Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong những năm 1990, các chính sách phát triển nông nghiệp tại Việt Nam đã thúc đẩy mạnh mẽ sản lượng lúa gạo và rau xanh (năng suất rau xanh đạt bình quân 150 tạ/ha, tiệm cận mức trung bình thế giới là 170 tạ/ha). Gắn liền với sự gia tăng này là việc sử dụng rộng rãi các loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV). Theo số liệu từ Cục Bảo vệ Thực vật thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, thị trường đã ghi nhận hơn 300 loại HCBVTV với nhiều hoạt chất khác nhau. Bên cạnh hiệu quả bảo vệ mùa màng, dư lượng HCBVTV tồn lưu lâu dài trong đất, nước và nông sản, xâm nhập vào chuỗi thức ăn và gây tổn hại nghiêm trọng đến hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người.

Do chủng loại HCBVTV đa dạng và nền mẫu môi trường phức tạp, các phương pháp phân tích truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế: chiết lỏng - lỏng (LPE) và chiết Soxhlet đòi hỏi thể tích dung môi hữu cơ lớn (từ 300 đến 600 ml cho một mẫu), tốn nhiều thời gian và nhân lực; chiết pha rắn (SPE) tuy giảm thiểu dung môi nhưng chỉ bơm được một phần nhỏ dịch chiết (khoảng 1 - 2%) vào thiết bị sắc ký. Nhằm giải quyết yêu cầu quan trắc nhanh trên diện rộng với chi phí hợp lý, luận án tập trung phát triển và áp dụng các kỹ thuật vi chiết không dùng hoặc dùng rất ít dung môi gồm vi chiết pha rắn (SPME), vi chiết pha lỏng (LPME) kết hợp sắc ký khí sử dụng đetectơ cộng kết điện tử (GC-ECD), cùng phương pháp hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA) để xác định đa dư lượng HCBVTV.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Luận án xác định 4 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Thử nghiệm phân tích đa dư lượng vết thuốc trừ sâu cơ clo họ xyclodien bằng phương pháp ELISA nhằm khẳng định hướng tiếp cận mới trong sàng lọc nhanh HCBVTV.
  2. Thay thế một số bộ phận của dụng cụ SPME ngoại nhập bằng các nguyên vật liệu sẵn có trong nước nhằm giảm giá thành; khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tối ưu hóa quy trình phân tích.
  3. Xây dựng quy trình phân tích đa dư lượng HCBVTV trong mẫu đất rắn qua không gian hơi bằng phương pháp SPME (HS-SPME); phát triển và áp dụng phương pháp vi chiết (SPME, LPME) cho đối tượng HCBVTV trong mẫu nước.
  4. Áp dụng các phương pháp SPME và LPME kết hợp GC-ECD để phân tích, xác định đa dư lượng HCBVTV trong mẫu nước, mẫu đất tại một số khu vực quanh Hà Nội, Hải Phòng và một số tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long, từ đó đánh giá thực trạng ô nhiễm tại các địa bàn này.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các hoạt chất HCBVTV thuộc ba nhóm chính:
    • Nhóm cơ clo: $p,p'\text{-DDT}$, $p,p'\text{-DDE}$, $p,p'\text{-DDD}$, HCH (Lindan), HCB và các xyclodien (aldrin, dieldrin, endrin, $\alpha\text{-endosulfan}$, $\beta\text{-endosulfan}$, endosulfan diol, endosulfan ether, endosulfan lactone, endosulfan sulfate, chlordane, heptachlor).
    • Nhóm cơ phôtpho: Dimethoat, Diclovos (Dichlorvos), Diazinon, Malathion, Methyl-parathion, Fenthion.
    • Nhóm pyrethroit: Permethrin, Fenvalerat, Alpha-cypermethrin, Deltamethrin, Lambda-cyhalothrin.
  • Đối tượng nền mẫu: Nước mặt, nước ngầm, đất trồng trọt và rau xanh (đặc biệt là rau họ thập tự).
  • Phạm vi không gian: Khu vực trồng rau Vân Nội (Đông Anh, Hà Nội), chợ Vân Nội, hệ thống các chợ nội thành Hà Nội (8 chợ và 4 chợ nội thành), các điểm thu mẫu tại Hải Phòng và một số tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long.
  • Phạm vi thời gian: Thu thập và đánh giá thực nghiệm theo các đợt khảo sát trong giai đoạn nghiên cứu đề tài.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu tiền đề

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế:

  • Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPME): Kỹ thuật được Pawliszyn và cộng sự đề xuất lần đầu vào năm 1989 tại Đại học Waterloo (Canada) dựa trên sợi silica bọc pha tĩnh polyme kỵ nước. Các nghiên cứu tiếp theo của Potter, Buchholz, Motlagh và Pawliszyn (1992), Arthur và Pawliszyn (1990), Magdic và Pawliszyn (1996, 2000) đã mở rộng ứng dụng SPME từ mẫu nước sang không gian hơi (HS-SPME) và kết hợp với HPLC/GC. Lord và Pawliszyn hoàn thiện hệ thống xử lý mẫu đồng bộ tự động. Tại Việt Nam, Nguyễn Đức Huệ, Nguyễn Anh Tuấn, Bùi Xuân Vững (2003) nghiên cứu SPME/GC-ECD cho nhóm pyrethroit; Nguyễn Đức Toàn, Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Quy (2003) ứng dụng SPME xác định HCBVTV cơ clo trong tam thất.
  • Kỹ thuật vi chiết pha lỏng (LPME): Khởi nguồn từ các nghiên cứu chiết giọt đơn dung môi của Jeannot và Cantwell (1996, 1997), sau đó được phát triển thành vi chiết màng sợi rỗng (hollow fiber LPME) và vi chiết pha lỏng động (D-LPME) bởi Hian Kee Lee và cộng sự (Yan Wang, Lingyangzhu, Chanbasha Basheer, Gang Shen, 1998 - 2002).
  • Phương pháp phân tích miễn dịch gắn enzym (ELISA): Được ứng dụng xác định hóa chất độc hại và HCBVTV từ đầu thập niên 1980. Các công trình tiêu biểu gồm Newsame và Collins (1987) phân tích benomyl và thiabendazole; Bushway và cộng sự (1991, 1992) phát triển ELISA cạnh tranh cho dẫn xuất benzimidazole; Skerritt và cộng sự (1995) định lượng HCBVTV cơ phôtpho, pyrethroit trong ngũ cốc; Stanker và cộng sự (1995) phát hiện dẫn xuất dioxin; Marie-Claire Hennion và Damia Barcelo (2001) tổng kết ưu nhược điểm của phép thử miễn dịch trong phân tích nước. Tại Việt Nam, Bùi Văn Thìn, Nguyễn Thị Thu Trang (2002) thử nghiệm phát hiện xyclodien bằng ELISA; Lê Văn Tố (2002) đánh giá dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trên rau quả.
  • Cơ sở lý thuyết sắc ký và độc học môi trường: Các giáo trình và báo cáo chuyên đề của Phạm Hùng Việt, Trần Tứ Hiếu, Nguyễn Văn Nội (1999, 2001, 2003), Nguyễn Đình Triệu (1993), Đỗ Ngọc Liên (1999), cùng các tiêu chuẩn phương pháp của US-EPA (EPA Method 507, 508, Fact Sheets), DIN (Đức), ISO/CD 15089, WHO, FAO/WHO và UNEP.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Mặc dù các kỹ thuật SPME, LPME và ELISA đã phát triển trên thế giới, việc áp dụng tại Việt Nam còn gặp rào cản lớn do chi phí thiết bị, sợi chiết ngoại nhập đắt tiền và độ bền cơ học hạn chế. Đồng thời, việc ứng dụng đồng thời HS-SPME trên mẫu đất, SPME/LPME trên mẫu nước kết hợp với hệ thiết bị GC-ECD sẵn có tại các phòng thí nghiệm trong nước để phân tích đồng thời đa dư lượng các nhóm HCBVTV (cơ clo, cơ phôtpho, pyrethroit) chưa được chuẩn hóa đầy đủ. Luận án đã giải quyết khoảng trống này bằng cách tự chế tạo sợi và bộ gá SPME từ vật liệu trong nước, tối ưu hóa các thông số cân bằng nhiệt động và động học chiết, xây dựng đường chuẩn và kiểm chứng phương pháp trên các nền mẫu thực tế ở Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và mô hình toán học

1. Cơ sở lý thuyết kỹ thuật SPME

SPME là quá trình chiết không hoàn toàn dựa trên sự thiết lập cân bằng nhiệt động của chất phân tích giữa các pha.

  • Mô hình cân bằng tổng quát 3 pha (sợi chiết - không gian hơi - mẫu lỏng): $$C_0 V_s = C_f^\infty V_f + C_h^\infty V_h + C_s^\infty V_s \quad (1.1)$$ Trong đó: $C_0$ là nồng độ ban đầu của chất phân tích; $C_f^\infty$, $C_h^\infty$, $C_s^\infty$ là nồng độ cân bằng trong pha tĩnh sợi chiết, không gian hơi (KGH) và dung dịch mẫu; $V_f$, $V_h$, $V_s$ là thể tích tương ứng của pha tĩnh, KGH và mẫu.

  • Chiết trực tiếp từ mẫu lỏng: Hằng số phân bố: $K_{fs} = \frac{C_f^\infty}{C_s^\infty}$ Tỷ lệ phân bố: $k' = \frac{n_f}{n_s} = K_{fs} \frac{V_f}{V_s}$

    • Khi thể tích mẫu lớn ($V_s > 5\text{ ml}$, $V_s \gg K_{fs} V_f$): $$n_f = K_{fs} V_f C_0 \quad (1.4)$$
    • Khi thể tích mẫu nhỏ ($2 - 5\text{ ml}$): $$n_f = \frac{K_{fs} V_f C_0 V_s}{K_{fs} V_f + V_s} \quad (1.5)$$

  • Chiết trong không gian hơi (HS-SPME): Lượng chất phân tích hấp thu vào pha tĩnh tại trạng thái cân bằng: $$n_f = \frac{K_{fh} K_{hs} V_f C_0 V_s}{K_{fh} K_{hs} V_f + K_{hs} V_h + V_s} \quad (1.9)$$ Trong đó: $K_{fh} = \frac{C_f^\infty}{C_h^\infty}$ và $K_{hs} = \frac{C_h^\infty}{C_s^\infty}$.

  • Hệ số làm giàu ($E_f$) và thông số phân bố trong mẫu đất:

    • Hệ số làm giàu pha lỏng: $E_f = \frac{C_f^\infty}{C_0}$
    • Đối với mẫu đất: $$K_{s-h} = \frac{C_{s,eq}}{C_{h,eq}} \quad (1.14); \quad K_{f-h} = \frac{C_{f,eq}}{C_{h,eq}} \quad (1.15); \quad E_f = \frac{C_{f,eq}}{C_{s,0}} \quad (1.16)$$ Trong đó $C_{s,eq}$ tính bằng gam chất/gam mẫu đất, $C_{h,eq}$ tính bằng gam chất/ml KGH, $C_{f,eq}$ là nồng độ cân bằng trên sợi.

2. Cơ sở lý thuyết kỹ thuật LPME

Phương pháp LPME dựa trên cân bằng phân bố lỏng - lỏng giữa mẫu nước và một giọt dung môi hữu cơ không tan trong nước (thể tích $\le 2\ \mu\text{l}$) treo ở đầu kim tiêm Hamilton.

  • Hệ số phân bố: $K = \frac{C_{o,eq}}{C_{w,eq}}$
  • Hệ số làm giàu thực nghiệm: $$E_f = \frac{C_{o,eq}}{C_0} = \frac{V_s}{V_o + \frac{V_s}{K}} \quad (1.20)$$ Trong đó $V_o$ là thể tích giọt dung môi, $V_s$ là thể tích mẫu nước. Luận án áp dụng hai biến thể: vi chiết pha lỏng tĩnh (S-LPME) và vi chiết pha lỏng động (D-LPME).

3. Nguyên tắc phương pháp ELISA

ELISA hoạt động theo cơ chế miễn dịch cạnh tranh giữa chất phân tích tự do ($\text{Ag}$) và cộng hợp enzym ($\text{Ag}^$) để chiếm các vị trí gắn giới hạn trên kháng thể đặc hiệu ($\text{Ab}$) cố định trên khay polystyren: $$\text{Ab} + \text{Ag} + \text{Ag}^ \rightleftharpoons \text{AbAg} + \text{AbAg}^* \quad (1.1)$$ Sau khi rửa bỏ các phần tử tự do, enzym xúc tác phản ứng chuyển hóa cơ chất tạo thành sản phẩm có màu. Mật độ quang tỷ lệ nghịch với nồng độ chất phân tích trong mẫu.

  • Phần trăm ức chế được tính bằng công thức: $$% \text{ ức chế} = \left[ 1 - \frac{A_x - A_b}{A_c - A_b} \right] \times 100 \quad (1.2)$$ Trong đó: $A_x$ là độ hấp thụ quang của mẫu hoặc chất chuẩn; $A_b$ là độ hấp thụ của mẫu trắng; $A_c$ là độ hấp thụ của mẫu đối chứng. Đường chuẩn có dạng xích-ma, định lượng tuyến tính quanh điểm $\text{IC}_{50}$.
  • Phản ứng chéo ($\text{CR}$): $$\text{CR} = \frac{\text{IC}{50} \text{ của chất phân tích}}{\text{IC}{50} \text{ của chất có phản ứng chéo}} \quad (1.3)$$

Phương pháp thực nghiệm, thiết bị và hóa chất

  • Thiết bị phân tích:
    • Hệ thống sắc ký khí GC gắn đetectơ cộng kết điện tử ($\text{ECD}$) sử dụng nguồn phóng xạ $^{63}\text{Ni}$ phát hạt $\beta$ tạo dòng nền; khí mang $\text{N}_2$ hoặc $\text{Ar}$.
    • Máy đo quang miễn dịch khay vi lượng (Microplate reader) phục vụ kỹ thuật ELISA.
    • Bơm tiêm vi lượng Hamilton (độ chia nhỏ nhất $0{,}05\ \mu\text{l}$), thiết bị khuấy từ gia nhiệt, lọ mẫu có nắp đệm septum cao su chịu nhiệt.
  • Hóa chất và vật liệu:
    • Các chất chuẩn HCBVTV độ tinh khiết cao: DDT, DDE, DDD, Lindan, HCB, Aldrin, Dieldrin, Endrin, $\alpha/\beta\text{-Endosulfan}$, Dimethoat, Diclovos, Diazinon, Malathion, Methyl-parathion, Fenthion, Fenvalerat, Permethrin, Alpha-cypermethrin, Deltamethrin, Lambda-cyhalothrin.
    • Pha tĩnh polyme phủ sợi SPME: Polydimetylsiloxan (PDMS), Polymetylphenylsiloxan (PMPS), Polyacrylat (PA). Sợi silica trần đường kính ngoài $0{,}11\text{ mm}$, chiều dài đoạn phủ $1\text{ cm}$.
    • Dung môi chiết LPME: các dung môi hữu cơ ít phân cực, độ tan trong nước $<0{,}1\ \mu\text{l}$.
    • Kit kháng thể đặc hiệu và cộng hợp enzym phục vụ phép thử ELISA cho nhóm xyclodien.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 tổng thuật chi tiết lý thuyết và thực tiễn về xử lý mẫu và phân tích công cụ đối với HCBVTV:

  • Trình bày nguyên lý, ưu nhược điểm của các phương pháp chiết tách truyền thống (chiết lỏng - lỏng LPE, Soxhlet, chiết pha rắn SPE dùng pha hấp phụ Carbopack B, XAD-4) và các kỹ thuật vi chiết tiên tiến (SPME, LPME).
Tiêu chí so sánh Chiết pha rắn (SPE) Vi chiết pha rắn (SPME)
Dạng mẫu Mẫu lỏng - hữu cơ hoặc nước; một số mẫu bán rắn Mẫu nước, rắn, không gian hơi
Tiền xử lý mẫu Cần bước lọc loại hạt rắn, protein đối với mẫu sinh học/môi trường Không cần đối với chất dễ bay hơi; hạn chế bước làm sạch
Chất phân tích Chất khó bay hơi hoặc dễ bay hơi Chất dễ bay hơi và kém bay hơi
Lượng dung môi hữu cơ Thường cần $25\text{ ml}$ cho $1\text{ lít}$ mẫu môi trường Không sử dụng dung môi
Hiệu suất thu hồi Kém đối với chất dễ bay hơi; thường đạt $\sim 100%$ với chất phân cực Phụ thuộc cân bằng phân bố
Khả năng ghép nối sắc ký Khó ghép trực tuyến (on-line) với GC; chỉ bơm 1 - 2% mẫu Giải hấp nhiệt trực tiếp toàn bộ chất phân tích vào cổng tiêm GC
Chuẩn hóa tiêu chuẩn Nhiều phương pháp quốc tế đã phê chuẩn (EPA, DIN, ISO) Kỹ thuật hiện đại, đang mở rộng ứng dụng
  • Tổng quan phương pháp phân tích công cụ: HPLC đetectơ UV-Vis/huỳnh quang cho hợp chất kém bền nhiệt, phân cực cao; GC-ECD và GC-MS xác định lượng vết các hợp chất cơ clo, cơ phôtpho và pyrethroit (giới hạn phát hiện GC-ECD đạt $3 - 4\text{ pg}$ với HCH, HCB; $12 - 60\text{ pg}$ với DDT và dẫn xuất).
  • Phân tích chi tiết đặc tính hóa lý, độc tính cấp tính ($\text{LD}{50}$, $\text{LC}{50}$), cơ chế gây độc thần kinh (ức chế enzym cholinesterase của nhóm cơ phôtpho, tích lũy mô mỡ của nhóm cơ clo) và con đường luân chuyển trong môi trường của 18 hoạt chất HCBVTV.

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ QUÁ TRÌNH THỰC NGHIỆM

Chương 2 thiết lập các điều kiện thực nghiệm và quy trình phân tích:

  • Lấy và bảo quản mẫu: Quy trình lấy mẫu nước mặt, nước ngầm, mẫu đất tầng canh tác ($0 - 20\text{ cm}$) và mẫu rau theo tiêu chuẩn bảo vệ thực vật.
  • Chế tạo dụng cụ SPME: Chế tạo sợi vi chiết trên nền sợi silica, cố định pha tĩnh PDMS và PMPS với các độ dày khác nhau ($7\ \mu\text{m}$, $30\ \mu\text{m}$, $100\ \mu\text{m}$); lắp ráp cần kim loại và vỏ bảo vệ dạng bơm tiêm tương thích với cổng tiêm GC.
  • Quy trình ELISA: Xây dựng quy trình ủ miễn dịch cạnh tranh trên khay 96 giếng xác định nhóm xyclodien trong mẫu nước, đất và rau; xử lý sơ bộ nền mẫu bằng pha loãng dung dịch metanol $10%$.
  • Quy trình SPME/GC-ECD và HS-SPME/GC-ECD: Thiết lập điều kiện chiết mẫu nước trực tiếp (thể tích mẫu $10\text{ ml}$, thêm muối $\text{NaNO}_3$, khuấy từ, giải hấp nhiệt ở $250^\circ\text{C}$ trong buồng tiêm GC) và chiết không gian hơi HS-SPME cho mẫu đất ($5\text{ g}$ đất, tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian cân bằng).
  • Quy trình LPME/GC-ECD: Thiết lập thông số vi chiết giọt đơn tĩnh (S-LPME) và động (D-LPME) cho mẫu nước; đánh giá độ bền giọt dung môi hữu cơ ở đầu kim Hamilton.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả sử dụng phương pháp ELISA phân tích mẫu nước, rau và đất

  • Đường chuẩn ELISA của endosulfan được thiết lập trong các nền mẫu nước, đất, rau so sánh với dung dịch chuẩn metanol $10%$, cho độ tuyến tính cao quanh điểm $\text{IC}_{50}$.
  • Hiệu suất thu hồi của phương pháp ELISA trên mẫu đất và mẫu rau đạt mức khả quan, chứng minh khả năng sàng lọc bán định lượng nhanh tại hiện trường.
  • So sánh song song giữa phương pháp ELISA, chiết truyền thống (LPE/Soxhlet) kết hợp GC-ECD và SPME/GC-ECD cho thấy sự tương thích về xu hướng nồng độ; tuy nhiên ELISA có thể cho giá trị ước tính cao hơn đôi chút do phản ứng chéo ($\text{CR}$) giữa các đồng phân xyclodien.
  • Kết quả khảo sát thực tế tại khu vực Vân Nội và hệ thống chợ Hà Nội:
    • Mẫu nước tại Vân Nội (Bảng 3.2, 3.3): Phát hiện dư lượng xyclodien ở dạng vết đến nồng độ thấp.
    • Mẫu đất tại Vân Nội (Bảng 3.4): Tồn lưu endosulfan và các dẫn xuất ở tầng đất mặt.
    • Mẫu rau tại vùng trồng và chợ Vân Nội (Bảng 3.5, 3.6), mẫu rau tại 8 chợ và 4 chợ nội thành Hà Nội (Bảng 3.8, 3.9): Một số mẫu rau họ thập tự ghi nhận dư lượng xyclodien, phản ánh tập quán sử dụng thuốc BVTV trước đây.

3.2. Kết quả xây dựng, tối ưu hóa và áp dụng phương pháp SPME kết hợp GC-ECD

a. Khảo sát các thông số vi chiết mẫu nước
  • Lựa chọn pha tĩnh: Sợi phủ PMPS cho hiệu quả hấp thu vượt trội đối với các chất có độ phân cực trung bình và nhóm pyrethroit; sợi PDMS phù hợp cho các hợp chất cơ clo không phân cực.
  • Độ dày màng pha tĩnh: Màng $100\ \mu\text{m}$ có dung lượng hấp thu lớn nhất nhưng thời gian đạt cân bằng kéo dài; màng $30\ \mu\text{m}$ cho sự cân bằng tối ưu giữa thời gian chiết và độ nhạy.
  • Ảnh hưởng của muối ($\text{NaNO}_3$): Tăng nồng độ muối làm tăng hiệu ứng析 xuất (salting-out), nâng cao hệ số phân bố $K_{fs}$ của hầu hết các HCBVTV vào pha tĩnh sợi.
  • Ảnh hưởng của nhiệt độ: Hiệu quả chiết (biểu thị qua diện tích pic) tăng khi nâng nhiệt độ từ $20^\circ\text{C}$ lên $35 - 40^\circ\text{C}$ do tăng tốc độ khuếch tán, nhưng giảm mạnh ở nhiệt độ cao ($>45^\circ\text{C}$) do quá trình giải hấp ngược từ pha tĩnh vào pha nước.
Hoạt chất $20^\circ\text{C}$ $25^\circ\text{C}$ $30^\circ\text{C}$ $35^\circ\text{C}$ $40^\circ\text{C}$ $45^\circ\text{C}$ $50^\circ\text{C}$ $55^\circ\text{C}$
$p,p'\text{-DDT}$ 39.854 70.164 92.633 96.213 96.458 87.809 38.737 23.844
HCH 25.682 45.214 59.693 61.993 62.154 56.584 24.962 15.365
HCB 18.692 32.908 43.446 45.120 45.237 41.183 18.168 11.183
$p,p'\text{-DDE}$ 11.325 19.938 26.323 27.338 27.408 27.952 11.008 6.776
$\alpha\text{-Endosulfan}$ 16.829 29.627 39.116 40.624 40.713 37.065 16.352 10.063
$\beta\text{-Endosulfan}$ 25.642 45.144 59.600 61.900 62.057 56.496 24.923 15.341
Malathion 69.325 122.049 161.133 136.322 124.105 98.240 54.749 41.476
Methyl-parathion 56.328 99.167 130.924 109.557 100.210 79.450 44.000 33.700
Dimethoat 36.958 65.066 85.902 72.100 65.400 51.900 29.100 22.111
  • Phương trình đường chuẩn hấp thu SPME mẫu nước:
    • $p,p'\text{-DDT}$: $y = 265.275x + 40.935$ ($R^2 = 0{,}999$)
    • HCH: $y = 370.468x + 24.019$ ($R^2 = 0{,}9989$)
    • HCB: $y = 49.730x + 8.643$ ($R^2 = 0{,}998$)
    • $p,p'\text{-DDE}$: $y = 139.670x + 1.378$ ($R^2 = 0{,}9988$)
    • $\alpha\text{-Endosulfan}$: $y = 65.239x + 24.615$ ($R^2 = 0{,}983$)
    • $\beta\text{-Endosulfan}$: $y = 53.614x + 20.229$ ($R^2 = 0{,}983$)
    • Dimethoat: $y = 3.216{,}5x - 672{,}43$ ($R^2 = 0{,}997$)
    • Malathion: $y = 4.802x + 824{,}43$ ($R^2 = 0{,}996$)
    • Methyl-parathion: $y = 58.248x + 722{,}57$ ($R^2 = 0{,}996$)
    • Permethrin: $y = 6.200{,}1x + 2.416{,}4$ ($R^2 = 0{,}9966$)
    • Alpha-cypermethrin: $y = 4.902{,}6x + 130{,}86$ ($R^2 = 0{,}995$)
    • Deltamethrin: $y = 4.494{,}4x + 1.375{,}3$ ($R^2 = 0{,}9971$)
    • Lambda-cyhalothrin: $y = 6.119{,}0x + 976{,}57$ ($R^2 = 0{,}997$)
b. Tối ưu hóa HS-SPME và phân tích mẫu đất
  • Khảo sát các thông số không gian hơi: nhiệt độ buồng ủ đất ($60 - 80^\circ\text{C}$), áp suất và thời gian cân bằng hơi ($30 - 45\text{ phút}$).
  • Phương trình đường chuẩn phân bố HS-SPME mẫu đất:
    • $p,p'\text{-DDT}$: $y = 8.196{,}5x - 36{,}344$ ($R^2 = 0{,}9992$)
    • HCH: $y = 733{,}69x + 94{,}074$ ($R^2 = 0{,}9987$)
    • HCB: $y = 2.094{,}6x - 480{,}74$ ($R^2 = 0{,}985$)
    • $\alpha\text{-Endosulfan}$: $y = 1.885{,}2x - 432{,}5$ ($R^2 = 0{,}998$)
    • $\beta\text{-Endosulfan}$: $y = 9.752{,}2x + 196{,}47$ ($R^2 = 0{,}984$)
    • Dimethoat: $y = 3.742{,}2x - 1.568{,}1$ ($R^2 = 0{,}9959$)
    • Diclovos: $y = 811{,}5x + 194{,}45$ ($R^2 = 0{,}9841$)
    • Diazinon: $y = 156{,}9x + 91{,}156$ ($R^2 = 0{,}9966$)
    • Methyl-parathion: $y = 223{,}35x - 124{,}87$ ($R^2 = 0{,}9983$)
    • Fenthion: $y = 1.249{,}7x + 257{,}26$ ($R^2 = 0{,}9967$)
    • Permethrin: $y = 861{,}68x - 108{,}66$ ($R^2 = 0{,}9824$)
  • Đánh giá sai số, độ thu hồi (đạt trên $85%$) và áp dụng phân tích thành công trên các mẫu đất thực tế (mẫu M1, M3 và các điểm quan trắc).

3.3. Kết quả xây dựng, tối ưu hóa và áp dụng phương pháp LPME kết hợp GC-ECD

  • Dung môi và thể tích: Tối ưu hóa thể tích giọt dung môi trong khoảng $1{,}0\ \mu\text{l}$ (giữ ổn định ở đầu kim, không bị rơi hay hòa tan quá mức).
  • Điều kiện vi chiết: Xác định $\text{pH}$ môi trường trung tính ($\text{pH } 6 - 7$), tốc độ khuấy mẫu $600 - 800\text{ vòng/phút}$, nồng độ muối bão hòa nhẹ, thời gian vi chiết $15\text{ phút}$.
  • Phương trình đường chuẩn LPME mẫu nước:
    • $p,p'\text{-DDT}$: $y = 5.997x + 884{,}58$ ($R^2 = 0{,}986$)
    • HCH: $y = 20.089x + 486{,}39$ ($R^2 = 0{,}9983$)
    • HCB: $y = 3.769{,}3x + 82{,}739$ ($R^2 = 0{,}996$)
    • $p,p'\text{-DDE}$: $y = 38.423x + 2.468{,}8$ ($R^2 = 0{,}9992$)
    • Dimethoat: $y = 1.017{,}2x - 373{,}57$ ($R^2 = 0{,}995$)
    • Diclovos: $y = 649{,}14x + 91{,}304$ ($R^2 = 0{,}9993$)
    • Diazinon: $y = 741{,}54x + 249{,}39$ ($R^2 = 0{,}9972$)
    • Malathion: $y = 2.027x - 986{,}46$ ($R^2 = 0{,}999$)
    • Methyl-parathion: $y = 5.173{,}3x - 86{,}261$ ($R^2 = 0{,}9946$)
  • Phương pháp LPME cho hệ số làm giàu $E_f$ cao, giới hạn phát hiện đạt mức $\mu\text{g/l}$ đến $\text{ng/l}$, áp dụng phân tích mẫu nước tự nhiên đạt độ lặp lại cao.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học và lý luận

  1. Hệ thống hóa và làm sáng tỏ cơ chế nhiệt động học và động học của các quá trình vi chiết (SPME trực tiếp, HS-SPME, LPME) đối với 18 hoạt chất HCBVTV thuộc 3 nhóm có cấu trúc và tính chất hóa lý khác nhau (cơ clo, cơ phôtpho, pyrethroit).
  2. Thiết lập hệ thống hằng số phân bố điều kiện ($K_{fs}$, $K_{fh}$, $K_{s-h}$, $K_{ow}$) và hệ số làm giàu ($E_f$) cho từng hoạt chất cụ thể trên các nền mẫu nước và đất tại Việt Nam.
  3. Chứng minh khả năng ứng dụng của phương pháp miễn dịch học ELISA như một công cụ sàng lọc bán định lượng nhanh, bổ trợ hiệu quả cho các kỹ thuật sắc ký khí tiêu chuẩn.

Đóng góp về mặt thực tiễn và giải pháp kỹ thuật

  1. Chế tạo thành công dụng cụ SPME và sợi vi chiết pha tĩnh PMPS/PDMS từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, thay thế dụng cụ ngoại nhập đắt tiền, giúp giảm chi phí phân tích.
  2. Xây dựng hoàn chỉnh 3 quy trình phân tích đa dư lượng có độ nhạy và độ chính xác cao:
    • Quy trình ELISA sàng lọc nhóm xyclodien trong nước, đất, rau.
    • Quy trình SPME/GC-ECD (chiết trực tiếp cho mẫu nước) và HS-SPME/GC-ECD (cho mẫu đất).
    • Quy trình LPME/GC-ECD phân tích mẫu nước.
  3. Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm về mức độ tồn lưu đa dư lượng HCBVTV tại vùng rau Vân Nội, các chợ nội thành Hà Nội, Hải Phòng và đồng bằng sông Cửu Long, làm cơ sở khoa học cho các cơ quan quản lý môi trường và nông nghiệp trong việc kiểm soát hóa chất BVTV.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

  • Phương pháp ELISA có độ chọn lọc bị giới hạn do phản ứng chéo giữa các hợp chất có cấu trúc tương đồng (như các đồng phân xyclodien) và chịu ảnh hưởng nhất định bởi chất nền mẫu, đòi hỏi phải lập đường chuẩn trên chính nền mẫu tương ứng.
  • Phương pháp vi chiết pha lỏng động (D-LPME) đòi hỏi thao tác kỹ thuật cao, dễ gây sai số cơ học trong quá trình hút - đẩy dung môi ở đầu kim vi lượng.
  • Độ bền cơ học của sợi SPME tự chế cần tiếp tục được nâng cao để kéo dài số lần tái sử dụng trong các nền mẫu đất phức tạp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng tổng hợp và tinh chế các kháng thể đơn dòng đặc hiệu nhằm nâng cao độ chọn lọc của kỹ thuật ELISA cho các nhóm HCBVTV khác ngoài họ xyclodien.
  • Tự động hóa hoàn toàn hệ thống tiêm mẫu SPME và LPME ghép nối trực tuyến (on-line) với GC-ECD và GC-MS.
  • Mở rộng phạm vi quan trắc trên các đối tượng nông sản xuất khẩu chủ lực và trầm tích đáy sông ngòi trên quy mô toàn quốc.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa phân tích, Hóa môi trường: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp vi chiết không dung môi, mô hình hóa cân bằng phân bố pha và kỹ thuật sắc ký khí đetectơ ECD.
  • Giảng viên và các phòng thí nghiệm phân tích: Cung cấp hướng dẫn kỹ thuật tự chế tạo dụng cụ SPME, phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ, thời gian chiết và cách thiết lập đường chuẩn Hamilton.
  • Cơ quan quản lý nhà nước (Bộ Nông nghiệp và PTNT, Bộ Tài nguyên và Môi trường, Cục BVTV): Tham khảo các quy trình kiểm nghiệm nhanh phục vụ quan trắc ô nhiễm môi trường đất, nước và an toàn vệ sinh thực phẩm nông sản.

Nội dung có giá trị ứng dụng cao

  • Bảng thông số điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ, nồng độ muối, loại pha tĩnh cho 18 hoạt chất HCBVTV (Chương 2 và Chương 3).
  • Hệ thống phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính của SPME/GC-ECD, HS-SPME/GC-ECD và LPME/GC-ECD.
  • Bộ quy trình thao tác chuẩn (SOP) cho phương pháp ELISA và vi chiết mẫu môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án chỉ áp dụng phương pháp ELISA cho nhóm HCBVTV cơ clo họ xyclodien mà không mở rộng cho các nhóm khác?

Theo tác giả trình bày trong phần Mở đầu, phương pháp ELISA đòi hỏi các kháng thể và enzym đặc trưng riêng biệt, có tính chọn lọc cao đối với từng nhóm hoạt chất. Việc thử nghiệm trên họ xyclodien nhằm mục đích khẳng định tính khả thi của một hướng tiếp cận mới trong phân tích sàng lọc nhanh, tạo tiền đề khoa học trước khi mở rộng cho các nhóm thuốc bảo vệ thực vật khác.

2. Sự khác biệt cơ bản về mặt kỹ thuật giữa S-LPME và D-LPME là gì?

Trong vi chiết pha lỏng tĩnh (S-LPME), giọt dung môi hữu cơ ($1\ \mu\text{l}$) được đẩy ra và giữ cố định ở đầu kim tiêm Hamilton đặt trong dung dịch hoặc không gian hơi để chất phân tích tự khuếch tán cho đến khi đạt cân bằng. Trong vi chiết pha lỏng động (D-LPME), dung môi không được đẩy ra ngoài mà dung dịch/hơi mẫu được hút vào và đẩy ra liên tục (khoảng 20 lần trong 3 phút) qua kim tiêm, tạo thành các màng dung môi mỏng bám trên thành trong kim tiêm được bão hòa chất phân tích nhanh hơn nhiều so với quá trình khuếch tán tĩnh.

3. Tại sao khi tăng nhiệt độ chiết mẫu nước bằng SPME quá $45^\circ\text{C}$, hiệu quả chiết lại suy giảm?

Quá trình SPME là quá trình tỏa nhiệt. Nâng nhiệt độ từ $20^\circ\text{C}$ lên $35 - 40^\circ\text{C}$ giúp tăng tốc độ khuếch tán của phân tử HCBVTV từ pha nước vào pha tĩnh. Tuy nhiên, khi nhiệt độ vượt quá $45^\circ\text{C}$, hằng số phân bố nhiệt động $K_{fs}$ giảm xuống, làm dịch chuyển cân bằng theo hướng giải hấp chất phân tích từ pha tĩnh sợi chiết trở lại dung dịch nước, dẫn đến diện tích pic sắc ký suy giảm rõ rệt.

4. Đetectơ cộng kết điện tử (ECD) hoạt động theo nguyên lý nào và tại sao lại đặc biệt nhạy với HCBVTV cơ clo?

Đetectơ ECD sử dụng nguồn phóng xạ $^{63}\text{Ni}$ phát ra chùm hạt $\beta$ ion hóa khí mang ($\text{N}_2$ hoặc $\text{Ar}$), tạo ra dòng điện tử sơ cấp dịch chuyển về anôt để hình thành dòng điện nền ổn định. Khi các hợp chất chứa nguyên tử có độ âm điện lớn (đặc biệt là halogen như clo trong HCBVTV cơ clo) đi vào buồng đo, chúng bắt giữ các điện tử tự do tạo thành ion âm, làm sụt giảm thế của dòng điện nền. Độ sụt giảm thế này tỷ lệ thuận với lượng chất phân tích, cho phép phát hiện lượng vết ở mức picogam ($10^{-12}\text{ g}$).

Kết luận

Luận án đã nghiên cứu và phát triển thành công hệ thống phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV lượng vết thuộc 3 nhóm cơ clo, cơ phôtpho và pyrethroit bằng các kỹ thuật tiên tiến gồm ELISA, SPME và LPME kết hợp GC-ECD. Việc tự chế tạo dụng cụ và sợi chiết SPME từ vật liệu trong nước đã chứng minh tính khả thi cao về mặt kinh tế và kỹ thuật, loại bỏ sự phụ thuộc vào vật tư ngoại nhập. Các quy trình phân tích được chuẩn hóa đạt độ chính xác, độ nhạy cao và đã được áp dụng hiệu quả để đánh giá thực trạng tồn lưu HCBVTV trong môi trường nước, đất và nông sản tại một số địa bàn trọng điểm ở Việt Nam.