Khóa luận tốt nghiệp: Nuôi cấy in vitro cây sầu riêng (Durio zibethinus Murray)

Tìm hiểu phương pháp nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sầu riêng (Durio zibethinus). Bài viết phân tích quy trình, kỹ thuật và ý nghĩa của phương pháp này trong

• Đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sầu riêng (Durio zibethinus)

Tóm tắt

I. Tổng quan về nuôi cấy in vitro cây sầu riêng và tầm quan trọng

Nuôi cấy in vitro cây sầu riêng (Durio zibethinus) là kỹ thuật sinh học mô giúp tạo ra cây con trong môi trường vô trùng. Phương pháp này giảm phụ thuộc vào hạt giống tự nhiên, tăng tốc thời gian sinh trưởng và duy trì tính năng di truyền của cây mẹ. Nhờ việc điều chỉnh môi trường dinh dưỡng, hormone và ánh sáng, các mô có thể phát triển thành chồi, rễ và cây hoàn chỉnh. Ứng dụng của nuôi cấy in vitro mở rộng nguồn cung giống cây sầu riêng cho các vùng trồng mới, giảm rủi ro bệnh truyền hạt và tăng năng suất thu hoạch. Nghiên cứu hiện tại tập trung vào tối ưu hoá thành phần MS, nồng độ cytokinin và auxin để nâng cao tỷ lệ thành công và chất lượng cây con.

1.1. Định nghĩa và nguyên lý nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy in vitro là quá trình sinh trưởng mô thực vật trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, không có vi sinh vật. Mô được tách ra từ lá, mầm hoặc chi thối, rồi đặt trên nền MS hoặc B5. Hormone như BA và NAA điều chỉnh sự phân chia tế bào, tạo ra chồi hoặc rễ. Quá trình diễn ra trong ủng đựng, đảm bảo điều kiện vô trùng và kiểm soát nhiệt độ.

1.2. Lý do lựa chọn sầu riêng làm đối tượng nghiên cứu

Sầu riêng là cây trái có giá trị kinh tế cao, nhu cầu thị trường tăng mạnh. Tuy nhiên, thời gian sinh trưởng dài và khó nhân giống bằng hạt làm hạn chế cung cấp giống. Nuôi cấy in vitro giúp tạo ra cây con đồng nhất, giảm thời gian đạt thu và đáp ứng nhu cầu nguồn giống chất lượng.

II. Các vấn đề và thách thức trong nuôi cấy in vitro cây sầu riêng

Mặc dù tiềm năng lớn, nuôi cấy in vitro cây sầu riêng gặp nhiều khó khăn. Đầu tiên, phản ứng của mô sầu riêng với hormone chưa ổn định, dẫn đến tỷ lệ tạo chồi thấp. Thứ hai, hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm mốc dễ xảy ra do môi trường ẩm ướt. Thứ ba, chi phí môi trường nuôi cấy và vật liệu tiêu hao cao, gây rào cản cho các cơ sở nông nghiệp quy mô vừa và nhỏ. Ngoài ra, chưa có tiêu chuẩn chung cho thành phần dinh dưỡng phù hợp, làm tăng thời gian thử nghiệm và thất bại.

2.1. Độ nhạy của mô sầu riêng với hormone BA và NAA

Nồng độ BA và NAA ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành chồi và rễ. Nghiên cứu cho thấy nồng độ BA quá cao gây độc tế bào, trong khi thiếu BA làm giảm khả năng tạo chồi. Cần xác định liều lượng tối ưu cho mỗi giai đoạn nuôi cấy.

2.2. Quản lý nhiễm khuẩn trong môi trường vô trùng

Môi trường ủng ẩm tạo điều kiện cho vi khuẩn và nấm phát triển nhanh. Việc khử tiêu liệu, sử dụng chất kháng sinh hợp lý và kiểm soát thời gian tiệt trùng là yếu tố quyết định giảm thiểu nhiễm khuẩn.

III. Phương pháp và kỹ thuật nuôi cấy in vitro cây sầu riêng hiệu quả

Để nâng cao thành công, nghiên cứu đề xuất một quy trình gồm ba bước chính: chuẩn bị chất nền MS bổ sung vitamin và đường, điều chỉnh hormone BA 2 mg L⁻¹ và NAA 0.5 mg L⁻¹, và duy trì nhiệt độ 25 °C với chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày. Sau giai đoạn khởi tạo, các chồi được chuyển sang môi trường tăng cường rễ bằng việc bổ sung IAA 1 mg L⁻¹. Kiểm soát pH 5.8 và áp dụng khí CO₂ 400 ppm giúp tăng tốc sinh trưởng. Cuối cùng, cây con được chuyển sang thí nghiệm cứng để thích nghi với môi trường đất, giảm hiện tượng chết mẫu.

3.1. Tối ưu thành phần môi trường nuôi cấy

Thành phần MS cần bổ sung sucrose 30 g L⁻¹, gelrite 8 g L⁻¹ và vitamin B5. Thêm chất kháng sinh như cefotaxime 100 mg L⁻¹ để ngăn nhiễm khuẩn. Các chất phụ trợ này hỗ trợ năng lượng và duy trì áp suất thẩm thấu ổn định.

3.2. Quy trình chuyển đổi chồi thành cây con

Sau 4–6 tuần, chồi đạt độ dài 1 cm được cắt ra và đặt trong môi trường tăng rễ. Khi rễ đủ dài 2 cm, cây con được rửa sạch và trồng vào hộp đất pha cát và cám gạo, duy trì độ ẩm 70 % trong 3 tuần trước khi chuyển ra ruộng.

IV. Kết luận và ứng dụng thực tiễn của nuôi cấy in vitro cây sầu riêng

Nuôi cấy in vitro cây sầu riêng mang lại giải pháp khả thi cho việc mở rộng nguồn giống đồng nhất, giảm thời gian sinh trưởng và tối ưu sản lượng. Các nhà nghiên cứu có thể áp dụng quy trình đã tối ưu để sản xuất cây con chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường nhanh chóng. Ứng dụng thực tiễn bao gồm cung cấp giống cho các vùng trồng mới, bảo tồn gen quý hiếm và hỗ trợ các chương trình cải thiện giống. Khi quy mô sản xuất tăng, chi phí sẽ giảm, giúp nông dân nhỏ lẻ tiếp cận công nghệ tiên tiến và nâng cao thu nhập.

4.1. Đóng góp vào bảo tồn đa dạng sinh học

Việc nuôi cấy cho phép lưu trữ và nhân giống các giống sầu riêng có giá trị dinh dưỡng và hương vị đặc biệt, giảm áp lực khai thác tự nhiên và duy trì nguồn gen phong phú.

4.2. Triển khai mô hình sản xuất quy mô lớn

Các doanh nghiệp nông nghiệp có thể đầu tư vào nhà máy nuôi cấy, tạo dòng cung ổn định cho các khu vực trồng sầu riêng, đồng thời giảm rủi ro thất bại do bệnh dịch và biến đổi khí hậu.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây sầu riêng (Durio zibethinus Murray) thuộc họ Malvaceae, là loại cây ăn quả nhiệt đới có giá trị kinh tế cao tại Việt Nam và các quốc gia Đông Nam Á. Thịt quả sầu riêng có hương vị đặc trưng, giàu giá trị dinh dưỡng với hàm lượng đáng kể các chất như lipid, protein, acid amin, vitamin và các hợp chất thơm. Bên cạnh giá trị thực phẩm, các bộ phận khác như vỏ, hạt cũng được sử dụng làm nguyên liệu dược liệu, trong khi thân cây cung cấp vật liệu gỗ.

Trong thực tế sản xuất, việc nhân giống sầu riêng hiện nay chủ yếu dựa vào hai phương pháp truyền thống:

• Nhân giống hữu tính (bằng hạt): Phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp, cây con có bộ rễ cọc khỏe. Tuy nhiên, hình thức nhân giống này có hệ số nhân giống thấp, thời gian cho thu hoạch trái kéo dài, cây con có mức độ phân ly tính trạng cao, không duy trì được các đặc tính tốt của cây mẹ và dẫn đến sự không đồng đều của vườn cây.
• Nhân giống vô tính (chiết cành, ghép mắt): Phương pháp này giúp duy trì được đặc tính của cây mẹ và rút ngắn thời gian cho trái. Dù vậy, kỹ thuật đòi hỏi kinh nghiệm cao, hệ số nhân giống chưa cao và tiềm ẩn nguy cơ lây truyền mầm bệnh qua mắt ghép hoặc cành chiết.

Để đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô lớn với nguồn cây giống đồng nhất, sạch bệnh, đồng thời tạo tiền đề cho các ứng dụng công nghệ sinh học chuyên sâu như chuyển gen hay chọn tạo biến dị soma, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) được xác định là hướng tiếp cận phù hợp. Trước thời điểm nghiên cứu, tại Việt Nam chưa có công trình nào công bố về quy trình vi nhân giống in vitro cây sầu riêng.

Nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác lập qua các nội dung cụ thể:

1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng $\text{HgCl}_2$ và thời gian xử lý đến tỷ lệ vô trùng và khả năng sống của mẫu cấy.
2. Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng $\text{N}^6\text{-benzyladenin}$ (BA) đến khả năng phát sinh cụm chồi từ đốt thân.
3. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo cụm chồi từ phôi hạt hữu tính ở các giai đoạn phát triển khác nhau: phôi 1 tháng tuổi, phôi 2 tháng tuổi và phôi trưởng thành.
4. Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng $1\text{-Naphthaleneacetic acid}$ (NAA) đến khả năng kích thích tạo rễ từ chồi in vitro.
5. Thực hiện giải phẫu so sánh cấu trúc mô học (đỉnh sinh trưởng, thân, lá, rễ) giữa cây sầu riêng sinh trưởng ngoài tự nhiên (3 tháng tuổi) và cây sầu riêng tái sinh in vitro (10 tuần tuổi).

Đối tượng nghiên cứu là cây sầu riêng (Durio zibethinus Murray). Không gian thực nghiệm được triển khai tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) và cơ chế điều hòa quá trình phát sinh hình thái in vitro thông qua tỷ lệ phối hợp giữa các nhóm phytohormone. Khung lý thuyết và các chất điều hòa sinh trưởng chủ đạo được áp dụng bao gồm:

• Môi trường khoáng cơ bản: Môi trường Murashige & Skoog (MS), cung cấp các nguyên tố đa lượng, vi lượng và vitamin thiết yếu cho mô thực vật.
• Nhóm Cytokinin: Sử dụng $\text{N}^6\text{-benzyladenin}$ (BA) với vai trò kích thích sự phân chia tế bào, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của chồi nách, kích thích sự phân hóa và tạo cụm chồi từ mô phân sinh hoặc phôi hữu tính.
• Nhóm Auxin: Sử dụng $1\text{-Naphthaleneacetic acid}$ (NAA) với vai trò kích thích sự kéo dài tế bào, thúc đẩy sự phân chia tầng phát sinh và kích thích quá trình hình thành rễ bất định từ gốc chồi in vitro.
• Hóa chất khử trùng bề mặt: Dung dịch thủy ngân clorua ($\text{HgCl}_2$) dùng để loại bỏ nấm và vi khuẩn ngoại nhiễm trên bề mặt mẫu vật tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo hệ thống các thí nghiệm độc lập và tuần tự trong phòng thí nghiệm:

Tên thí nghiệm	Yếu tố khảo sát	Nguồn mẫu cấy	Môi trường cơ bản và chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm 1	Nồng độ $\text{HgCl}_2$ và thời gian khử mẫu	Đốt thân, hạt/phôi	Tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống sau 7 ngày theo dõi
Thí nghiệm 2	Dải nồng độ BA	Đốt thân	Môi trường MS; khả năng hình thành và hệ số nhân chồi
Thí nghiệm 3	Dải nồng độ BA	Phôi hạt hữu tính 1 tháng tuổi	Môi trường MS; tỷ lệ tạo chồi, số chồi/cụm
Thí nghiệm 4	Dải nồng độ BA	Phôi hạt hữu tính 2 tháng tuổi	Môi trường MS; tỷ lệ tạo chồi, số chồi/cụm
Thí nghiệm 5	Dải nồng độ BA (từ 1 đến 10 mg/l)	Phôi hạt hữu tính trưởng thành	Môi trường MS; tỷ lệ tạo cụm chồi, hình thái chồi sau 4 tuần nuôi cấy
Thí nghiệm 6	Dải nồng độ NAA (từ 1 đến 5 mg/l)	Chồi in vitro	Môi trường MS; tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ, chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy

Bên cạnh phương pháp nuôi cấy mô, nghiên cứu sử dụng phương pháp giải phẫu thực vật học:

• Tiến hành thực hiện các lát cắt vi phẫu: Cắt dọc đỉnh sinh trưởng; cắt ngang thân, lá và rễ.
• Đối tượng kiểm tra giải phẫu: Cây ngoài tự nhiên 3 tháng tuổi và cây in vitro 10 tuần tuổi.
• Quan sát cấu trúc giải phẫu dưới kính hiển vi quang học nhằm so sánh sự biến đổi về mặt tổ chức mô giữa hai điều kiện sinh trưởng. Số liệu thực nghiệm được thu thập, xử lý và thống kê theo phương pháp xử lý số liệu sinh học.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I hệ thống hóa toàn diện các kiến thức sinh học, sinh thái và hiện trạng nghiên cứu về cây sầu riêng cũng như kỹ thuật nuôi cấy mô:

• Vị trí phân loại học: Giới Plantae, Ngành Magnoliophyta, Lớp Magnoliosida, Phân lớp Magnoliidae, Bộ Malvales, Họ Malvaceae, Chi Durio, Loài Durio zibethinus Murray. Cây có nguồn gốc từ Malaysia, phân bố ở các vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo và được du nhập vào Việt Nam đầu tiên tại Tân Quy (Biên Hòa).
• Đặc điểm hình thái và sinh thái: Sầu riêng là cây thân gỗ lớn, cao đến 40 m, phân cành thấp, cành giòn dễ gãy. Lá đơn mọc cách, mặt dưới phủ lớp lông vảy màu nâu sáng ánh vàng. Rễ cọc có thể ăn sâu 5-6 m. Cây sinh trưởng thuận lợi ở nhiệt độ 24-30°C, ẩm độ không khí 75-85%, lượng mưa hàng năm từ 1600-4000 mm (tối ưu khoảng 2000 mm), đất thịt nhẹ, tầng đất dày 3-4 m, thoát nước tốt với pH từ 5-6,5.
• Thành phần dinh dưỡng: Bảng 1 trong tài liệu xác lập thành phần hóa học của cơm sầu riêng tính trên 100 g thịt quả tươi:

Thành phần dinh dưỡng	Hàm lượng	Thành phần khoáng và vitamin	Hàm lượng
Năng lượng	134 - 153 kcal	Phốt pho	27 - 56 mg
Độ ẩm	58 - 70 %	Sắt	0,73 - 2 mg
Protein	2,0 - 3,3 %	Vitamin A	20 - 30 IU
Đường	12 %	Vitamin B1	0,2 - 0,28 mg
Tinh bột	12 %	Vitamin B2	0,1 - 0,28 mg
Chất béo	1,1 - 1,2 %	Vitamin B6	0,68 - 1,1 mg
Chất xơ	1,7 %	Vitamin C	23 - 62 mg

• Tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế:
  • Trong nước, các công trình trước đó chỉ tập trung vào chọn lọc giống và phòng trừ bệnh học như nghiên cứu cây đầu dòng ở Đắk Lắk của Trần Vinh (1996), nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora của Huỳnh Văn Thành (2000), hay khảo sát hiện tượng sượng cơm trái sầu riêng Monthong tại Bến Tre của Huỳnh Văn Tấn và Nguyễn Minh Châu (2003). Chưa có ghi nhận về công trình nuôi cấy mô sầu riêng trong nước.
  • Ngoài nước, các nghiên cứu tập trung vào hướng khai thác hóa sinh và phụ phẩm, ví dụ như sử dụng vỏ sầu riêng xử lý hấp phụ thuốc nhuộm acid, nghiên cứu hoạt tính điều hòa miễn dịch của gel polysaccharide từ sầu riêng trên tôm sú (Penaeus monodon) chống vi khuẩn Vibrio harveyi và virus WSSV của Komsil Pholdaeng và cộng sự (2010), hoặc ứng dụng vỏ sầu riêng thu hồi dung dịch vàng.

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II trình bày quy trình thao tác và điều kiện thí nghiệm tại phòng nuôi cấy mô thực vật:

• Điều kiện nuôi cấy: Hệ thống phòng nuôi kiểm soát vô trùng, nhiệt độ và chu kỳ chiếu sáng tiêu chuẩn cho sự sinh trưởng mô thực vật in vitro.
• Hóa chất sử dụng: Môi trường MS hoàn chỉnh, chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin ($\text{BA}$), nhóm auxin ($\text{NAA}$), muối thủy ngân ($\text{HgCl}_2$), cùng các hóa chất phụ trợ dùng trong pha chế môi trường và nhuộm lát cắt giải phẫu.
• Phương pháp khử mẫu và bố trí thực nghiệm: Chi tiết hóa các nồng độ $\text{HgCl}_2$ kết hợp với thời gian xử lý mẫu. Thiết kế các công thức môi trường MS có bổ sung nồng độ BA tăng dần từ 1 mg/l đến 10 mg/l cho các loại mẫu cấy (đốt thân, phôi hạt hữu tính 1 tháng tuổi, 2 tháng tuổi và phôi trưởng thành). Thiết kế dải nồng độ NAA từ 1 mg/l đến 5 mg/l để thăm dò khả năng kích thích sinh rễ của chồi.
• Kỹ thuật giải phẫu mô học: Quy trình tạo lát cắt tươi/cố định vi phẫu mô đỉnh sinh trưởng, thân, lá và rễ để so sánh cấu tạo giữa cây in vitro (10 tuần tuổi) và cây tự nhiên (3 tháng tuổi).

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III phân tích dữ liệu thực nghiệm qua hệ thống bảng số liệu và hình ảnh đối chứng:

• Khử trùng tạo nguồn mẫu sạch ban đầu: Dữ liệu Bảng 8 ghi nhận kết quả xử lý mẫu sau 7 ngày theo dõi, xác định hiệu quả của từng nồng độ $\text{HgCl}_2$ và thời gian ngâm mẫu trong việc giảm tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn và duy trì khả năng sống sót của mô cấy.
• Tái sinh chồi từ các nguồn mẫu cấy:
  • Mẫu đốt thân (Bảng 3, Hình 4, Hình 5): Đánh giá khả năng sống và mức độ đáp ứng tạo chồi trên môi trường MS có BA sau 4 tuần nuôi cấy.
  • Mẫu phôi hạt hữu tính 1 tháng tuổi và 2 tháng tuổi (Bảng 4, Bảng 5, Hình 6, Hình 7): Phản ánh sự khác biệt về khả năng phát sinh cụm chồi phụ thuộc vào độ tuổi sinh lý của phôi khi tiếp xúc với cytokinin.
  • Mẫu phôi hạt hữu tính trưởng thành (Bảng 6, Bảng 9, Hình 8 đến Hình 19): Thử nghiệm trên dải 10 nồng độ BA khác nhau (từ 1 mg/l đến 10 mg/l) cho thấy sự biến thiên về khả năng tạo cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Các hình thái chồi ở từng mức nồng độ BA được ghi nhận chi tiết, phản ánh liều lượng cytokinin thích hợp cho quá trình nhân chồi.
• Tái sinh rễ từ chồi in vitro (Bảng 7, Bảng 10, Hình 20 đến Hình 25): Đánh giá phản ứng tạo rễ bất định của chồi trên môi trường MS không bổ sung chất kích thích sinh trưởng (nghiệm thức đối chứng) so với các nghiệm thức bổ sung NAA ở các mức 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l và 5 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy.
• Kết quả giải phẫu so sánh mô học (Hình 26 đến Hình 33): So sánh hình thái vi phẫu cắt dọc đỉnh sinh trưởng, cắt ngang thân, lá và rễ giữa cây sầu riêng ngoài tự nhiên 3 tháng tuổi và cây in vitro 10 tuần tuổi. Kết quả làm rõ mức độ phát triển của mô cơ bản, mô dẫn, tầng phát sinh và sự sai khác về cấu trúc giải phẫu do ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy vô trùng nhân tạo.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm định lượng rõ ràng:

• Xác lập được các thông số khử trùng ban đầu bằng $\text{HgCl}_2$ phù hợp cho từng loại mẫu cấy cây sầu riêng, giúp hạn chế tỷ lệ hoại tử mô và nhiễm vi sinh vật.
• Xác định được phản ứng phát sinh hình thái của các loại mô cấy khác nhau (đốt thân, phôi 1 tháng, phôi 2 tháng, phôi trưởng thành) dưới tác động của chất kích thích sinh trưởng BA. Dữ liệu thực nghiệm xác định phôi hạt hữu tính trưởng thành là nguồn mẫu cấy đáp ứng tốt quá trình nhân cụm chồi khi được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA (khảo sát chi tiết dải nồng độ từ 1 mg/l đến 10 mg/l sau 4 tuần).
• Xác lập được dải nồng độ chất kích thích ra rễ NAA (từ 1 mg/l đến 5 mg/l) trên môi trường MS đối với chồi sầu riêng in vitro sau 4 tuần nuôi cấy.
• Cung cấp dữ liệu vi phẫu đối sánh giữa cây tự nhiên 3 tháng tuổi và cây in vitro 10 tuần tuổi trên 4 cơ quan chủ yếu (đỉnh sinh trưởng, thân, lá, rễ), làm rõ sự biến đổi cấu trúc mô học trong điều kiện in vitro.

Về mặt đóng góp khoa học, đây là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam thực hiện nuôi cấy mô in vitro trên đối tượng sầu riêng (Durio zibethinus Murray). Đề tài đóng góp dẫn liệu sinh học thực nghiệm quan trọng, làm cơ sở khoa học cho việc hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính và phục vụ các định hướng chọn tạo giống mới bằng công nghệ tế bào thực vật.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số hạn chế gắn liền với phạm vi triển khai thực nghiệm:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa triển khai giai đoạn thuần dưỡng cây con ra điều kiện vườn ươm (ex vitro) để đánh giá tỷ lệ sống sót ngoài tự nhiên.
• Thời gian theo dõi sinh trưởng của cây in vitro phục vụ giải phẫu cấu trúc mô học mới đạt mốc 10 tuần tuổi, chưa khảo sát được các giai đoạn sinh trưởng dài hơn.
• Nguồn mẫu cấy đốt thân thu từ tự nhiên thường gặp khó khăn về kiểm soát nội nhiễm và phản ứng tái sinh chậm hơn so với phôi hữu tính.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tiếp tục tối ưu hóa quy trình ra rễ hoàn chỉnh và xây dựng quy trình thuần dưỡng cây con sầu riêng in vitro thích nghi với giá thể và điều kiện nhà lưới.
• Thử nghiệm kết hợp các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng khác để nâng cao hệ số nhân chồi và chất lượng cây con.
• Ứng dụng quy trình nuôi cấy mô phôi hạt để nghiên cứu tạo biến dị soma, đa bội thể hoặc phục vụ kỹ thuật chuyển gen trên cây sầu riêng.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Sinh lý - Sinh hóa thực vật đang thực hiện các đề tài về nhân giống vô tính cây ăn trái thân gỗ nhiệt đới.
• Các nhà nghiên cứu quan tâm đến dữ liệu giải phẫu đối sánh hình thái - mô học (đỉnh sinh trưởng, thân, lá, rễ) giữa cây in vitro và cây tự nhiên.
• Bộ phận nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các trung tâm giống cây trồng, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật cần tài liệu tham khảo về ngưỡng nồng độ khử trùng $\text{HgCl}_2$, chất điều hòa sinh trưởng BA (1-10 mg/l) và NAA (1-5 mg/l) trên đối tượng sầu riêng.

Câu hỏi thường gặp

1. Vị trí phân loại học của cây sầu riêng được đề tài xác định như thế nào? Trong đề tài, cây sầu riêng có tên khoa học là Durio zibethinus Murray, thuộc chi Durio, họ Malvaceae, bộ Malvales, phân lớp Magnoliidae, lớp Magnoliosida, ngành Magnoliophyta và giới Plantae.

2. Tác giả đã khảo sát khả năng tái sinh chồi sầu riêng từ những loại mẫu cấy nào? Tác giả đã tiến hành thử nghiệm tạo chồi từ 4 nguồn mẫu cấy khác nhau: đốt thân, phôi hạt hữu tính 1 tháng tuổi, phôi hạt hữu tính 2 tháng tuổi và phôi hạt hữu tính trưởng thành.

3. Dải nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA được bố trí trong nghiên cứu là bao nhiêu? Trong các thí nghiệm kích thích phát sinh cụm chồi từ phôi hạt trưởng thành, chất BA được khảo sát ở 10 mức nồng độ từ 1 mg/l đến 10 mg/l (sau 4 tuần nuôi cấy). Đối với thí nghiệm kích thích ra rễ từ chồi, chất NAA được khảo sát ở 5 mức nồng độ từ 1 mg/l đến 5 mg/l (theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy) trên nền môi trường MS cơ bản.

4. Nghiên cứu thực hiện giải phẫu so sánh giữa các mẫu cây ở những độ tuổi nào và trên các bộ phận nào? Nghiên cứu tiến hành giải phẫu so sánh giữa cây sầu riêng ngoài tự nhiên 3 tháng tuổi và cây sầu riêng nuôi cấy in vitro 10 tuần tuổi trên 4 bộ phận: đỉnh sinh trưởng (cắt dọc), thân (cắt ngang), lá (cắt ngang) và rễ (cắt ngang).

5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sầu riêng tại Việt Nam ở thời điểm thực hiện đề tài được ghi nhận ra sao? Theo tổng quan tài liệu của tác giả, trước khi đề tài này được thực hiện, tại Việt Nam chưa có bất kỳ công trình nghiên cứu nào được công bố về kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro trên cây sầu riêng.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây sầu riêng (Durio zibethinus)" của sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở TP.HCM đã thiết lập các bước thực nghiệm quan trọng về khử trùng mẫu cấy bằng $\text{HgCl}_2$, nhân cụm chồi từ phôi hạt hữu tính với BA và kích thích tạo rễ bằng NAA trên nền môi trường MS. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu giải phẫu mô học chi tiết giữa cây sầu riêng in vitro 10 tuần tuổi và cây tự nhiên 3 tháng tuổi, làm rõ sự biến đổi cấu trúc tế bào dưới tác động của môi trường nuôi cấy vô trùng. Đây là tài liệu khoa học nền tảng, có giá trị tham khảo chuyên môn cao cho các nghiên cứu tiếp theo về vi nhân giống và ứng dụng công nghệ sinh học trên cây ăn quả thân gỗ nhiệt đới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LOI CAM ON Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn ban Giám Hiệu, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em được học tập và rèn luyện trong môi trường tốt nhất. Em xin chân thành gửi cảm ơn tất cả các quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cần thiết trong suốt thời gian học đại học. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Trần Đông Phương đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trên suốt quá trình thực hiện dé tai. Chân thành cảm ơn các thành viên trong phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Cuối cùng, con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình. Cảm ơn những tình cảm mà ba mẹ và anh chị dành cho con, sự ủng hộ và động viên của gia đình giúp con vững bước hơn trên con đường học tập và đường đời. CÁC CHU VIET TAT MS : Murashige & Skoog BA : N°— benzyladenin NAA : 1-Naphthaleneacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng I: Thành phần của Sầu riêng (tính cho 100 gram thịt quả tươi) [10]. 6 Bảng 2: Nồng độ HgCl; và thời gian khử mẫu ở các nghiệm thức.

17 Bảng 3: Ảnh hưởng của BA trong quá trình tạo cụm chồi từ đốt thân. 18 Bảng 4: Ảnh hưởng của BA trong quá trình tạo cụm chỗi từ phôi hữu tính hạt Sầu riêng 1 tháng tuÔi.---s-csecse+vssetvsseEvseErvseErxstrrserrstrrsetrrssrrsssrrsssrrsssrrssrrsee 19 Bảng 5: Ảnh hưởng của BA trong quá trình tạo cụm chỗi từ phôi hữu tính hạt Sầu Ting 2 thang i00. 20 Bảng 6: Ảnh hưởng của BA trong quá trình tạo cụm chỗi từ phôi hữu tính hạt Sầu riêng trưởng thành Bảng 7: Ảnh hưởng của NAA trong quá trình tạo rễ từ chồi.----s- 22 Bang 8: Két qua khtr mau sau 7 ngay theo dOi .sssscsssscsssessssessnecsssssssessssessseesees 24 Bảng 9: Kết quả tạo cụm chồi từ phôi hạt hữu tính trưởng thành ¡ vizro trong môi trường MS bổ sung BA (4 tuần tuổi).--s--csecssecvseereseerxseersserrsssrrsssrrsrrsee 29 Bảng 10: Kết quả tạo rễ từ chồi Sầu riêng i viro trong môi trường MS bồ sung BA (4 tudnn tudi) .cescsssssosecsssecssssssnscssnscsssecsnsecsnscssncssuecsssecssscsenscssnecsssecsssesssscssseessneesseeess 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Cây sầu riêng.---cs-esccssv+vse+rxseErxseErkstrrsstrrssrrrserrssrrrsssrrsssrrssee 4 Hình 2: Công thức cầu tạo của auXÍN.---s--cseccesecveservsserxseersserrsssrrsssrrssse 9 Hình 3: Công thức cấu tạo của cytOkinin.-------secccssccesecveserrssersserrssersee 10 Hình 4: Đốt thân sau khử mẫu được cây trên môi trường MS.5: Dét thân sau khi cấy 4 tuần trên môi trường MS có bổ sung BA. 26 Hình 6: Phôi hạt hữu tính 1 tháng tuổi trên môi trường MS có bồ sung BA.

27 Hình 7: Phôi hạt hữu tính 2 tháng tuổi trên môi trường MS có bồ sung BA. 27 Hình 8: Phôi hạt hữu tính trưởng thành .--s << << =5 « se sssesesesesesessee 28 Hình 9: Chồi trên môi trường MS sau 4 tuần nuôi cấy.-------s«c-ssccsss 30 Hình 11: Chồi trên môi trường MS + BA 2 mg/1 sau 4 tuần nuôi cấy. 30 Hình 10: Chồi trên môi trường MS + BA 1 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy. 30 Hình 12: Chồi trên môi trường MS + BA 3 mg/1 sau 4 tuần nuôi cấy.

30 Hình 13: Chồi trên môi trường MS + BA 4 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy. 31 Hình 15: Chồi trên môi trường MS + BA 6 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy. 31 Hình 14: Chồi trên môi trường MS + BA 5 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy. 31 Hình 16: Chồi trên môi trường MS + BA 7 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy.

31 Hình 17: Chồi trên môi trường MS + BA 8 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy. 32 Hình 18: Hình 19: Hình 20: Hinh 21: Hinh 22 Hinh 23: Hinh 24: Hinh 25: Hinh 26: Hinh 27: Hinh 28: Hinh 29: Hinh 30: Hinh 31: Hinh 32: Hinh 33 Chồi trén méi truong MS + BA 9 mg/l sau 4 tuần nuôi cây. 32 Chồi trên môi trường MS + BA 10 mg/1 sau 4 tuần nuôi cấy. 32 Chồi trên môi trường MS.---s-s©ss+essszvseersserrsserrsssrrsssr 34 Chồi trên môi trường MS + NAA 1 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy.

34 : Chỗi trên môi trường MS + NAA 2 mg/1 sau 4 tuần nuôi cấy. 35 Chồi trên môi trường MS + NAA 3 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy. 35 Chồi trên môi trường MS + NAA 4 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy. 35 Chồi trên môi trường MS + NAA 5 mg/I sau 4 tuần nuôi cấy.

35 Đỉnh sinh trưởng cây Sầu riêng ngoài tự nhiên 3 thang tudi cat doc. 36 Dinh sinh trưởng cây Sầu riêng iw viro cắt dọc.----s-c-eeec-s 36 Thân cây sầu riêng ngoài tự nhiên 3 thang tudi cắt ngang. 36 Thân cây sầu riêng in vitro At ngang.----s«ccseccesecveserrssersssee 36 Lá cây Sầu riêng ngoài tự nhiên 3 tháng tuổi cắt ngang. 37 La cay Sau riéng in vitro cắt ngang .----eseccseccessereesrressrressrrsser 37 Rễ cây Sầu riêng ngoài tự nhiên 3 thang tudi cắt ngang.

37 : Rễ cây Sầu riêng in vitro cắt ngang.---esccesccceeecesseressersssrressrre 37 MỤC LỤC I. TÓNG QUAN TÀI LIIỆU. Giới thiệu cây Sầu riêng. Vi tri phân loại [16] 1.

Phân bố, sinh thái, sinh trưởng và phát triển [7]. Thành phần hóa học. Nghiên cứu trong va ngOải NƯỚC. Nuôi cấy mô thực vật.

Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật[ I ].------2- 22 +zz+xz+zxezzxzzrxe+ree 7 L3. Vai trò của nuôi cấy mô [3],. Vai trò của chất điều hoa sinh trưởng thực vật [12]. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô[ 12] .Vật liệu IL1.

Đối tượng nghiên cứu. Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Sầu riêng:. Điều kiện nuôi cấy .-2-©22-©2<+2E22EEE2EEEEEEEEEEEEEEEECEErerrrerrree 16 IL1. Hoá chất dùng trong nuôi cấy mô.Phương pháp nghiên CỨU.

--¿- - xStSEEE SE HH rưệt 17 IL2. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ HgCl; và thời gian khử mẫu. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chồi từ đốt thân. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cum chéi từ phôi hạt hữu tính 1 tháng tuổi.

_ Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chồi từ phôi hạt hữu tính 2 tháng tuổi. _ Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chồi từ phôi hạt hữu trưởng thành. _ Thí nghiệm 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của NAA đến khả năng phát sinh rễ cua chéi cây Sầu riêng. Giải phẫu rễ, thân, lá, đỉnh sinh trưởng cây Sầu riêng 3 tháng tuổi ngoài tu nhién va cay Sau riéng in vitro 10 tuần tuổi.2-25222cccccxcerxererrererxee 22 Quy trình giải phẫu:.Xử lý số liệu.KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN.--<s<cs<©ssecssecsserseerseersesrssersee 24 IILI.

_ Thí nghiệm I: Khảo sát nồng độ HgCl; và thời gian khử mẫu. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chỗi từ đốt thân. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chỗi từ phôi hạt hữu tính I tháng tuổi.--2-©22+©22+E+EE+EEESEE2EErExrrrxrrrree 26 IIL4. _ Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chỗi từ phôi hạt hữu tính 2 tháng tuồi.--2- 22+ 22+2E2+EE+EEESEE2EErrxrrrxrrrree 27 IIL5.

Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh cụm chồi từ phôi hạt hữu trưởng thành. _ Thí nghiệm 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của NAA đến khả năng phát sinh rễ của chỗồi cây Sầu riêngg. _ Giải phẫu rễ, thân, lá, đỉnh sinh trưởng cay Sau riêng 3 tháng tuổi ngoài tự nhiên và cây Sầu riêng ¿z wi#ro 10 tuần tuổi.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ,.2--2EEEEE22E122112211221127122121111 1E ee 38 DAT VAN DE > Trái cây là một loại thực phẩm thiết yếu trong cuộc sống con người. Do hiệu quả kinh tế cao, những năm gần đây nhiều nhà vườn đã cải tạo vườn tạp, chuyền đổi cơ cấu cây trồng cũ hiệu quả thấp sang trồng chuyên canh cây ăn trái.

Sầu riêng (Durio zibethinus Murray) là một loại trái cây rất được ưa chuộng và có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta, Sầu riêng là loại trái cây dễ tiêu thụ, giá bán cao hơn hắn nhiều loại trái cây khác nên diện tích trồng ngày một gia tăng. > Cây Sầu riêng thuộc họ Malvaceae, có nguồn gốc từ Malaysia. Sau đó được phát triển sang một số nước trong vùng nhiệt đới như: Indonesia, Thái Lan, Philippines, Hawail, Brunei, Mianma, Việt Nam, Lào, Campuchia.

Ngoài ra, còn được trồng ở một số nước nhiệt đới khác ở Trung Nam Mỹ, một số nước châu Phi và châu Úc. Sầu riêng du nhập vào nước ta từ Thái Lan và trồng đầu tiên ở Tân Quy (Biên Hòa). Hiện nay, Sầu riêng được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam như Bến Tre, Tiền Giang, Bình Dương, Đồng Nai. Một số nơi của các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên như Đắklắk, Lâm Đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên — Huế.

cũng trồng được Sầu riêng nhưng trái ít mùi thơm{ 10]. > Sầu riêng có mùi vị rất hấp dẫn, hàm lượng các chất dinh dưỡng cao như: lipid, protein, acid amin, calcium va các chất thơm như: thiols esters, hydrogen sufide, diethyl sunfide nên được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Không những thế các bộ phận của cây như: vỏ, hạt, quả cũng làm nguyên liệu cho ngành dược liệu, thân cây dùng làm vật liệu gỗ[ 10]. > Sầu riêng có thể nhân giống bằng cả hai phương pháp là hữu tính (bằng hạt) và nhân vô tính (chiết, ghép).

Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Nhân giống hữu tính (bằng hạt) đơn giản, ít tốn kém, hệ số nhân giống thấp. Cây có bộ rễ khỏe nhưng cây rất lâu cho trái, cây con khó giữ được đặc tính của cây mẹ, các cây trong vườn không đồng đều. Nhân giống vô tính (chiết, ghép) có ưu điểm giữ được những đặc tính tốt của cây mẹ, cho trái nhanh nhưng đòi hỏi nông dân phải có kinh nghiệm nhân giống, tiềm ẩn nguy cơ nhiễm bệnh qua mắt ghép, chiết.

Hệ số nhân giống của hai phương pháp thủ công trên không cao, cây con không đồng đều nên cần phải có giải pháp tạo ra nguồn cây giống lớn và đồng đều để cung cấp cho sản xuất, phương pháp nuôi cấy mô có thê giải quyết được vẫn đề này. Phương pháp nuôi cấy mô cũng là công cụ hữu hiệu cho công nghệ chuyên gen, tạo đột biến ở thực vật nhằm tạo biến dị phục vụ quá trình chọn tạo giống. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nuôi cấy ¿z iro cây Sầu riêng (Durio zibethinus Murray)” nhằm phục vụ cho quá trình chon lọc tạo giống mới. TONG QUAN TAI LIEU LI.

Giới thiệu cây Sầu riêng 1. Họ Malvaceae[9] Phần lớn các loài là cây thân thảo hay cây bụi, nhưng một số loài là cây gỗ hay dây leo. Lá nói chung mọc so le, thường có thùy hình lông chim hay lá kép và có gân lá hình lông chim.