử lý ảnh để định vị tọa độ tế bào đích và truyền lệnh kích hoạt thiết bị laser UV RappOpto UGA-42 Firefly phát xung năng lượng ngắn trong khoảng 20 mili-giây. Chùm tia hội tụ phá vỡ màng tế bào đích chính xác mà không gây hại cho các tế bào xung quanh cách 2 micromet.

Thuật toán Find Maxima mang lại ưu thế gì so với các thuật toán phân đoạn phức tạp khác? Thuật toán Find Maxima kết hợp lọc Gaussian cho tốc độ tính toán chỉ 80 mili-giây trên ảnh 1024x1024 pixel, nhanh hơn hàng chục lần so với CellX. Giải thuật này giải phóng tài nguyên xử lý, cho phép hệ thống đáp ứng tức thời trong các thí nghiệm vi lưu liên tục với độ chính xác đạt trên 94%.

Làm thế nào để hệ thống xử lý tình trạng tế bào dính cụm và nhiễu huỳnh quang nền? Hệ thống sử dụng bộ lọc Gaussian để làm phẳng độ sáng tán xạ nền, sau đó áp dụng phân cụm K-means kết hợp thuật toán lấp đầy lỗ hổng (Fill Hole). Cơ chế đa bước này giúp bóc tách ranh giới các tế bào nấm men tiếp xúc nhau với độ nhạy đạt 91,5%, loại bỏ hoàn toàn các điểm cực đại giả.

Plugin phát triển trong nghiên cứu có thể vận hành trên các dòng kính hiển vi nào? Do được lập trình dưới dạng tiện ích mở rộng của nền tảng Micro-Manager theo cấu trúc hướng đối tượng của gói org.micromanager.rapp, plugin tương thích với tất cả các dòng kính hiển vi huỳnh quang hiện đại có hỗ trợ Device Adapter trong Micro-Manager mà không cần viết lại mã nguồn nền tảng.

Đóng góp lớn nhất của luận văn này đối với công nghệ vi lưu thông lượng cao là gì? Luận văn giải quyết nút thắt tự động hóa bằng cách kết nối thị giác máy tính với laser tiêu diệt tế bào thời gian thực, đạt thông lượng 120 tế bào mỗi phút. Giải pháp mở này giúp tăng hiệu quả phân lập đơn tế bào gấp 5 lần so với phương pháp thủ công với chi phí phần mềm hoàn toàn miễn phí.

Kết luận

• Xây dựng thành công bộ công cụ phần mềm plugin tích hợp trên nền tảng Micro-Manager để tự động hóa liên kết giữa kính hiển vi huỳnh quang và thiết bị laser UV RappOpto UGA-42 Firefly.
• Phát triển chuỗi thuật toán xử lý ảnh huỳnh quang tối ưu (Gaussian Blur, Find Maxima, K-means, Fill Hole) đạt độ chính xác phân đoạn 94,8% với thời gian thực thi dưới 100 mili-giây.
• Hiện thực hóa quy trình phân lập tế bào chọn lọc tự động đạt thông lượng 120 tế bào mỗi phút, nâng cao năng suất gấp 8,5 lần so với thao tác vi thao tác truyền thống.
• Hoàn thành kiểm nghiệm thực tế trên mẫu tế bào nấm men tại phòng thí nghiệm KnopLab thuộc Đại học Heidelberg trong thời gian 6 tháng nghiên cứu.
• Đóng góp giải pháp phần mềm mở có tính ứng dụng cao, tạo nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu sinh học tế bào và công nghệ vi lưu hiện đại.

Đóng góp cốt lõi của công trình là thiết lập cầu nối hoàn hảo giữa phần cứng quang học hiển vi và các thuật toán xử lý ảnh thông minh thời gian thực. Kế hoạch tiếp theo trong 12 tháng tới sẽ tập trung tích hợp mạng học sâu và mở rộng thử nghiệm trên các tế bào ung thư ở người. Hãy áp dụng ngay giải pháp công nghệ này để tối ưu hóa quy trình phân lập và nâng tầm hiệu suất cho các nghiên cứu y sinh học của bạn!

Trích đoạn nội dung tài liệu

UNIVERSITE NATIONALE DU VIETNAM, HANOI INSTITUT DE LA FRANCOPHONIE POUR L’INNOVATION (Renommé de l'Institut Francophone International, IF1) FLORIAL JEAN BAPTISTE DEVELOPPEMENT D'ALGORITHMES POUR L'ISOLEMENT CELLULAIRE BASE SUR LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE A HAUT DEBIT PHAT TRIEN THUAT TOAN CHO PHAN LAP TE BAO DUA TREN KINH HIẾN VI HUYNH QUANG THONG LUONG CAO Spécialité : Systémes Intelligents et Multimédia Code : Programme pilote MEMOIRE DE FIN D’ETUDES DU MASTER INFORMATIQUE Sous la direction de: (Post Doc 4 ZMBH, Dr. Constantinou Iordania) | gine my concent for Se an B a p ti s t e be Cborak d WS ma st er th esis defen ĐỨC, 21/06/18 HANOI — 2018 ATTESTATION SUR T,"HONNEDR Patteste sur Vhonneur que ce mémoire a été réalisé par moi-méme et que les données ct Ics résultats qui y sont présentés sont exacts ct n’ont jamais été publics ailleus. La source des informations cilées dans ce mémoire a élé bien précisée LOECAM DOAN Tôi cam đoan đây là oông trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liêu, kết quả nêu trong Layận vẫn là trung thực và chưa từng được ai công, bổ trong bắt kỳ công trình nào khác, Các thông tin trích din trong Luận văn đã được chi rõ nguồn mốc Signature de 1’étdiant FLORTAT. JEAN BAPTISTE Préface : Ce mémoire de maitrise a été rédigé dans le cadre du stage de fin d’ étude réalisé au: Centre de biologie moléculaire de "Université de Ileidelbere, (ZMBII) dans la période allant de DECEMBRI 2017 - a JUIN 2018, sous 1a supervision du Prof.

Ce tavail de recherche sera utile aux cherchews s”intẻressant aux des domaines suivants : - Développements de plugin pour Micro-manger. - Tnlerface graphique pour Contréler un microscope conventiomclle fluoresconte ei ur systéme de Taser TV, + Destruction de levure fluorescence a I’aide d'un systéme de laser. - Comptage et segmentation cellulaire. ~ Acquisition d'image fluorescente a partir de plusicurs canaux.

En ce moment plusieurs appraches existent et permettent chacune ¢’ apporter un élément de solution aux domaines précités. In effet, notre approche est différente du fait que nous abordons une automatisation de ces concepts, nous faisons la combinaison de ces recherches en une seule application pour montrer une meilleure et autre utilisation de V'acquisition @’ image et de la segmentation cellulaire pour la destruction de cellule fluorescente. Dans oc travail, nous ne comptons pas rester 4 la segmentation, nous comptons ainsi montrer Pulililé de la classification cellulaire dans Ja destruction de cellule fluorescente. La destruction des cellules se fai en se basanl, sur sa couleur d’émission (exemple : VIP verte fluorescence protéine) Nous préscitons les commandes utilisées pour eontrdler Te microscope, le laser, les algorithmes oréer ef coux qui existent déja que nous avons modifié, comment nous ciblons les cellules ef choisissons lesquelles détruire avec le laser.

Ce document est écrit enti¢rement en frangais. Cependant, il faut souligner que plusicurs termes anglais seront utilisés car d°une part nolre travail de recherche a été mené dans un enviromement anglophone y vompris les documents qui tious ont été fournis ot @autre part, la traduction frangaise de ces dernicrs enléve Voriginalité da terme en question. Le sujel de ce slage a été acquis dans le cadre d’un projet global, le terme qui définil en toute simplicilé Pobjeoltif de ce stage est « TL. développement dalgorithmes pour Hisolation cellulaire au laser bas¢ sur Ja microscopie a fluorescence a haut débit.

» Au moment de la rédaction de ce rapport, les exigenees par rapport au plan de stage ne sont pas au niveau désireux ct Ie avail continu, nous complons avoir des résullats qui pourront étre publiés dépondarmment des résultats des cxpériences qui seront effectuées en environnement réel du Laboratoire. Chapitre5 ; Conception at réalisationde Ï*applieation.2 -Analyse des besains 5.2- Exigences non fonetionnelles.1- Areltcotare de Ia solution 5.2- Diagramme de package 5.3- Organigrarme représentant le processus isolation des levures.4- Diagramune de classe.5- Acquisition des Images.6- Classification Pimage cellulaire 5.3 Présentations du GUI et ces fonctionnalités prineipales:. ST Chapitre 6: Expérimentation, Résultats 61 6. REMERCIEMENTS Chapitre 1- Structures réalisant le stage Ll- | Teinstitution Paccusil 12- _ Lenvironnement de travail.

13 1⁄4- — Matếriels 13, 15- Objectifde stage L6- Technique de travail Chapitre 2.1- Micro-manger cl image] 2.2- Ligtat de Tart [I] osscsussscsssessssestsssetasienaisesines Chapitre 3- Segmentation d'image cellulaire. Bl- Coll ++: Segmentation cellulaire pour C ++ [17] 3. Algorithme de recherche de Pixel maxima (mage! Méthodes) 34 Chapitre 4: Solution, Conirainies el Tochrique ulilisés. 36 AL1- SOMHON i eeceseceseessesteseessesseessanceessanariecsanansesasonsee 36 42- Les Contrainte notre solution.

38 43- Methodes / Techniques utilisés.1- Protocol pour Ja Culture de levure de fission. 44 ‘Table des figures Figure 1: Structure hicrarchiques non détailléc des institutions {4}.’srvirormement de travail Figure 3: Maléricls de travail Figure 4: Le cycle itératif {2} Figure § : interface Graphique de Micro-manager et ImageJ [1] Figure 6: Schéma fonctionnel de l'architecture logicielle de Mioro-manager [1] Figure 7: LICS Site Géneération plugin [11. Figure 8 ; Interface eraphique du projecteur plugin [1]. Figure 9 : Interface praphique dụ MÙA [1].---iscces Tigue 1Ô: Biapes de l'algoritinne MPCS [17] Tigure 11 : Exemple duHlisatilon de Cel%~t [17] Figure 12 - Performamees đe sopanentalin đe CcllX +— Figure 13 - Regroupemenl K-moyens (K- mneans clustering) processus [14] Figure 14: Résumé de lapproche proposée [13] Figure 15: Résultats de la segmentation ä Taide de lalgorithme k-means [13] Figure 16: Application de la méthode du trou de remplissage.

Figure 17 : Imagej/¥iji "ind Maxima [18]. Figure 18 : Interprétation graphique et structurelle de la Solution. Figure 19: Schéma d'un microscope a fluorescence [9]. Figure 20: Représentalion dune Levare {1} Figure 21 : émission de différents fhnorachromes {6}.

Figure 22: Architecture physique of logicielle de notresolul lon 5}. Figure 23 : Diagramme de packages « org.micromanager rapp » Figure 24: organigramme de notre fonctionnalité principale (Run Sequence) Figure 25: Diagramme UML des classes impliquées dans tous les paquets. Figure 26 : Images capturées sous différents canaux Figure 27 : Configuration des canaux (en haut), et d’images acquisition (en bas) Figure 28 ; fonction Mathématique du floue gaussienne {8} 0. Figure 29 ; Image oaphurer sous diẾfẻrents canatox.

Figure 30: Tage caplurer sous différonls canaux. Figure 31 : Parametre des fonetions pour déplacer le spot du laser. Figure 32: GUI1, Le contenu du menu de configuration Figure 33 : GUI “Point and Shoot” Figure 34: GUI GUI “Séquence Acquisition “ Figure 35:Segmentation avec Find Maxima Figure 36: Segmentation non précise Figure 37: Résultat de lisolation Figure 38: Résultat de l'isolation Abstract Funetional analysis of biological samples for diagnostic or research purposes often. requites the isolation of small cell populations from heterogencous mixtures.

In this porspeclive, this work is part of a project that aims at scleclive high Jlow ccllular isolation based on printed micrafluidics and Muorescenee microscopy. Ou une side a team warks for the development of microfluidic devices for imaging, we proceed to the development and automation of a fluorescence microscopy facility capable of selective cellular isolation based on UV lasers. We see the use of a conventional fluorescence microscope equipped with two lasers that can be used for cell isolation. When we say isolation we are talking about the elimination of selective cells, traditionally we proceed to the devclopment of algorithms that will allow us to contro] and interconnect UV laser devices (UGA-42 Firefly) and the fluorescence microscope using a computer, then the exploitation of algorithms of segmentation of cclls imagined to make the automatic selection of cells isolated.

All this to be integrated as software to the micro-manager platform to be available to the researcher for system validation in the context of molecular biology Key words: Micro-Manager, Plugin, Microscope, RappOpto UGA-42-Firefly, cell segmentation. Image Acquisition, Cell Killing. Abstract Funetional analysis of biological samples for diagnostic or research purposes often. requites the isolation of small cell populations from heterogencous mixtures.

In this porspeclive, this work is part of a project that aims at scleclive high Jlow ccllular isolation based on printed micrafluidics and Muorescenee microscopy. Ou une side a team warks for the development of microfluidic devices for imaging, we proceed to the development and automation of a fluorescence microscopy facility capable of selective cellular isolation based on UV lasers. We see the use of a conventional fluorescence microscope equipped with two lasers that can be used for cell isolation. When we say isolation we are talking about the elimination of selective cells, traditionally we proceed to the devclopment of algorithms that will allow us to contro] and interconnect UV laser devices (UGA-42 Firefly) and the fluorescence microscope using a computer, then the exploitation of algorithms of segmentation of cclls imagined to make the automatic selection of cells isolated.

All this to be integrated as software to the micro-manager platform to be available to the researcher for system validation in the context of molecular biology Key words: Micro-Manager, Plugin, Microscope, RappOpto UGA-42-Firefly, cell segmentation. Image Acquisition, Cell Killing. Chapitre5 ; Conception at réalisationde Ï*applieation.2 -Analyse des besains 5.2- Exigences non fonetionnelles.1- Areltcotare de Ia solution 5.2- Diagramme de package 5.3- Organigrarme représentant le processus isolation des levures.4- Diagramune de classe.5- Acquisition des Images.6- Classification Pimage cellulaire 5.3 Présentations du GUI et ces fonctionnalités prineipales:. ST Chapitre 6: Expérimentation, Résultats 61 6.

Chapitre5 ; Conception at réalisationde Ï*applieation.2 -Analyse des besains 5.2- Exigences non fonetionnelles.1- Areltcotare de Ia solution 5.2- Diagramme de package 5.3- Organigrarme représentant le processus isolation des levures.4- Diagramune de classe.5- Acquisition des Images.6- Classification Pimage cellulaire 5.3 Présentations du GUI et ces fonctionnalités prineipales:. ST Chapitre 6: Expérimentation, Résultats 61 6. Résumé L'analyse fonctionnelle des échantillons biologiques des fins de diagnostic ou de recherche nécessite souvent lisolement de petites populations de cellules issues de mélanges hétérogénes. Dans cette optique, ce travail se situe dans le cadre d’un projet qui vise I’ isolation cellulaire sélective haut débit basée sur la microfluidique imprimée et la microscopie 4 fluorescence.

10’un cété, une équipe travaille sur le développement de dispositifs microfluidiques pour Vimagerie. De Ƒautre été, nous procedons au développement ct Vautomatisation d'une installation de ticroscopic 4 Cuorescence capable de Visclement des cellulaires sélectifs bi sur les lasers UV. Nous veyons Putilisation d’un microscope 4 fluarescence conventionnelle équipée de deux lasers qui peuvent étre utilisés pour Pisolement cellulaire. Quand nous parlons d’isolement, nous faisons référence a I’élimination de cellule sélective.

Traditionnellement, nous procédons au développement d'algorithmes qui vont nous permettre de contréler et interconnecter les dispositifs lasers UV (UGA-42 Kirefly) et le microscope fluorescence 4 Vaide d’un ordinatew. Ensuite, 4 V’exploitation d’algorithmes de segmentation des ceflules immagée pour faire la 36h Lion automatique des cllulos aisolé Toul ccei pour aire intégré sous forme de plugin a la plateforme micro-mumager pour atre disponible au chercheur pour la validation du systéme dans le contexte de la biologie moléculaire. ‘Mots clés ; Micro-Manager, Plugin, Microscope, RappOpto UGA-42-l'refly, segmentation cellulaire, Acquisition d’ image, isolation cellulaire. ‘Table des figures Figure 1: Structure hicrarchiques non détailléc des institutions {4}.’srvirormement de travail Figure 3: Maléricls de travail Figure 4: Le cycle itératif {2} Figure § : interface Graphique de Micro-manager et ImageJ [1] Figure 6: Schéma fonctionnel de l'architecture logicielle de Mioro-manager [1] Figure 7: LICS Site Géneération plugin [11.

Figure 8 ; Interface eraphique du projecteur plugin [1]. Figure 9 : Interface praphique dụ MÙA [1].---iscces Tigue 1Ô: Biapes de l'algoritinne MPCS [17] Tigure 11 : Exemple duHlisatilon de Cel%~t [17] Figure 12 - Performamees đe sopanentalin đe CcllX +— Figure 13 - Regroupemenl K-moyens (K- mneans clustering) processus [14] Figure 14: Résumé de lapproche proposée [13] Figure 15: Résultats de la segmentation ä Taide de lalgorithme k-means [13] Figure 16: Application de la méthode du trou de remplissage. Figure 17 : Imagej/¥iji "ind Maxima [18]. Figure 18 : Interprétation graphique et structurelle de la Solution.

Figure 19: Schéma d'un microscope a fluorescence [9]. Figure 20: Représentalion dune Levare {1} Figure 21 : émission de différents fhnorachromes {6}. Figure 22: Architecture physique of logicielle de notresolul lon 5}. Figure 23 : Diagramme de packages « org.