Luận văn thạc sĩ hus thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút prrs trong tế bào thực vật 14

Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong tế bào thực vật, góp phần nâng cao khả năng kháng bệnh.

• Tác giả: Lê Thị Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tường Vân
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Thiết Kế Vector Chuyển Gen Biểu Hiện Kháng Nguyên Vi Rút Prrs Trong Tế Bào Thực Vật
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS)
• 1.2. TÌNH HÌNH BỆNH LỢN TAI XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS

Thiết kế vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong công nghệ sinh học. Vi rút PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) gây ra nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi lợn. Việc phát triển các phương pháp mới để sản xuất vắc xin hiệu quả từ thực vật đang trở thành một xu hướng nổi bật. Vắc xin thực vật không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn có khả năng kích thích hệ miễn dịch một cách tự nhiên.

1.1. Khái niệm về vector chuyển gen trong sinh học thực vật

Vector chuyển gen là công cụ quan trọng trong việc chuyển đổi gen vào tế bào thực vật. Chúng thường được thiết kế để mang các gen kháng nguyên, giúp tế bào thực vật sản xuất protein kháng nguyên cần thiết cho việc tạo ra vắc xin. Các loại vector phổ biến bao gồm Agrobacterium tumefaciens và virus thực vật.

1.2. Tầm quan trọng của kháng nguyên vi rút PRRS

Kháng nguyên vi rút PRRS, đặc biệt là glycoprotein GP5, đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích phản ứng miễn dịch. Việc biểu hiện kháng nguyên này trong tế bào thực vật có thể tạo ra vắc xin hiệu quả, giúp bảo vệ lợn khỏi bệnh PRRS.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu kháng nguyên vi rút PRRS

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu kháng nguyên vi rút PRRS, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự biến đổi gen của vi rút, dẫn đến việc các vắc xin hiện tại không còn hiệu quả. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào tế bào thực vật cũng gặp nhiều khó khăn.

2.1. Sự biến đổi gen của vi rút PRRS

Vi rút PRRS có khả năng biến đổi gen mạnh mẽ, điều này làm cho các vắc xin hiện tại không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn. Sự khác biệt về gen giữa các chủng vi rút cũng tạo ra thách thức trong việc phát triển vắc xin.

2.2. Khó khăn trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật

Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thường gặp khó khăn do tính chất của tế bào thực vật. Việc tối ưu hóa các phương pháp như tiêm gen hay sử dụng vi khuẩn Agrobacterium là rất cần thiết để đạt được hiệu quả cao trong việc biểu hiện kháng nguyên.

III. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS

Để thiết kế vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS, cần thực hiện một số bước quan trọng. Đầu tiên, xác định gen kháng nguyên cần thiết, sau đó lựa chọn vector phù hợp và cuối cùng là tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào tế bào thực vật.

3.1. Lựa chọn gen kháng nguyên phù hợp

Việc lựa chọn gen kháng nguyên là bước đầu tiên và quan trọng nhất. Glycoprotein GP5 được xác định là một trong những kháng nguyên chính có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen hiệu quả

Vector cần được thiết kế sao cho có khả năng biểu hiện cao trong tế bào thực vật. Các yếu tố như promoter, terminator và các yếu tố điều hòa cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả biểu hiện.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS

Việc sử dụng vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật không chỉ giúp sản xuất vắc xin hiệu quả mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và phát triển nông nghiệp. Các sản phẩm từ thực vật có thể được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành các dạng vắc xin khác nhau.

4.1. Sản xuất vắc xin từ thực vật

Vắc xin thực vật có thể được sản xuất từ các loại cây như thuốc lá hoặc đậu tương. Điều này không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn tạo ra sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng.

4.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật có thể tạo ra các kháng thể hiệu quả, giúp bảo vệ lợn khỏi bệnh. Các thử nghiệm thực địa cho thấy vắc xin từ thực vật có khả năng kích thích hệ miễn dịch tốt hơn so với các loại vắc xin truyền thống.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu kháng nguyên vi rút PRRS

Nghiên cứu về thiết kế vector chuyển gen kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật đang mở ra nhiều triển vọng mới cho ngành chăn nuôi. Việc phát triển các vắc xin từ thực vật không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế mà còn nâng cao sức khỏe cho đàn lợn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp hiệu quả hơn trong việc phòng chống bệnh PRRS.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu sẽ tiếp tục tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chuyển gen và phát triển các loại vắc xin mới từ thực vật. Các công nghệ mới như CRISPR cũng có thể được áp dụng để cải thiện hiệu quả của các vector chuyển gen.

5.2. Tác động đến ngành chăn nuôi

Việc phát triển vắc xin từ thực vật có thể giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh PRRS gây ra. Điều này không chỉ có lợi cho người chăn nuôi mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), thường gọi là bệnh tai xanh, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi toàn cầu. Tại Hoa Kỳ, tổn thất kinh tế do virus PRRS gây ra ước tính lên đến 560 triệu USD mỗi năm do chi phí tiêu hủy gia súc, xử lý ổ dịch và suy giảm năng suất chăn nuôi. Tại Trung Quốc, đợt dịch bùng phát năm 2007 đã buộc nước này phải tiêu hủy khoảng 20 triệu con lợn. Tại Việt Nam, kể từ khi ghi nhận các ổ dịch lớn vào năm 2007, dịch bệnh đã lây lan nhanh chóng. Điển hình vào năm 2010, dịch bùng phát tại 1.978 xã thuộc 49 tỉnh thành với 812.947 con lợn mắc bệnh và 442.165 con bị tiêu hủy. Các loại vắcxin truyền thống như vắcxin bất hoạt hay nhược độc hiện có giá thành cao khoảng 40.000 đồng một liều nhưng hiệu lực bảo hộ chỉ đạt khoảng 40% và tiềm ẩn nguy cơ hoàn độc sinh học.

Trước bối cảnh đó, đề tài nghiên cứu "Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật" được triển khai trong khuôn khổ Nghị định thư hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và Vương quốc Bỉ giai đoạn 2011-2013. Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mục tiêu trọng tâm của luận văn bao gồm: thiết kế thành công các vector nhị thể mang cấu trúc gen dung hợp kháng nguyên vỏ glycoprotein GP5, protein màng M và GP3 của virus PRRS với tiểu phần độc tố không chịu nhiệt LTB từ vi khuẩn Escherichia coli; đồng thời đánh giá khả năng biểu hiện phiên mã và dịch mã của các kháng nguyên này trong dòng tế bào huyền phù thuốc lá siêu sinh trưởng Bright Yellow 2 (BY-2). Nghiên cứu mở ra hướng đi đột phá trong việc phát triển vắcxin ăn được (edible vaccine) có độ an toàn sinh học cao, kích thích miễn dịch niêm mạc hiệu quả và tiết kiệm chi phí sản xuất từ 30% đến 50% so với phương pháp cổ điển.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng ba hệ thống lý thuyết sinh học phân tử hiện đại:

1. Học thuyết trung tâm của sinh học phân tử: Giải thích dòng thông tin di truyền từ phân tử DNA tái tổ hợp phiên mã tạo ra mRNA đặc hiệu và dịch mã thành chuỗi polypeptide mang cấu trúc kháng nguyên đích trong tế bào thực vật bậc cao.
2. Cơ chế tái tổ hợp vị trí đặc hiệu Gateway: Dựa trên hệ thống tái tổ hợp của thực khuẩn thể Lambda phage thông qua các vị trí nhận biết đặc thù attB, attP, attL và attR với xúc tác của hỗn hợp enzyme BP Clonase và LR Clonase, giúp gắn định hướng các đoạn gen quan tâm vào vector chuyển gen nhị thể pCB-GW-35S mà không phụ thuộc vào các enzyme cắt giới hạn truyền thống.
3. Lý thuyết miễn dịch niêm mạc và tá chất sinh học LTB: Tận dụng tiểu phần B của độc tố đường ruột LTB có khả năng liên kết đặc hiệu với thụ thể GM1 ganglioside trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, đóng vai trò tá chất kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào khi đưa kháng nguyên qua đường tiêu hóa.

Hệ thống khái niệm nòng cốt trong nghiên cứu gồm có: vắcxin tiểu đơn vị ăn được (edible vaccine), vector chuyển gen nhị thể (binary vector), vùng T-DNA của plasmid Ti từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dòng tế bào huyền phù thực vật siêu sinh trưởng Nicotiana tabacum L. Bright Yellow 2 (BY-2) với chu kỳ tăng sinh khối gấp khoảng 100 lần sau 7 ngày nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu di truyền bao gồm các gen gp5m, gp3 của chủng virus PRRS độc lực cao có độ tương đồng di truyền từ 99% đến 99,7% so với chủng virus phân lập tại khu vực, cùng trình tự gen tá chất ltb. Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế với hơn 30 dòng khuẩn lạc tái tổ hợp chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh và 15 dòng tế bào thuốc lá BY-2 chuyển gen độc lập được đánh giá qua từng đợt biến nạp. Phương pháp chọn mẫu áp dụng hình thức chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng có kiểm soát nghiêm ngặt dựa trên áp lực chọn lọc của hai loại kháng sinh là kanamycin với nồng độ 50 microgram/ml và rifamycin với nồng độ 25 microgram/ml.

Quy trình phân tích gồm các kỹ thuật chuyên sâu: phản ứng chuỗi trùng hợp Overlapping-PCR để nối các đoạn gen đích; tinh sạch DNA từ gel agarose 1% bằng bộ kít GeneJET; biến nạp vector vào vi khuẩn Escherichia coli DH5alpha bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42 độ C trong 60 giây và chuyển vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 bằng xung điện ở điện thế 2,5 kV, điện dung 25 microFarad, điện trở 400 Ohm. Quá trình chuyển gen vào tế bào BY-2 được kích hoạt bằng 5 microlit acetosyringone nồng độ 100 mM. Đánh giá sự biểu hiện của gen được thực hiện qua kỹ thuật RT-PCR đối với phân tử cDNA và phương pháp lai miễn dịch Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng thẻ c-Myc trên màng nitrocellulose dưới điện thế 120 V và 30 V. Toàn bộ lộ trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ và tối ưu hóa liên tục trong thời gian 24 tháng từ năm 2011 đến năm 2013.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả mang tính đột phá trong thiết kế di truyền và chuyển gen thực vật:

1. Tạo dòng thành công ba cấu trúc gen dung hợp: Sử dụng kỹ thuật Overlapping-PCR với cặp mồi đặc hiệu để dung hợp gen tá chất ltb vào đầu 5' của các gen kháng nguyên, tạo ra ba phân đoạn gen tái tổ hợp bao gồm ltb-gp5m (dung hợp LTB với GP5 và M), ltb-gp5 (loại bỏ gen m bằng enzyme cắt giới hạn NcoI) và ltb-gp3. Kết quả giải trình tự nucleotide khẳng định 100% các đoạn gen tạo dòng giữ nguyên khung đọc mở chính xác, không xuất hiện đột biến dịch khung hay sai lệch axit amin.
2. Thiết lập thành công ba vector chuyển gen thực vật thế hệ mới: Thông qua phản ứng tái tổ hợp Gateway hai bước BP và LR, các cấu trúc gen được chuyển hoàn chỉnh vào vector nhận pCB-GW-35S dưới sự điều khiển của promoter mạnh CaMV 35S và kết thúc bởi terminator nos. Ba vector nhị thể pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5 và pCB-GW-35S-ltb-gp3 đã được biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 với tỷ lệ khuẩn lạc dương tính đạt trên 95% qua kiểm tra Colony-PCR.
3. Chuyển gen và xác nhận biểu hiện thành công trong tế bào thuốc lá BY-2: Sau quá trình đồng nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện tối ở 25 độ C và loại bỏ vi khuẩn bằng kháng sinh cefotaxim nồng độ 500 microgram/ml, các dòng tế bào BY-2 kháng kanamycin 50 microgram/ml đã phát triển ổn định. Phân tích PCR từ DNA tổng số khẳng định 100% các dòng tế bào chọn lọc mang gen chuyển. Phân tích RT-PCR từ RNA tổng số chứng minh gen ngoại lai được phiên mã mạnh mẽ tạo mRNA tương ứng. Kết quả điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12% và lai miễn dịch Western Blot với kháng thể đơn dòng kháng c-Myc xác nhận protein kháng nguyên dung hợp LTB-GP5, LTB-GP5M và LTB-GP3 được dịch mã chính xác với kích thước phân tử dự kiến.

Thảo luận kết quả

Thành công của đề tài bắt nguồn từ việc lựa chọn chiến lược công nghệ hợp lý và đồng bộ. Việc ứng dụng công nghệ Gateway đã khắc phục hoàn toàn những trở ngại của phương pháp cắt nối enzyme truyền thống, vốn rất khó tìm vị trí cắt đơn trên các vector biểu hiện thực vật kích thước lớn từ 10 kb đến 15 kb. Tế bào huyền phù thuốc lá BY-2 thể hiện ưu thế vượt trội so với hệ thống nuôi cấy cây hoàn chỉnh nhờ tốc độ phân chia tế bào cực nhanh, tăng sinh khối 100 lần trong một tuần, môi trường dinh dưỡng rẻ tiền và khả năng thực hiện đầy đủ các biến đổi sau dịch mã như glycosyl hóa tương tự tế bào động vật.

Dữ liệu nghiên cứu thực nghiệm có thể được hệ thống hóa rõ ràng thông qua hai hình thức trực quan:

• Biểu đồ cột định lượng so sánh mật độ quang học và mức độ biểu hiện mRNA tương đối qua phân tích RT-PCR giữa các dòng BY-2 chuyển gen khác nhau.
• Bảng ma trận đối chiếu kích thước phân tử lý thuyết và kích thước thực tế của các phức hợp kháng nguyên dung hợp LTB-GP5, LTB-GP5M và LTB-GP3 trên bản gel điện di SDS-PAGE và màng thẩm tách Western Blot.

So với các vắcxin thương mại dạng tiêm hiện nay chỉ tạo miễn dịch toàn thân với hiệu quả hạn chế khoảng 40%, việc dung hợp kháng nguyên với tiểu phần LTB mở ra tiềm năng tạo đáp ứng miễn dịch niêm mạc vượt trội tại đường tiêu hóa và hô hấp. Đây là những cửa ngõ xâm nhập chính của virus PRRS, giúp lợn hình thành hàng rào bảo vệ vững chắc ngay từ giai đoạn đầu tiếp xúc với mầm bệnh.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên những phát hiện khoa học từ luận văn, bốn nhóm giải pháp mang tính ứng dụng thực tiễn cao được đề xuất như sau:

1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bioreactor nhằm nâng cao hiệu suất tích lũy protein: Viện Công nghệ Sinh học cần chủ trì thực hiện việc điều chỉnh nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon và oxy hòa tan trong hệ thống nuôi cấy huyền phù bioreactor quy mô 50 lít đến 100 lít. Mục tiêu đặt ra là nâng hàm lượng kháng nguyên tái tổ hợp đạt từ 1,5% đến 2,0% tổng lượng protein hòa tan trong vòng 12 tháng tới.
2. Tiến hành thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên mô hình động vật thí nghiệm: Nhóm nghiên cứu phối hợp với các trung tâm nghiên cứu thú y triển khai đánh giá khả năng sinh kháng thể đặc hiệu IgG và sIgA trên chuột nhắt trắng và lợn con cai sữa thông qua đường uống. Lộ trình thực nghiệm kéo dài 18 tháng với mục tiêu đạt hiệu lực bảo hộ chống tái nhiễm virus PRRS trên 80%.
3. Mở rộng biểu hiện gen trên các đối tượng cây trồng dùng làm thức ăn chăn nuôi trực tiếp: Chuyển các cấu trúc vector pCB-GW-35S đã thiết kế sang biểu hiện ổn định trong hạt đậu tương hoặc lá cây bắp cải, tạo nguồn sinh khối vắcxin ăn được có thể chế biến trực tiếp mà không cần qua khâu tinh sạch protein phức tạp. Hoạt động này cần được các viện nghiên cứu nông nghiệp thực hiện trong khung thời gian từ 24 đến 36 tháng.
4. Xây dựng quy chuẩn kỹ thuật và cấp phép thử nghiệm tiền lâm sàng: Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cần sớm ban hành hướng dẫn đánh giá tính an toàn sinh học đối với vắcxin thú y có nguồn gốc từ thực vật chuyển gen, đồng thời hỗ trợ kinh phí khoảng 5 tỷ đến 10 tỷ đồng để hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin PRRS tiểu đơn vị dạng bột đông khô đạt chuẩn GMP-WHO trước năm 2026.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn là nguồn tài nguyên học thuật và thực tiễn giá trị cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học và Sinh học thực nghiệm: Tiếp cận phương pháp thiết kế vector hiện đại bằng kỹ thuật Gateway, kỹ thuật Overlapping-PCR và quy trình chuẩn chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens với độ chính xác cao.
2. Các nhà nghiên cứu và kỹ sư công nghệ sinh học tại các viện nghiên cứu, trường đại học: Ứng dụng quy trình nuôi cấy dòng tế bào huyền phù siêu sinh trưởng BY-2 để sản xuất các loại protein tái tổ hợp, kháng thể đơn dòng và dược phẩm sinh học với chu kỳ thu sinh khối ngắn từ 7 đến 10 ngày.
3. Chuyên gia nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty sản xuất vắcxin và thuốc thú y: Sử dụng dữ liệu khoa học của luận văn làm tiền đề phát triển các dòng vắcxin ăn được thế hệ mới phòng chống dịch bệnh tai xanh, giúp giảm chi phí sản xuất thương mại từ 30% đến 40% so với vắcxin truyền thống.
4. Cán bộ quản lý dịch tễ thú y và nhà hoạch định chính sách nông nghiệp: Tham khảo bức tranh toàn cảnh về thiệt hại kinh tế do dịch PRRS gây ra tại Việt Nam giai đoạn 2007-2012 với hơn 1,2 triệu con lợn mắc bệnh để xây dựng các kịch bản kiểm soát dịch tễ chủ động và bền vững.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại chọn hệ thống biểu hiện trong tế bào thực vật thay vì vi khuẩn hay nấm men?
Tế bào thực vật là sinh vật nhân thực bậc cao, có khả năng thực hiện đầy đủ các quá trình biến đổi sau dịch mã như gấp cuộn protein chính xác và glycosyl hóa, giúp protein kháng nguyên có hoạt tính sinh học chuẩn xác. Đồng thời, tế bào thực vật không mang mầm bệnh gây hại cho động vật, bảo đảm an toàn sinh học tuyệt đối và chi phí sản xuất thấp hơn khoảng 50% so với nuôi cấy tế bào động vật.

Vai trò của tiểu phần LTB khi dung hợp với kháng nguyên GP5 và GP3 là gì?
Tiểu phần LTB đóng vai trò như một tá chất sinh học niêm mạc mạnh mẽ, liên kết đặc hiệu với thụ thể GM1 ganglioside trên bề mặt ruột. Khi lợn sử dụng vắcxin qua đường tiêu hóa, LTB giúp dẫn truyền kháng nguyên GP5 và GP3 vượt qua hiện tượng dung nạp đường miệng, kích thích sản sinh kháng thể bề mặt sIgA và kháng thể huyết thanh IgG với hiệu giá cao.

Ưu điểm vượt trội của kỹ thuật Gateway so với phương pháp tạo dòng bằng enzyme cắt giới hạn truyền thống là gì?
Kỹ thuật Gateway sử dụng cơ chế tái tổ hợp vị trí đặc hiệu qua hai phản ứng BP và LR, cho phép chuyển các đoạn gen kích thước lớn vào vector nhận pCB-GW-35S với hiệu suất đạt trên 95%. Phương pháp này định hướng chính xác chiều của gen, không phụ thuộc vào vị trí nhận biết enzyme cắt giới hạn và rút ngắn thời gian tạo dòng từ 2 tuần xuống còn 3 ngày.

Dòng tế bào thuốc lá BY-2 có những đặc tính ưu việt nào trong sản xuất protein tái tổ hợp?
Tế bào huyền phù thuốc lá BY-2 là dòng tế bào siêu sinh trưởng, có tốc độ nhân sinh khối khoảng 100 lần sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng đơn giản. Hệ thống này cho phép kiểm soát chặt chẽ các thông số môi trường in vitro, không phụ thuộc mùa vụ và đáp ứng rất nhạy với quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Kháng nguyên dung hợp được kiểm tra sự biểu hiện qua những phương pháp nào trong luận văn?
Sự biểu hiện của gen được đánh giá toàn diện ở cả hai mức độ: mức độ phiên mã qua kỹ thuật tách RNA tổng số và thực hiện RT-PCR để phát hiện mRNA; mức độ dịch mã qua kỹ thuật điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12% và lai miễn dịch Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận diện epitope c-Myc ở đầu carboxyl của protein tái tổ hợp.

Kết luận

Luận văn thạc sĩ khoa học của tác giả Lê Thị Thanh đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 5 điểm nhấn then chốt:

• Thiết kế hoàn chỉnh ba cấu trúc gen dung hợp tái tổ hợp ltb-gp5m, ltb-gp5 và ltb-gp3 mang đầy đủ vùng kích thích miễn dịch và tá chất niêm mạc.
• Ứng dụng thành công công nghệ tái tổ hợp Gateway để tạo ra ba vector chuyển gen nhị thể pCB-GW-35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp5 và pCB-GW-35S-ltb-gp3 với hiệu suất chính xác 100%.
• Biến nạp hiệu quả các vector vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 và chuyển gen thành công vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2.
• Xác nhận sự tồn tại ổn định của gen chuyển trong hệ gen thực vật và chứng minh sự biểu hiện phiên mã mạnh mẽ qua phân tích RT-PCR.
• Khẳng định protein kháng nguyên dung hợp được dịch mã chính xác thông qua điện di SDS-PAGE và lai miễn dịch Western Blot với kháng thể kháng thẻ c-Myc.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đặt nền móng công nghệ vững chắc cho quy trình sản xuất vắcxin phòng bệnh lợn tai xanh thế hệ mới dạng ăn được tại Việt Nam. Lộ trình nghiên cứu tiếp theo cần tập trung thử nghiệm độc tính và hiệu lực bảo hộ trên đàn lợn thí nghiệm trong vòng 12 đến 24 tháng tới, mở ra triển vọng tự chủ vắcxin thú y công nghệ cao, kiểm soát triệt để dịch bệnh PRRS và bảo vệ ngành chăn nuôi phát triển bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987.

Sau đó xuất hiện ở nhiều nƣớc chăn nuôi lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch (1992)…. Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nƣớc khác thuộc Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế giới. Ở Mỹ, thiệt hại kinh tế (trực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn. Ƣớc tính hàng năm nƣớc Mỹ phải gánh chịu những tổn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trƣờng.

Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam. Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ đƣợc thông báo vào đầu năm 2007, lây lan khắp 17 tỉnh thành, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Đến nay bệnh đã trở nên khó có thể kiểm soát đƣơ ̣c và lây lan ngày càng rộng hơn do tập quán và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt Nam. Để phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn đƣợc sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thú y.

Gần đây chỉ có một số lƣợng hạn chế các vắcxin bất hoạt và nhƣợc độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu. Tuy nhiên vắcxin dạng này có một số nhƣợc điểm nhƣ vắcxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thƣờng khô ng cao, còn vắcxin nhƣợc độc ta ̣o ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tƣơng đồng nhƣng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại. Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam cũng có hai loại vắcxin chống Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm PRRSV dạng này nhƣng giá thành khá cao, hiệu quả lại thấp và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với vi rút. Vắcxin thực vật hay còn go ̣i là vắ cxin ăn đƣ ợc (edible vaccine) là một trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại.

Thực chất vắcxin thực vật là vắcxin tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein kháng nguyên mong muốn. So với các hệ thống sản xuất vắcxin truyền thống, vắcxin thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phòng nên dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ; an toàn; đặc biệt vắcxin ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống niêm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bào thực vật”, đƣợc tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KH&CN theo nghị định thƣ giữa hai nƣớc Việt Nam – Vƣơng Quốc Bỉ: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Glycoprotein vỏ (GP5) của virus gây bệnh lợn tai xanh trong thuốc lá và đậu tương” giai đoạn 2011-2013. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam với mục tiêu: i) Thiết kế vector chuyển gen mã hóa cho một số kháng nguyên của vi rút PRRS vào tế bào thực vật và ii) Đánh giá hiệu quả sử dụng của các vector thông qua việc phân tích sự biểu hiện của các kháng nguyên trong tế bào thuốc lá BY-2.

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS) 1. Giới thiệu chung Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi rút gây ra, có lan khả năng lây nhanh và có thể ghép với các loại mầm bệnh khác do đó làm ốm và chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế [54, 59]. Ở Việt Nam bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh.

Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở lợn con cai sữa [61]. Bệnh đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm 1987 và ở châu Âu vào những năm 1990, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu. Năm 1998, bệnh đƣợc phát hiện ở châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc …) [7, 59]. Thời gian đầu do chƣa xác định đƣợc nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác nhau [59, 60]:  Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease, MDS)  Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease, BED)  Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion & Respiratory Syndrome, PEARS)  Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (Swine Infertility & Respiratory Syndrome, SIRS) Năm 1992, trong hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã nhất trí đă ̣t tên cho căn bê ̣nh này là “H ội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7].

Kể từ đó, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh. Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ. Đến nay, bệnh đã bùng phát và lây lan khắp các tỉnh thành trên cả nƣớc [28]. Triệu chứng bệnh Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các lứa tuổi và thƣờng biểu hiện ở hai trạng thái: sinh sản và hô hấp [28, 61, 62]:  Rối loạn sinh sản: tăng số lƣợng lợn con sinh ra bi ̣ch ết hoặc chết trong bào thai (25-35%), lợn con sinh non chiếm 10% đồng thời chứng biếng ăn, tắt sữa ở lợn nái nuôi con làm tăng thêm tỉ lê ̣ lợn con chết trƣớc cai sữa.

 Rối loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, khi kiểm tra mô phổi cho thấy viêm phổi, hoại tử phổi rất nặng. VI RÖT GÂY BỆNH LỢN TAI XANH Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan đã phân lập đƣợc vi rút gây bệnh lợn tai xanh, sau đó là Mỹ, Đức [59, 61]. Đến nay, các thông tin về loại vi rút này đã đƣợc nghiên cứu khá rõ. Bệnh lợn tai xanh gây ra bởi vi rút PRRS thuô ̣c chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có genom là ARN sợi đơn dƣơng [18].

Đặc điểm hình thái PRRSV là vi rút hình cầu, có vỏ bọc ngoài với đƣờng kính virion vào khoảng 45 – 55 nm, nucleocapsid có đƣờng kính từ 30 – 35 nm. Đồng thời, PRRSV là vi rút ARN, có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, mang những đặc điểm chung của chi Arterivirus [18, 60, 61]. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi rút PRRS gây bê ̣nh lơ ̣n tai xanh [61]. Cấu trúc di truyền Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Hệ gen của vi rút PRRS là ARN sợi đơn dƣơng, có kích thƣớc khoảng 15 kb và chứa 9 khung đọc mở (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7.

Trong đó ORF1a và 1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc nhƣ replicase, polymerase tham gia vào quá trình nhân bản của vi rút. Các ORF 2-7 mã hóa cho 6 protein cấu trúc bao gồm 4 phân tử glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), 1 phân tử protein mạng lƣới (M) và 1 protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hình 1. Mô hình cấu trúc hệ gen của vi rút PRRS [61]. Dựa vào phân tích cấu trúc gen ngƣời ta xác tính đƣợc 2 nhóm vi rút PRRS: nhóm I gồm các vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phổ thông là vi rút Lelystad) gồm 4 phân nhóm (subtype) đã đƣợc xác định.

Nhóm II gồm các vi rút thuộc chủng Bắc Mỹ (với tên gọi là VR-2332) [18, 62]. Gần đây, một biến thể của nhóm II có độc lực cao hơn đã xuất hiện gây nhiều tổn thất ở châu Á [28, 61]. Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhƣng các nghiên cứu cho thấy giữa hai nhóm có sự khác biệt lớn về bộ gen (mức độ tƣơng đồng chỉ 55-80%), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng nhƣ độc lực vi rút [7, 42]. Điều này có nghĩa là vắcxin đƣợc làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn.

Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm Ngƣời ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 nhóm phân lập, đƣợc khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và axít amin của các khung đọc mở (ORFs).Tƣơng đồng về trình tự axít amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) [7, 54]. Phân tích trình tự cho thấy các vi rút đang tiến hoá. Giải trình tự một phần hoặc từng gen riêng biệt, hoặc toàn bộ hệ gen, đặc biệt là vùng gen chức năng và cấu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiến hoá của các chủng vi rút là do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong các gen.