Thay Đổi Giai Đoạn Phát Triển Cây Trồng Liên Quan Đến Chuyển Giao Hoa và Hình Thành Gỗ Thứ Cấp

Nghiên cứu luận án tiến sĩ về sự chuyển pha trong phát triển thực vật liên quan đến chuyển tiếp hoa và hình thành mạch gỗ thứ cấp.

• Tác giả: Sookyung Oh
• Người hướng dẫn: Dr. Steven Van Nocker
• Trường học: Michigan State University
• Chuyên ngành: Plant Breeding and Genetics
• Đề tài: Thay Đổi Giai Đoạn Phát Triển Cây Trồng: Chuyển Giao Hoa và Hình Thành Gỗ Thứ Cấp
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2006
• Địa điểm: Ann Arbor

Mục lục chi tiết

• ABSTRACT
• ACKNOWLEDGMENTS
• TABLE OF CONTENTS
• 1. CHAPTER I: LITERATURE REVIEW
• 1.1. Phase change in plants
• 1.2. Wood formation
• 1.3. Hormones and wounding have positive effects on wood formation
• 1.3.1. Hormones
• 1.3.2. Wounding
• 1.4. Wood biosynthesis
• 2. CHAPTER II: Transcriptional Regulation of Secondary Growth in Arabidopsis
• 2.1. Materials and Methods
• 2.2. Plant growth and treatment for wood formation in Arabidopsis
• 2.3. RNA extraction and CDNA synthesis
• 2.4. GeneChip array hybridization
• 2.5. Data analysis
• 2.6. Northern blot analysis of selected R2R3-type MYB genes
• 2.7. Analysis of cis-regulatory elements
• 2.8. Results and Discussion
• 2.8.1. Secondary xylem formation in Arabidopsis
• 2.8.2. Differential gene expression in treatment stem, bark and xylem
• 2.8.3. Cell wall synthesis
• 2.8.4. Transcriptional regulation of secondary xylem formation
• 2.8.5. Identification of regulatory cis-elements for secondary growth
• 3. CHAPTER III: A Mechanism Related to the Yeast Transcriptional Regulator Paf1C Is Required for Expression of the Arabidopsis FLC/MAF MADS Box Gene Family
• 3.1. Materials and Methods
• 3.2. Plant and Yeast Material and Manipulations
• 3.3. Cloning Of VIP5
• 3.4. Molecular Techniques
• 3.5. Microarray Analysis
• 3.6. VIP5 and VIP6 Function in Concert with VIP3 and VIP4
• 3.7. VIP5 and VIP6 Participate in the Regulation of a Heterogeneous Subset of Genes Including Other Members of the FLC/MAF Gene Family
• 3.8. VIP6 Encodes a Plant Homolog of the Paf1C Component Ctr9
• 3.9. The VIP6 Protein Physically Interacts with VIP3 and VIP4 in Vivo
• 3.10. VIP5 Encodes an Additional Paf1C Subunit Homolog
• 3.11. VIP Genes Are Not Required for Global Methylation of Histone H3
• 3.12. The VIP Genes Have a Central Role in Flowering through Activation of the FLC/MAF Gene Family
• 3.13. VIP5 and VIP6 Define Important Pleiotropic Regulators of Development
• 3.14. The VIP Genes Cooperatively Regulate Gene Expression through a Mechanism Related to the Yeast Transcriptional Regulator Paf1C
• 4. CHAPTER IV: Global and Locus-Specific Roles for Arabidopsis Paf1C Homologs in Transcription and Chromatin Modifications
• 4.1. Materials and Methods
• 4.2. Plant Materials
• 4.3. Isolation of histones
• 4.4. Electrophoresis and Immunoblotting
• 4.5. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
• 4.6. Results
• 4.6.1. VIP3 is not required for global modification of either canonical or variant histone H3
• 4.6.2. VIP3 is required for H3 methylation in a locus-specific manner
• 4.6.3. Mutation of VIP3 is associated with a reduction of Pol II on FLC chromatin
• 4.6.4. VIP genes are required for modification of CTD of Pol II
• 5. CHAPTER V: Perspectives and Future Directions
• 5.1. VIP complex is required for histone H3 methylation in a locus-specific manner
• 5.2. VIP3 may be a higher eukaryote-specific component of Paf1C
• 5.3. VIP complex is required for Ser-2 and Ser-5 phosphorylation of CTD of Pol II
• APPENDIX A: Protocol for extraction of histones
• APPENDIX B: Primers for ChIP analysis
• APPENDIX C: Protocol for ChIP analysis
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Thay Đổi Giai Đoạn Sinh Trưởng Cây Trồng Khái Niệm và Tầm Quan Trọng

Trong suốt chu kỳ phát triển của cây trồng, chúng trải qua các giai đoạn sinh trưởng khác nhau, được phân biệt bởi các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa riêng biệt. Hiện tượng này được gọi là thay đổi giai đoạn sinh trưởng cây trồng (phase change). Các giai đoạn này bắt đầu từ sự nảy mầm của hạt, sau đó tiến triển qua giai đoạn non (juvenility), trưởng thành (maturity) và ra hoa. Sự thay đổi này liên quan đến khả năng của các mô phân sinh (meristems) phản ứng với các tín hiệu phát triển bên trong và bên ngoài. Hiểu rõ cơ chế điều chỉnh sự thay đổi giai đoạn phát triển là một vấn đề quan trọng trong sinh học thực vật, vì chúng được kiểm soát bởi vô số con đường truyền tín hiệu. Ví dụ điển hình nhất của thay đổi giai đoạn sinh trưởng cây trồng là sự chuyển đổi từ sinh dưỡng sang sinh sản, khi sự phát triển của lá dừng lại và các mô phân sinh biệt hóa thành hoa (Poethig, 1990).

1.1. Khái Niệm Về Giai Đoạn Phát Triển Cây Trồng

Giai đoạn phát triển cây trồng đề cập đến các giai đoạn khác nhau trong vòng đời của cây, từ nảy mầm đến chết. Mỗi giai đoạn có những đặc điểm riêng về hình thái, sinh lý và sinh hóa. Sự chuyển đổi giữa các giai đoạn này chịu ảnh hưởng bởi cả yếu tố bên trong (như hormone thực vật, di truyền học cây trồng) và yếu tố bên ngoài (như quang chu kỳ, nhiệt độ ảnh hưởng sinh trưởng, dinh dưỡng cho cây).

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Giai Đoạn Sinh Trưởng

Nghiên cứu về giai đoạn sinh trưởng cây trồng có ý nghĩa lớn trong nông nghiệp và công nghiệp. Hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển đổi giữa các giai đoạn giúp tối ưu hóa quá trình sinh trưởng, tăng năng suất và chất lượng cây trồng. Ví dụ, điều khiển thời điểm ra hoa có thể kéo dài mùa vụ hoặc tạo ra các giống cây trồng có khả năng thích ứng tốt hơn với các điều kiện môi trường khác nhau.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Chuyển Giao Hoa và Hình Thành Gỗ

Mặc dù sự chuyển đổi ra hoa đã được nghiên cứu rộng rãi, và kết quả là nhiều thành phần của con đường ra hoa đã được xác định và mô tả đặc điểm, nhưng vai trò sinh hóa của chúng trong di truyền tế bào trong quá trình chuyển đổi ra hoa ít được nghiên cứu hơn. Một ví dụ khác về sự thay đổi pha là sự chuyển đổi từ sinh trưởng sơ cấp sang sinh trưởng thứ cấp chịu trách nhiệm cho sự phát triển bên của hầu hết các loài cây, và nghiên cứu về cơ chế phân tử cho sinh trưởng thứ cấp rất hạn chế mặc dù có ý nghĩa kinh tế và sinh thái. Nghiên cứu này tập trung vào sự chuyển đổi từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh sản và sự chuyển đổi từ sinh trưởng sơ cấp sang thứ cấp liên quan đến sự hình thành gỗ, nhằm mục đích hiểu các cơ chế phân tử làm nền tảng cho sự thay đổi pha ở thực vật.

2.1. Hạn Chế Trong Nghiên Cứu Chuyển Giao Sinh Sản Ra Hoa Kêt Trái

Mặc dù nhiều yếu tố ảnh hưởng đến điều khiển ra hoa đã được xác định, nhưng cơ chế sinh hóa cụ thể của chúng trong quá trình này vẫn chưa được hiểu rõ. Cần có nhiều nghiên cứu hơn để khám phá cách các yếu tố như hormone thực vật và yếu tố môi trường tương tác với nhau để kiểm soát thời điểm và quá trình ra hoa.

2.2. Thiếu Hiểu Biết Về Hình Thành Gỗ Thứ Cấp Sinh Trưởng Thứ Cấp

Sự hình thành gỗ có vai trò quan trọng về mặt kinh tế và sinh thái, nhưng hiểu biết về cơ chế phân tử của quá trình này còn hạn chế. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các gen và con đường tín hiệu liên quan đến sự phát triển của tế bào mạch gỗ và sự tầng phát sinh mạch.

2.3. Sự Phức Tạp Trong Tương Tác Giữa Các Giai Đoạn Phát Triển

Sự chuyển đổi giữa các giai đoạn sinh trưởng cây trồng không diễn ra độc lập mà có sự tương tác phức tạp. Việc nghiên cứu sự tương tác giữa các giai đoạn, ví dụ như ảnh hưởng của sinh trưởng sơ cấp đến sinh trưởng thứ cấp, là một thách thức lớn.

III. Phương Pháp Tiếp Cận Nghiên Cứu Chuyển Đổi Hoa và Gỗ Thứ Cấp

Nghiên cứu sử dụng Arabidopsis thaliana như một mô hình để xác định các gen liên quan đến các sự kiện tuần tự trong sự hình thành gỗ bằng cách sử dụng một phương pháp tiếp cận genomics chức năng. Một số gen ứng cử viên và các yếu tố điều hòa cis tiềm năng đã được xác định có thể đóng vai trò quan trọng trong sự điều hòa di truyền của sự sinh trưởng thứ cấp. Ngoài ra, phân tích loại chức năng của các gen cho thấy sự tham gia của các yếu tố phiên mã cụ thể trong quá trình chuyển đổi từ sinh trưởng sơ cấp sang thứ cấp. Để hiểu rõ hơn về cơ chế phân tử của quá trình ra hoa, một phân tích di truyền và phân tử về các đột biến vernalization independence 5 (vip5) và vip6 ra hoa sớm đã được thực hiện.

3.1. Ứng Dụng Genomics Chức Năng Trong Nghiên Cứu Gỗ

Phương pháp genomics chức năng cho phép xác định các gen và yếu tố điều hòa liên quan đến hình thành gỗ. Bằng cách phân tích biểu hiện gen trong các mô khác nhau của cây trồng, các nhà nghiên cứu có thể xác định các gen có vai trò quan trọng trong quá trình này.

3.2. Phân Tích Di Truyền và Phân Tử Đột Biến vip5 và vip6

Nghiên cứu các đột biến vip5 và vip6 cung cấp thông tin về các gen quan trọng trong quá trình điều khiển ra hoa. Các gen này có liên quan đến các thành phần của phức hợp Paf1C, một yếu tố phiên mã quan trọng trong việc thiết lập và duy trì các sửa đổi chromatin thúc đẩy phiên mã.

3.3. Nghiên Cứu Arabidopsis thaliana Mô Hình Tiêu Chuẩn

Sử dụng Arabidopsis thaliana làm mô hình giúp đơn giản hóa nghiên cứu. Arabidopsis có vòng đời ngắn, bộ gen nhỏ và dễ dàng biến đổi gen. Nó cũng cung cấp một lượng lớn dữ liệu gen và phân tử, khiến nó trở thành một công cụ mạnh mẽ cho nghiên cứu sinh học thực vật.

IV. Vai Trò VIP5 và VIP6 Cơ Chế Điều Hòa Phiên Mã Thiết Yếu

Kết quả cho thấy cơ chế phiên mã bảo tồn tiến hóa đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển đổi ra hoa. Cuối cùng, nghiên cứu khám phá cơ chế của protein VIP trong phiên mã bằng cách mô tả đặc điểm tác động của việc mất gen VIP đối với các sửa đổi histone, sự phân bố Pol II và phosphoryl hóa miền carboxyl tận cùng (CTD) của Pol II. Protein VIP là cần thiết cho các sửa đổi chromatin theo cách đặc trưng cho vị trí, sự tuyển dụng Pol II và khử phosphoryl hóa CTD, cho thấy vai trò quan trọng của VIP trong phiên mã qua trung gian Pol II.

4.1. VIP5 và VIP6 Thành Phần Của Phức Hợp Paf1C

Protein VIP5 và VIP6 có liên quan mật thiết đến các thành phần riêng biệt của nấm men Paf1C. Mất chức năng của VIP5 và VIP6 dẫn đến sự điều chỉnh giảm họ gen FLC/MAF MADS-domain. Điều này cho thấy một cơ chế phiên mã được bảo tồn tiến hóa đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển đổi ra hoa.

4.2. Ảnh Hưởng Của VIP Đến Sửa Đổi Histone và Tuyển Dụng Pol II

Protein VIP đóng vai trò quan trọng trong các sửa đổi chromatin, sự tuyển dụng Pol II và khử phosphoryl hóa CTD. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của VIP trong phiên mã qua trung gian Pol II.

4.3. Mối Liên Quan Đến Di Truyền Học và Cơ Chế Sinh Học

Nghiên cứu này làm sáng tỏ cơ chế sinh học và di truyền học cây trồng liên quan đến sự chuyển đổi ra hoa. Nó cung cấp thông tin quan trọng về cách các gen và protein khác nhau tương tác để điều chỉnh quá trình quan trọng này.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Điều Khiển Sinh Trưởng và Năng Suất Cây

Việc hiểu rõ các cơ chế phân tử chi phối chuyển giao sinh sản và hình thành gỗ có nhiều ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp và lâm nghiệp. Việc thao túng các yếu tố như hormone thực vật, quang chu kỳ, và dinh dưỡng cho cây có thể được sử dụng để điều chỉnh thời điểm ra hoa, tăng năng suất và cải thiện chất lượng gỗ. Ví dụ, việc phát triển các giống cây trồng có khả năng ra hoa sớm hơn hoặc có tốc độ sinh trưởng gỗ nhanh hơn có thể mang lại lợi ích kinh tế đáng kể.

5.1. Tối Ưu Hóa Thời Điểm Ra Hoa để Tăng Năng Suất

Điều khiển thời điểm ra hoa là một yếu tố quan trọng để tối ưu hóa năng suất cây trồng. Bằng cách hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng đến điều khiển ra hoa, các nhà nghiên cứu có thể phát triển các phương pháp để kéo dài mùa vụ, tránh các điều kiện thời tiết bất lợi và tăng sản lượng.

5.2. Cải Thiện Chất Lượng Gỗ thông qua Điều Khiển Sinh Trưởng

Điều khiển quá trình hình thành gỗ có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng gỗ. Bằng cách thao túng các gen và con đường tín hiệu liên quan đến sự phát triển của tế bào mạch gỗ, các nhà nghiên cứu có thể tạo ra các giống cây trồng có gỗ cứng hơn, bền hơn hoặc có các đặc tính mong muốn khác.

5.3. Phát Triển Các Giống Cây Trồng Thích Ứng Tốt Hơn

Hiểu rõ các cơ chế điều chỉnh giai đoạn sinh trưởng cây trồng có thể giúp phát triển các giống cây trồng có khả năng thích ứng tốt hơn với các điều kiện môi trường khác nhau. Ví dụ, các giống cây trồng có khả năng chịu hạn hoặc chịu mặn có thể được tạo ra bằng cách thao túng các gen liên quan đến sự đáp ứng của cây trồng với stress.

VI. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Khám Phá Mạng Lưới Điều Hòa Phức Tạp

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc khám phá mạng lưới điều hòa phức tạp chi phối thay đổi giai đoạn sinh trưởng cây trồng. Việc sử dụng các kỹ thuật tiên tiến như proteomics, metabolomics và bioinformatics sẽ giúp xác định các gen, protein và chất chuyển hóa mới liên quan đến quá trình này. Ngoài ra, việc nghiên cứu sự tương tác giữa các yếu tố di truyền và môi trường cũng là một lĩnh vực quan trọng cần được khám phá.

6.1. Sử Dụng Proteomics và Metabolomics

Proteomics và metabolomics là các kỹ thuật mạnh mẽ có thể cung cấp thông tin toàn diện về sự thay đổi protein và chất chuyển hóa trong quá trình thay đổi giai đoạn sinh trưởng cây trồng. Các kỹ thuật này có thể giúp xác định các yếu tố mới liên quan đến quá trình này.

6.2. Phân Tích Bioinformatics Mạng Lưới Điều Hòa

Bioinformatics có thể được sử dụng để phân tích dữ liệu lớn từ các nghiên cứu genomics, proteomics và metabolomics, giúp xây dựng các mô hình mạng lưới điều hòa phức tạp chi phối thay đổi giai đoạn sinh trưởng cây trồng.

6.3. Nghiên Cứu Tương Tác Di Truyền và Môi Trường

Nghiên cứu sự tương tác giữa các yếu tố di truyền và môi trường là rất quan trọng để hiểu rõ cách cây trồng thích ứng với các điều kiện khác nhau. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các gen và con đường tín hiệu liên quan đến sự đáp ứng của cây trồng với stress và các yếu tố môi trường khác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

PHASE CHANGES IN PLANT DEVELOPMENT WITH RESPECT TO FLORAL TRANSITION AND SECONDARY XYLEM FORMATION By Sookyung Oh A DISSERTATION Submitted to Michigan State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of DOCTOR OF PHILOSOPHY Plant Breeding and Genetics Program Department of Horticulture 2006 UMI Number: 3236388 INFORMATION TO USERS The quality of this reproduction is dependent upon the quality of the copy submitted. Broken or indistinct print, colored or poor quality illustrations and photographs, print bleed-through, substandard margins, and improper alignment can adversely affect reproduction. In the unlikely event that the author did not send a complete manuscript and there are missing pages, these will be noted. Also, if unauthorized copyright material had to be removed, a note will indicate the deletion.

® UMI UMI Microform 3236388 Copyright 2006 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved. This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code. ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P.

Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 ABSTRACT PHASE CHANGES IN PLANT DEVELOPMENT WITH RESPECT TO FLORAL _ TRANSITION AND SECONDARY XYLEM FORMATION By Sookyung Oh During development, plants undergo a switch in the potential of meristems, termed “phase change”. Phase changes are initiated by competency of meristems to respond to internal and external developmental cues, and the changes are characterized by a unique set of morphological and physiological traits. Our understanding of how phase change is regulated at the molecular level is less clear. My thesis is to understand the molecular mechanism underlying phase changes in plants, by investigating the transition of vegetative to reproductive and of primary to secondary growth.

First, a functional genomic approach was employed to identify genes involved in sequential events of wood formation using Arabidopsis thaliana as a model. Several candidate genes and potential regulatory cis-elements were identified that may play key roles in the genetic regulation of secondary growth. In addition, functional category analysis of the genes suggests the involvement of specific transcription factors in the transition from primary to secondary growth. Second, to better understand molecular mechanism of flowering, I undertook a genetic and molecular analysis of the early-flowering vernalization independence 5 (vip5) and vip6 mutants.

VIP5 and VIP6 were cloned through mapping and transcriptional profiling. Both proteins are closely related to distinct components of budding yeast Paf1C, a transcription factor that assists in establishment and/or maintenance of transcription-promotive chromatin modifications. Loss of function of VIP5 and VIP6 resulted in downregulation of FLC/MAF MADS-domain gene family. The results suggest that an evolutionary conserved transcriptional mechanism plays an essential role in the floral transition.

Finally, I explored the mechanism of VIP proteins in transcription by characterizing the effects of loss of VIP genes on histone modifications, Pol II distribution, and phosphorylation of carboxyl-terminal domain (CTD) of Pol II. VIP proteins are required for chromatin modifications in a locus-specific manner, recruitment of Pol II, and dephosphorylation of CTD, suggesting a significant role of VIP in Pol H-mediated transcription. ACKNOWLEDGMENTS I would like to acknowledge people for helping me during my doctoral work. First, I would like to especially and sincerely thank my advisor, Dr.

Steven van Nocker for his guidance, encouragement, and support at all levels. I would also like to thank my committee members Dr. Zach Burton, Dr. Rebecca Grumet, Dr.

Jim Hancock and Dr. Amy lezzoni for their continual encouragement and offering constructive comments. I would like to thank colleagues in van Nocker laboratory, including Sunchung Park, Hua Zhang, Philip Ludwig, Lingxia Sun, Ying Yan, and Julissa Ek-Ramos. Finally, I would like to thank my family for their life-long love and encouragement.

I am especially grateful to my husband, Sunchung, for his support. iv TABLE OF CONTENTS LIST OF TABLES. Vili LIST OF FIGURES. ix CHAPTER I: LITERATURE REV HE Y.

Phase change in plants 07. Plants produce wood through secondary growth. Hormones and wounding have positive effects on wood formation. Wood bioSynnth€SIS.

óc TH ng ng TH TT TH Tàn TH 00 001 0g 7 2. Model systems for studying wood formatiOT. Functional genomic approaches to wood formation .cscseecssetseeeeeeeeeeenees 10 P9 on nh. 12 ENjiovrI0svc ii.

Cellular memory and chromatin Structure. Molecular and epigenetic mechanisms mediating vernalization. HH TH ng TH ng HH TT T000 27 li. 28 CHAPTER II: Transcriptional Regulation of Secondary Growth in Arabidopsis HA Í[(HHÁ.

co cọ H1 T9 HN HN 00100 1000400009000400800000009180000091600800086 41 ÂU 2n hố. HT HT HH Hà TT TH TH TT n0 0018130 43 Materials and Methods.- HH HH HT TT Hà Hà tà TH TT ng 1á xe 45 Plant growth and treatment for wood formation in Arabidopsis .- 45 RNA extraction and CDNA synthesis. sóng HH HH tre 46 39/2034: 700ẺẺẼ0Ẻ7Ẻ78e. 47 GeneChip array hybr1d1zafiOT.

-- c1 11911111 111 111g Hà HH nh HH Hy 47 Datta analySis 000Ẽ8ẼẺẼ886. 48 Northern blot analysis of selected R2R3-type MYB genes. 49 Analysis of cis-regulatory elements.ccccesccecscesscssscesecesneecsatestaeseateesetessateeneoes 50 Results and D1SCUSSIOTI. Q19 9T g9 1 HH TT ng kg 51 Secondary xylem formation in ArabidOpsis.

Ăn HH HH Hệ, 51 Differential gene expression in treatment stem, bark and xylem. - «nh HT ng HH Hàn H00 010011111 1101111010111101710 59 Cell wall synthesis. án” TT HH TT HH 1 T11 11 01018101007 60 fan) 7e. 64 Transcriptional regulation of secondary xylem formatiOn.

- 2c ccecceeee 65 Identification of regulatory cis-elements for secondary growth. cscsesesessecsserersecseesseseesecenessassesssssesssssasssssesessasesecsesssessesaeensesseseesseseresneges 78 CHAPTER III: A Mechanism Related to the Yeast Transcriptional Regulator Paf1C Is Required for Expression of the Arabidopsis FLC/MAF MADS Box Gene Familly. ee ececessesesesseseesessecsseseesssasseesensesseeesussessesasscsscessussceecsessessesssensessesseaeees 86 Materials and MethOs.- LH ng HH Tu nu THẾ 89 Plant and Yeast Material and ManipulatiO'iS. sáng 89 Cloning Of VIPG wo.

cecccscsscesscesecssecscceseeeaceseceessseesesesessscsasenssonaesseseesesseeensseaeessaseeen 90 Molecular T'echniQU€S.-- ‹ c1 9T ng ng gu ng 90 šg0)⁄0. c1 9v TT TH nh nọ TH HH HH 92 Rss0i5;1020ir1A4- 0 0ẺẼ 18. 93 Microarray ATiAÌYSIS. ch HH HT TT nọ TH ng gu HH HH 94 TT.

95 VIP5 and VIP6 Function in Concert with VIP3 and WÏP4. sex 95 VIPS and VIP6 Participate in the Regulation of a Heterogeneous Subset of Genes Including Other Members of the FLC/MAF Gene Family .cccsessscesesesesereeeeeees 96 VIP6 Encodes a Plant Homolog of the Paf1C Component Ctr9. --- ‹+- 103 The VIP6 Protein Physically Interacts with VIP3 and VIP4 in Vivo. 109 VIP5 Encodes an Additional Paf1C Subunit Homolog.- -¿- 5-5555: 113 VIP Genes Are Not Required for Global Methylation of Histone H3.

115 The VIP Genes Have a Central Role in Flowering through Activation of the FLC/MAF Gene FamlÏy. nàng HH ng 0010101 k1 010111 HH. 115 VIP5 and VIP6 Define Important Pleiotropic Regulators of Developmert. 118 The VIP Genes Cooperatively Regulate Gene Expression through a Mechanism Related to the Yeast Transcriptional Regulator Paf1C 0.ccssssessersesersesesseeenees 119 9x NA ốm.

125 CHAPTER IV: Global and Locus-Specific Roles for Arabidopsis PafÍC Homologs in Transcription and Chromatin Modifications —¬. G1 ng HH TT TT TH TT Cu no TT gu ng eg 132 Materials and Methods.- -ó- 0 Án TH ng HH ng HH ng ng 136 Plant Materials .- G ch TT TT nu TH HT ng ng cung 136 Isolation of histones .ccssccsessesssscsssssescsscsssscssssesscescsecscescsevscsseeseeaseaecssenseaceasaces 136 vi ˆ9ìiïis (1>.- cv 9T 9T HT TH nh gu ng nàn 137 Electrophoresis and ImmunoblÏOffIngE. «s2 HH Hư 138 Chromatin Immunoprecipitation (CÍP).- ác HH HH HH Hiệu 138 RESUS. 139 VIP3 is not required for global modification of either canonical or variant histone 6.

139 VIP3 is required for H3 methylation in a locus-specific manner.-- -- 140 Mutation of VIP3 is associated with a reduction of Pol If on FLC chromatin. 143 VIP genes are required for modification of CTD of Pol ÏT. HH HT HT HT TT TT TT TT HH TH HH TT TT ch tưng nh 152 CHAPTER V: Perspectives and Future DireCfÏOTS.cscsĂcsĂSSSSSSASessessesee 156 - VỊP complex is required for histone H3 methylation in a locus-specific manner. 157 VIP3 may be a higher eukaryote-specific component of Paf1 C.

--- +2 158 VIP complex is required for Ser-2 and Ser-5 phosphorylation of CTD of Pol H. 164 APPENDIX A: Protocol for extraction of hisfOnS.o-os 525516565555 168 APPENDIX B: Primers for ChIP analysis .cccscssosssesesesssesesssscsssessessssessesseessees 170 APPENDIX C: Protocol for ChIP analysis `. 172 vii LIST OF TABLES Table 2-1. Expression patterns of selected xylogenesis-related genes.

Regulatory cis-element motifs identified from the promoter regions of the genes up-regulated in wood-forming SteMS 0. cece - ch HH Hà Hàn th HH 77 Table 4-1. Partial list of genes down-regulated in both the vip5 and vip6 mutants, relative tO 0): 111. List of primers and S€qU€TC€S.

6 n1 11111 11911811 11191 1 1 ng nh 171 vii LIST OE EIGURES Figure 1-1. Organization of the primary and secondary vascular tissues in Arabidopsis SCheMatically. cs cecsccscssccscsecssseeescceeceseescesecsecscceseeeesesseeeeesssseeseseseeseeseseesseeeaseneeesesseseseeaees 4 Figure 1-2. Flowering time control in Arabidopsis.

Maintenance of active and repressed states of FLC transcription by chromatin „0919514150002. Cross-sections of control and treatment stems of Arabidopsis thaliana. Venn diagram showing up-regulated (22-fold) genes in control and treatment stems, xylem, and bark from the Arabidopsis Genome array analyses. Functional classification of the up-regulated genes in control and treatment Stems, bark and xylem.

R2R3-type MYB transcription factor genes up-regulated in xylem (A) or bark 0 ố ố ốốốố. Northern blot analysis of selected R2R3-type MYB genes that were highly up-regulated in xylem (MYB59 and MYB48) or bark (Ä4YB13). 5 sec cscerseseee 69 Figure 2-6. Phylogenetic tree of homeodomain (HD) genes.

Hierarchical clustering of differentially regulated genes and selection of xylem (Group I) and bark (Group II) up-regulated genes. Flowering Time of vip3, vip4, vip5, and vip6 Single and Double Mutants. Characteristics of Microarray Data Derived from fle, vip5, and vip6 Mutants. Expression of the FLC-Related MAF Genes in flc, vip5, and vip6 Mutants.

Map Position, Structure, and Expression of the VIP6 Gene and Protein. Analysis of VIP6 mRNA and Protein Abundance in Various Genetic Backgrounds and in Response to Vernalization. Coimmunoprecipitation of VIP3, VIP4, VIP5, and VIP6 in Vivo. Structure and Expression Of ƒ/ÏPŠ.

Immunoblot Analysis of Histone H3 Methylation in Strong vip3, vip4, vip5, and vip6 Mutants, the flc-3 Null Mutant, and the Col Ecotype. VIP3 is not required for global modification of either canonical or variant II) 0:06. VIP3 is required for histone H3 methylation in a locus-specific manner. VIP-FLAG proteins do not appear to coprecipitate with Pol II.

VIP genes are required for modification of the CTD of Pol II. The phosphorylation cycle of the CTD of Pol TH. --- c5 +s«c<<ccs<ss+ 162 CHAPTER I LITERATURE REVIEW 1. Phase change in plants During their life cycle, plants go through a succession of developmental phases distinguished from one another by various morphological, physiological, and biochemical traits, and the phenomenon is so-called phase change (Brink, 1962).

The phase changes begin with seed germination, and progress generally through juvenility, maturity, and flowering. The changes are associated with competence of the meristems (a tissue populated by actively dividing and undifferentiated cells) responding to internal and external developmental cues (Bernier, 1981; Steeves and Sussex, 1989). Understanding the mechanisms by which developmental phase changes are regulated will be a perpetual question throughout plant biology because they are controlled by myriad signal transduction pathways. The most obvious example of phase change is the transition from vegetative to reproductive development when leaf development is arrested and meristems are differentiated as flowers (Poethig, 1990).

Although the floral transition has been extensively studied, and as a result, many components of flowering pathways have been identified and characterized, the biochemical roles of them in cellular heredity during floral transition are less studied. Another example of phase change is the transition from primary to secondary growth responsible for lateral growth in most tree species, and the study of molecular mechanism for secondary growth is very limited despite its economical and ecological significance.